一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的制备方法
阅读说明：本技术 一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的制备方法 (Preparation method of uridine diphosphate glucuronic acid ) 是由 何丽丽 窦文芳 吕海超 于 2020-12-30 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的制备方法。本发明利用尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶氧化尿苷二磷酸葡萄糖生成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸,同时加入乳酸脱氢酶进行双酶偶联反应,实现NAD～+的循环再生,减少NAD～+的添加,节约了成本,与此同时NAD～+/NADH的循环减少副产物NADH对产物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的反馈抑制作用,目标产物的生成量可达到1.01mg/mL。本发明对乳酸脱氢酶的核苷酸序列进行优化改造,使得目的蛋白能更好的在大肠杆菌中表达,有利于高效合成目标产物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸。本发明采用体外反应,反应体系更加可控,相比胞内反应,体外反应可在限定条件下更利于反应的进行。(The invention relates to a preparation method of uridine diphosphate glucuronate. The invention utilizes uridine diphosphate glucose dehydrogenase to oxidize uridine diphosphate glucose to generate uridine diphosphate glucuronic acid, and simultaneously adds lactate dehydrogenase to carry out a double-enzyme coupling reaction to realize NAD + Cyclic regeneration of, reducing NAD + While at the same time NAD saves cost + The feedback inhibition effect of the byproduct NADH on the product uridine diphosphate glucuronic acid is reduced by the circulation of NADH, and the generation amount of the target product can reach 1.01 mg/mL. The invention optimizes and reforms the nucleotide sequence of the lactate dehydrogenase, leads the target protein to be better expressed in escherichia coli, and is beneficial to efficiently synthesizing the target productUridine diphosphate glucuronate. The invention adopts in vitro reaction, the reaction system is more controllable, and compared with intracellular reaction, the in vitro reaction can be more beneficial to the reaction under the limited condition.)
技术领域
本发明涉及酶催化技术领域，尤其涉及一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的制备方法。
背景技术
核苷酸糖类作为自然界中单糖活化的高能形式，常见的有尿苷二磷酸糖(UDP-糖)、胸腺苷二磷酸糖(TDP-糖)、鸟苷二磷酸糖(GTP-糖)等。尤以尿苷二磷酸化糖类应用最为广泛，其中UDP-葡萄糖是其他UDP-单糖形成的起始底物，而UDP-葡萄糖醛酸是UDP-单糖由六碳糖变为五碳糖的关键底物。
由UDP-葡萄糖脱氢而得到的衍生物UDP-葡萄糖醛酸是细胞内重要的糖基供体，参与生物的多条代谢途径。在微生物细胞中，UDP-葡萄糖醛酸是荚膜多糖的关键合成底物，而荚膜多糖的合成直接影响了致病微生物的致病性质。在植物细胞中，UDP-葡萄糖醛酸作为核苷酸的前体，在果胶和半纤维素聚合物的生物合成中有重要意义，和细胞壁的生物合成密不可分。在动物细胞中，UDP-葡萄糖醛酸在粘多糖、透明质酸和肝素等代谢产物的合成中同样具有不可或缺的作用，同时也参与部分代谢产物的糖基化。
因为其目前合成难度大，价格昂贵，探索高效合成UDP-葡萄糖醛酸的方法已成为研究热点。目前UDP-葡萄糖醛酸的方法主要包括化学法和生物法。化学法往往合成时间长、合成效率低、同时成本昂贵、立体选择性差，不利于工业发展，而酶法反应条件温和、选择性强、能耗少、工艺环境友好，这是化学合成无法比拟的。齐晨对大肠杆菌源的UGD进行重组表达及优化，体系中加入UGPase和UGD，两步偶联催化反应合成UDP-葡萄糖醛酸，UGPase酶以UTP为底物催化合成UDP-葡萄糖，UGD以UDP-葡萄糖为底物催化合成UDP-葡萄糖醛酸，发现底物转化率并不理想。纪小虎以新鲜牛肝脏为原料，采用分歩盐析-热变性法制备UGD粗品，利用市售的兔肌乳酸脱氢酶一锅酶法合成UDP-葡萄糖醛酸，虽然较前者在产量及副产物方面表现出更好的优势，但采用市售的兔肌乳酸脱氢酶，原料成本较高，且需要从新鲜牛肝脏里提取UGD粗酶液，制备工艺较为复杂。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的制备方法，本发明采用脓性链球菌源的UGD酶作为催化剂，与猪源的LDH酶进行偶联，双酶偶联催化UDP-葡萄糖氧化生成UDP-葡萄糖醛酸，是种简单高效的生物催化方法。
本发明的第一个目的是提供了一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的制备方法，包括：尿苷二磷酸葡萄糖与NAD+在尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶和乳酸脱氢酶双酶偶联的作用下发生体外催化反应得到尿苷二磷酸葡萄糖醛酸。
进一步地，所述的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述的乳酸脱氢酶的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，乳酸脱氢酶的核苷酸序列在SEQ ID NO.4所示的序列上，经过密码子优化，得到SEQ ID NO.5所示的序列，将序列中原核生物利用率低及无法表达的密码子改为大肠杆菌利用率较高的密码子序列，来使目的蛋白能更好的在大肠杆菌系统中表达。
进一步地，所述的尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶的添加量不低于200mg/L。
进一步地，所述的乳酸脱氢酶的添加量不低于80mg/L。
进一步地，催化反应的体系中还包括Tris缓冲液、NAD+、β-巯基乙醇和丙酮酸钠。
进一步地，所述的Tris缓冲液pH7～11。
进一步地，所述的NAD+浓度为1.0mM～3.0mM。
进一步地，所述的β-巯基乙醇为1μL/mL，丙酮酸钠的浓度为50mM～300mM。
进一步地，催化反应的反应温度为15～35℃，反应时间为6～18h。
借由上述方案，本发明至少具有以下优点：
本发明利用尿苷二磷酸葡萄糖脱氢酶氧化尿苷二磷酸葡萄糖生成尿苷二磷酸葡萄糖醛酸，同时加入乳酸脱氢酶进行双酶偶联反应，实现NAD+的循环再生，减少NAD+的添加，节约了成本，与此同时NAD+/NADH的循环减少副产物NADH对产物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的反馈抑制作用，目标产物的生成量可达到1.01mg/mL。本发明对乳酸脱氢酶的核苷酸序列进行优化改造，使得目的蛋白能更好的在大肠杆菌中表达，有利于高效合成目标产物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸。本发明采用体外反应，反应体系更加可控，相比胞内反应，体外反应可在限定条件下更利于反应的进行。
上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段，并可依照说明书的内容予以实施，以下以本发明的较佳实施例并配合详细附图说明如后。
附图说明
图1为利用固定化酶生成尿苷二磷酸葡萄糖的液相图谱；
图2为UDP-葡萄糖的液相图谱；
图3为NAD+的液相图谱；
图4为NADH的液相图谱；
图5为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸标品的液相图谱；
图6为尿苷二磷酸葡萄糖与NAD+单酶反应液的液相图谱；
图7为尿苷二磷酸葡萄糖与NAD+双酶偶联反应液的液相图谱；
图8为尿苷二磷酸葡萄糖醛酸标品的质谱图；
图9为反应产物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的质谱图；
图10为反应产物尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的核磁氢谱图；
图11为无乳酸脱氢酶催化尿苷二磷酸葡萄糖与NAD+反应液的液相图谱；
图12为无β-巯基乙醇催化尿苷二磷酸葡萄糖与NAD+反应液的液相图谱。
具体实施方式
下面结合实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
实施例1：UDP-葡萄糖的制备
称取50g阴离子交换树脂于250mL烧杯中，加入50mL 10％异丙醇浸泡20min，抽滤，10％异丙醇淋洗，去离子水淋洗，抽滤，0.5M HCl淋洗，抽滤，45mL 0.5M HCl重悬，浸泡2h，抽滤，去离子水淋洗干净，45mL CoCl2水溶液搅拌过夜。50mM pH7.5磷酸缓冲液淋洗干净以备用。配置20mM Tris缓冲液，调pH至7.0，酶液体积与缓冲液体积按照1:4混匀，取已纯化蛋白GlmU酶194mg、PPA酶3mg置于三角瓶中，分别加入已处理好的树脂21.5g、0.15g，放入摇床，转速120rpm，温度25℃，时间1h。抽滤，50mM pH7.5磷酸缓冲液淋洗干净，放置于4℃以备用。
分别称取2.16g葡萄糖、3.05g ATP置于三角瓶中，依次加入25mL 1M Tris缓冲液、0.5mL 1M MgCl2溶液，混合后使其溶解，调pH至7.5，加入20mL 3.9g/L NahK酶，30℃、100rpm反应过夜。
依次加入2.1g UTP、42μL DTT、0.28mL 1M MgCl2到上述反应液中，混合后，加入已处理好的固定化GlmU酶和PPA酶，30℃、180rpm反应过夜。取100μL反应液过0.22μm孔径的水系滤膜，进行高效液相色谱分析，即可检测出UDP-葡萄糖(如图1所示)。
实施例2：单酶催化UDP-葡萄糖氧化生成UDP-葡萄糖醛酸
分别将2.0mL 10mM UDPG、2.5m 10mM NAD、100μL 1M Tris、10μLβ-巯基乙醇、20μL1M MgCl2、3.37mL去离子水混匀，然后加入2.5mL 1.0mg/mL UGD酶液，在其最适温度下25℃反应过夜；取100μL反应液过0.22μm孔径的水系滤膜，进行高效液相色谱分析(如图6所示)，并且将反应底物UDP-葡萄糖、NAD+及产物NADH、UDP-葡萄糖醛酸标品进行高效液相分析(如图2、3、4、5所示)，图6显示，初步断定有新物质NADH及UDP-葡萄糖醛酸的生成，经计算，UDP-葡萄糖醛酸的生成量约为0.51mg/mL。
实施例3：双酶偶联催化UDP-葡萄糖氧化生成UDP-葡萄糖醛酸
分别将2.4mL 10mM UDPG、1.5mL 10mM NAD、100μL 1M Tris、10μLβ-巯基乙醇、20μL 1M MgCl2、1mL 1M丙酮酸钠、1.97mL去离子水混匀，然后依次加入2.5mL 1.0mg/mL UGD酶液、0.5mL 2.7mg/mL LDH酶液，在其最适温度下25℃反应过夜；取100μL反应液过0.22μm孔径的水系滤膜，进行高效液相色谱分析，可检测到UDP-葡萄糖醛酸生成，产量约为1.01mg/mL，产量提高了将近一倍(如图7所示)。
分别对UDP-葡萄糖醛酸标品及反应产物UDP-葡萄糖醛酸做质谱检测，采用WATERSMALDI SYNAPT MS进行LC-MS分析，如图8、9所示，样品检测结果与UDP-葡萄糖醛酸标品检测结果一致，因为检测采用的是负离子源，所以显示的分子量为579.0，实际分子量为580.0。
为了进一步确定UDP-葡萄糖醛酸的结构，将纯化冻干的产物用氘代重水溶解，进一步做1H NMR检测，1H NMR谱采用Bruker AvanceⅢ400MHZ核磁共振仪测定(TMS为内标)，结果如图10所示，1H NMR(400MHz,Deuterium Oxide)δ7.97(d,J＝8.2Hz,1H),6.00(s,1H),5.63(dd,J＝7.6,3.5Hz,1H),4.38(t,J＝4.2Hz,2H),4.30(p,J＝2.7Hz,1H),4.23(dd,J＝4.5,2.4Hz,1H),4.20(dd,J＝5.5,2.8Hz,1H),4.15(d,J＝10.2Hz,1H),3.79(t,J＝9.5Hz,1H),3.74(s,1H),3.58(dt,J＝9.8,3.1Hz,1H),3.54–3.47(m,1H)。
对比例1：
按照实施例3制备UDP-葡萄糖醛酸，唯一不同的是体系中不加乳酸脱氢酶。取100μL反应液过0.22μm孔径的水系滤膜，进行高效液相色谱分析，结果如图11所示。根据产物峰面积换算，不加乳酸脱氢酶的情况下，产量约0.52mg/mL。发现加入乳酸脱氢酶后，UDP-葡萄糖醛酸的产量有明显的提升，提高约1倍，说明乳酸脱氢酶能够减少高能产物NADH对产物的反馈抑制作用，从而更有利于反应向正方向进行。
对比例2：
按照实施例3制备UDP-葡萄糖醛酸，唯一不同的是体系中不加β-巯基乙醇。取100μL反应液过0.22μm孔径的水系滤膜，进行高效液相色谱分析，结果如图12所示。根据产物峰面积换算，不加β-巯基乙醇的情况下，产量约0.22mg/mL。说明β-巯基乙醇这种抗氧化剂能够对底物起到一定的保护作用。
以上仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和变型，这些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 江南大学
<120> 一种尿苷二磷酸葡萄糖醛酸的制备方法
<160> 5
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 402
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 1
Met Lys Ile Ala Val Ala Gly Ser Gly Tyr Val Gly Leu Ser Leu Gly
1 5 10 15
Val Leu Leu Ser Leu Gln Asn Glu Val Thr Ile Val Asp Ile Leu Pro
20 25 30
Ser Lys Val Asp Lys Ile Asn Asn Gly Leu Ser Pro Ile Gln Asp Glu
35 40 45
Tyr Ile Glu Tyr Tyr Leu Lys Ser Lys Gln Leu Ser Ile Lys Ala Thr
50 55 60
Leu Asp Ser Lys Ala Ala Tyr Lys Glu Ala Glu Leu Val Ile Ile Ala
65 70 75 80
Thr Pro Thr Asn Tyr Asn Ser Arg Ile Asn Tyr Phe Asp Thr Gln His
85 90 95
Val Glu Thr Val Ile Lys Glu Val Leu Ser Val Asn Ser His Ala Thr
100 105 110
Leu Ile Ile Lys Ser Thr Ile Pro Ile Gly Phe Ile Thr Glu Met Arg
115 120 125
Gln Lys Phe Gln Thr Asp Arg Ile Ile Phe Ser Pro Glu Phe Leu Arg
130 135 140
Glu Ser Lys Ala Leu Tyr Asp Asn Leu Tyr Pro Ser Arg Ile Ile Val
145 150 155 160
Ser Cys Glu Glu Asn Asp Ser Pro Lys Val Lys Ala Asp Ala Glu Lys
165 170 175
Phe Ala Leu Leu Leu Lys Ser Ala Ala Lys Lys Asn Asn Val Pro Val
180 185 190
Leu Ile Met Gly Ala Ser Glu Ala Glu Ala Val Lys Leu Phe Ala Asn
195 200 205
Thr Tyr Leu Ala Leu Arg Val Ala Tyr Phe Asn Glu Leu Asp Thr Tyr
210 215 220
Ala Glu Ser Arg Lys Leu Asn Ser His Met Ile Ile Gln Gly Ile Ser
225 230 235 240
Tyr Asp Asp Arg Ile Gly Met His Tyr Asn Asn Pro Ser Phe Gly Tyr
245 250 255
Gly Gly Tyr Cys Leu Pro Lys Asp Thr Lys Gln Leu Leu Ala Asn Tyr
260 265 270
Asn Asn Ile Pro Gln Thr Leu Ile Glu Ala Ile Val Ser Ser Asn Asn
275 280 285
Val Arg Lys Ser Tyr Ile Ala Lys Gln Ile Ile Asn Val Leu Glu Glu
290 295 300
Arg Glu Ser Pro Val Lys Val Val Gly Val Tyr Arg Leu Ile Met Lys
305 310 315 320
Ser Asn Ser Asp Asn Phe Arg Glu Ser Ala Ile Lys Asp Val Ile Asp
325 330 335
Ile Leu Lys Ser Lys Asp Ile Lys Ile Ile Ile Tyr Glu Pro Met Leu
340 345 350
Asn Lys Leu Glu Ser Glu Asp Gln Ser Val Leu Val Asn Asp Leu Glu
355 360 365
Asn Phe Lys Lys Gln Ala Asn Ile Ile Val Thr Asn Arg Tyr Asp Asn
370 375 380
Glu Leu Gln Asp Val Lys Asn Lys Val Tyr Ser Arg Asp Ile Phe Asn
385 390 395 400
Arg Asp
<210> 2
<211> 334
<212> PRT
<213> （人工序列）
<400> 2
Met Ala Thr Leu Lys Glu Lys Leu Ile Ala Pro Val Ala Glu Glu Glu
1 5 10 15
Thr Thr Ile Pro Asn Asn Lys Ile Thr Val Val Gly Val Gly Gln Val
20 25 30
Gly Met Ala Cys Ala Ile Ser Ile Leu Gly Lys Ser Leu Thr Asp Glu
35 40 45
Leu Ala Leu Val Asp Val Leu Glu Asp Lys Leu Lys Gly Glu Met Met
50 55 60
Asp Leu Gln His Gly Ser Leu Phe Leu Gln Thr Pro Lys Ile Val Ala
65 70 75 80
Asp Lys Asp Tyr Ser Val Thr Ala Asn Ser Lys Ile Val Val Val Thr
85 90 95
Ala Gly Val Arg Gln Gln Glu Gly Glu Ser Arg Leu Asn Leu Val Gln
100 105 110
Arg Asn Val Asn Val Phe Lys Phe Ile Ile Pro Gln Ile Val Lys Tyr
115 120 125
Ser Pro Asp Cys Ile Ile Ile Val Val Ser Asn Pro Val Asp Ile Leu
130 135 140
Thr Tyr Val Thr Trp Lys Leu Ser Gly Leu Pro Lys His Arg Val Ile
145 150 155 160
Gly Ser Gly Cys Asn Leu Asp Ser Ala Arg Phe Arg Tyr Leu Met Ala
165 170 175
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180 185 190
Glu His Gly Asp Ser Ser Val Ala Val Trp Ser Gly Val Asn Val Ala
195 200 205
Gly Val Ser Leu Gln Glu Leu Asn Pro Glu Met Gly Thr Asp Asn Asp
210 215 220
Ser Glu Asn Trp Lys Glu Val His Lys Met Val Val Glu Ser Ala Tyr
225 230 235 240
Glu Val Ile Lys Leu Lys Gly Tyr Thr Asn Trp Ala Ile Gly Leu Ser
245 250 255
Val Ala Asp Leu Ile Glu Ser Met Leu Lys Asn Leu Ser Arg Ile His
260 265 270
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275 280 285
Phe Leu Ser Leu Pro Cys Val Leu Asn Ala Arg Gly Leu Thr Ser Val
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<210> 3
<211> 1206
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 3
atgaaaatag cagttgctgg atcaggatat gttggattat cactaggagt tcttttatca 60
cttcaaaacg aagtcactat tgttgatatt cttccctcta aagttgataa gattaataat 120
ggcttatcac caattcaaga tgaatatatt gaatattact taaaaagtaa gcaattatct 180
attaaagcaa ctttagatag caaagcagct tataaagaag cggaactggt cattattgcc 240
acacctacaa attacaacag tagaattaat tattttgata cacagcatgt tgaaacagtt 300
atcaaagagg tactaagcgt taatagccat gcaactctta tcatcaaatc aacaattcca 360
ataggtttca ttactgaaat gagacagaaa ttccaaactg atcgtattat cttcagccct 420
gaatttttaa gagaatctaa agctttatat gacaacttat atccaagccg aattattgtt 480
tcttgtgaag aaaacgattc tccaaaagta aaggcagacg cagaaaaatt tgcactttta 540
ttaaagtctg cagctaaaaa aaataatgta ccagtactta ttatgggagc ttcagaagct 600
gaagcagtaa aactatttgc caatacttat ttagcgttaa gggtagctta ttttaatgag 660
ttagacactt acgcagaatc gagaaaatta aatagtcaca tgattattca aggaatttct 720
tatgatgatc gaataggaat gcattataat aacccatcat ttggttatgg aggttattgt 780
ctacctaaag atacgaagca attattggca aattacaata atattcctca aacgctaatt 840
gaagctatcg tttcatcaaa taatgtgcgc aagtcctata ttgctaagca aattatcaac 900
gtcttagaag agcgggagtc cccagtaaaa gtagtcgggg tttaccgttt aattatgaaa 960
agtaactcag ataattttag agaaagtgct atcaaagatg ttattgacat tcttaaaagt 1020
aaagacatta agataattat ttatgagcca atgttaaaca aacttgaatc tgaagatcaa 1080
tctgtacttg taaatgattt agagaatttc aagaaacaag caaatattat cgtaactaat 1140
cgctatgata atgaattaca agatgttaaa aataaagttt acagtagaga tatttttaat 1200
agagac 1206
<210> 4
<211> 1002
<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 4
atggcaactc ttaaggaaaa actgattgca ccagttgcag aagaagagac aacaatccca 60
aacaataaga tcactgtagt gggtgttgga caagtcggta tggcatgtgc catcagcatt 120
ctgggaaagt ctctgacgga tgagcttgct ctggtggatg ttttggaaga taaactcaaa 180
ggagaaatga tggatctgca gcacggaagc ttgttccttc agacacccaa aattgtggca 240
gataaagatt actctgtgac cgccaattcc aagattgtgg tggtgacggc aggcgttcgc 300
cagcaggagg gagagagtcg tctcaatctg gtgcagagga acgtcaatgt cttcaagttc 360
atcatccctc agattgtcaa gtacagtcct gactgcatca taattgtggt ttcgaaccca 420
gtggatattc tcacatatgt tacctggaaa ctaagtggat tacccaagca ccgtgtgatt 480
ggaagtggat gtaacctgga ttctgcaagg tttcgctatc ttatggctga aaagcttggc 540
gttcatccca gcagctgcca cgggtggatt ttgggagaac atggcgactc aagcgtggct 600
gtgtggagtg gggtgaatgt ggcaggtgtg tctctccagg aactgaatcc agagatggga 660
acggacaatg atagtgaaaa ttggaaagaa gtgcataaga tggtggttga aagtgcctac 720
gaagtcatca agctgaaagg ctacaccaac tgggcaattg gcttaagtgt ggcagatctt 780
attgaatcca tgttgaaaaa cctatccagg attcacccag tgtcaacaat ggtgcagggc 840
atgtatggca ttgagaatga ggtcttcctg agcctcccat gtgtcctgaa tgctcgcgga 900
ctaaccagtg ttatcaacca gaagctgaag gatgatgagg ttgcccagct caagaacagt 960
gctgacactc tgtggggcat ccagaaggac ctgaaggacc tg 1002
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<212> DNA
<213> （人工序列）
<400> 5
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gccgatacgc tgtggggcat ccaaaaagat ttgaaagatc tg 1002