高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物及其制备方法和应用 (Kidney bean extract with high alpha-amylase inhibition activity and preparation method and application thereof ) 是由 刘丽娅 佟立涛 周素梅 王丽丽 汪云吉 周闲容 于 2020-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的制备方法,包括依次进行的如下步骤：在pH2-4和温度30-70℃条件下,利用蛋白酶处理芸豆水溶液0.5-2h,之后回调pH并取上清液；将上清液处理得到粉末状的芸豆α-淀粉酶抑制剂提取物。本发明还公开了无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物。本发明还公开了酸性水解酶于无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的提取中的应用。本发明可以在保留α-淀粉酶抑制活力的同时去除凝集素活力,还具有一定的体外抗氧化能力,操作简单,经济价值高,易于工艺化生产,在满足普通消费者控制体重的同时,也可以满足糖尿病患者的辅助治疗需求。(The invention discloses a preparation method of a kidney bean extract with high alpha-amylase inhibition activity and no agglutination activity, which comprises the following steps in sequence: treating kidney bean water solution with protease at pH2-4 and temperature 30-70 deg.C for 0.5-2h, adjusting pH, and collecting supernatant; treating the supernatant to obtain a powdered kidney bean alpha-amylase inhibitor extract. The invention also discloses a kidney bean extract with high alpha-amylase inhibition activity and no agglutination activity. The invention also discloses application of the acid hydrolase in extraction of the kidney bean extract with high alpha-amylase inhibition activity and no agglutination activity. The invention can remove the activity of agglutinin while keeping the inhibition activity of alpha-amylase, has certain in vitro oxidation resistance, simple operation, high economic value and easy process production, and can meet the requirement of auxiliary treatment of patients with diabetes while meeting the requirement of controlling weight of common consumers.)
技术领域
本发明属于植物有效成分的制备技术领域，涉及一种无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的制备方法。
背景技术
芸豆，学名菜豆(Phaseolus vulgaris Linn.sp)，属豆科(Leguminosae)菜豆属(Phaseolus L.)，种植广泛，是世界上消费的主要豆类之一。我国芸豆常年栽培面积约800万亩，总产量约80～90万吨，主要分布在黑、内蒙古、冀、晋、甘、新、川、滇、黔等地。
芸豆中含有一种糖蛋白，α-淀粉酶抑制剂，是一种纯天然活性物质，属于糖苷水解酶抑制剂的一种，已被证实通过与酶形成酶-抑制剂复合物有效地抑制淀粉酶活性，阻碍碳水化合物水解与消化，减轻人的体重。纯化的芸豆提取物已显示出可降低人和实验动物的血糖水平的能力。此外，芸豆中富含天然抗氧化物质，如多酚与黄酮类化合物，这些活性物质具有抗炎，抗癌以及预防心血管疾病等作用。但是，芸豆中还含有凝集素，具有凝集人红细胞的能力，会破坏肠道上皮细胞的完整性，影响营养成分的消化吸收，甚至会诱导胰脏生长、造成肠道上皮细胞溃疡和坏死。所以食用未加工过的芸豆会导致食物中毒，在日常生活中，出于食用的目的，通常将芸豆煮熟以使凝集素变性。由于α-淀粉酶抑制剂与凝集素均为蛋白质，且α-淀粉酶抑制剂热稳定性低于凝集素，所以在对芸豆加热处理以去除凝集素活力的同时，α-淀粉酶抑制剂也会变性失去抑制活力。
2019年，全球约4.63亿20-79岁成人患糖尿病(11个人中有1个为糖尿病患者)。据估计，到2030年，糖尿病患者会达到5.784亿；预计到2045年，糖尿病患者会达到7.002亿。我国是糖尿病患者最多的国家，20-79岁糖尿病患者数量约为1.164亿，且患病趋势逐渐年轻化。因此有关预防和控制糖尿病的产品研究开发具有很高的社会价值与经济价值。
纯的芸豆α-淀粉酶抑制剂提取方法依赖色谱柱，工艺复杂，耗时久，经济价值不高，无法应对当今社会的迫切需求，相对而言，芸豆粗提物制备方法较简单，且具有抑制α-淀粉酶的效果，但提取物为混合物，其中含有对人体有害的凝集素，基于此，急需一种合适的方法，以使提取物在最大程度的保留α-淀粉酶抑制效果的同时降低凝集素的活力。
发明内容
本发明的一个目的是解决至少上述问题和/或缺陷，并提供至少后面将说明的优点。
本发明还有一个目的是提供无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的制备方法。
本发明另有一个目的是酸性水解酶于无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的提取中的应用。
本发明再有一个目的是提供无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物。
为此，本发明提供的技术方案为：
无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的制备方法，包括依次进行的如下步骤：
在pH2-4和温度30-70℃条件下，利用蛋白酶处理芸豆水溶液0.5-2h，之后回调pH并取上清液；
将所述上清液处理得到粉末状的芸豆α-淀粉酶抑制剂提取物。
优选的是，所述的无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的制备方法中，所述蛋白酶的量为1000-1500U/g样品。
优选的是，所述的无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的制备方法中，其特征在于，所述蛋白酶为酸性蛋白酶。
优选的是，所述的无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的制备方法中，获得所述芸豆水溶液的制备方法包括如下步骤：
步骤一、芸豆的预处理：取芸豆制成40-80目的芸豆粉，每100g芸豆粉用400-1000mL蒸馏水的量，将芸豆粉于室温下以200-300rpm的搅拌速度水提1-4h，过滤去残渣，得到滤液；
步骤二、将所得滤液室温静置，离心取上清液，即为所述芸豆水溶液。
优选的是，所述的无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的制备方法中，步骤二中，还包括如下处理：将所述上清液于压力40-50MPa下进行微波处理10-12min，其中，微波功率为80-100W，得到所述芸豆水溶液。
优选的是，所述的无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的制备方法中，将上清液进行干燥处理后通过旋风磨处理即得到粉末状的芸豆α-淀粉酶抑制剂提取物，其中，干燥方法包括冷冻干燥与喷雾干燥。
优选的是，所述的无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的制备方法中，所述芸豆为花芸豆。
无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物，所述高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物由如上任一项所述的方法制备得到。
酸性水解酶于无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的提取中的应用。
本发明至少包括以下有益效果：
本发明用酸性蛋白酶在一定pH及温度下处理芸豆水提物，可以在保留α-淀粉酶抑制活力的同时去除凝集素活力，还具有一定的体外抗氧化能力，操作简单，经济价值高，易于工艺化生产，在满足普通消费者控制体重的同时，也可以满足糖尿病患者的辅助治疗需求。
本发明的其它优点、目标和特征将部分通过下面的说明体现，部分还将通过对本发明的研究和实践而为本领域的技术人员所理解。
附图说明
图1为本发明各实施例96孔板法测定凝集素活力的情况图片。
具体实施方式
下面结合附图对本发明做进一步的详细说明，以令本领域技术人员参照说明书文字能够据以实施。
应当理解，本文所使用的诸如“具有”、“包含”以及“包括”术语并不配出一个或多个其它元件或其组合的存在或添加。
本发明提供一种无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的制备方法，包括依次进行的如下步骤：
在pH2-4和温度30-70℃条件下，利用蛋白酶处理芸豆水溶液0.5-2h，之后回调pH并取上清液；
将所述上清液处理得到粉末状的芸豆α-淀粉酶抑制剂提取物。
在上述方案中，作为优选，所述蛋白酶的量为1000-1500U/g样品。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述蛋白酶为酸性蛋白酶。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，获得所述芸豆水溶液的制备方法包括如下步骤：
步骤一、芸豆的预处理：取芸豆制成40-80目的芸豆粉，每100g芸豆粉用400-1000mL蒸馏水的量，将芸豆粉于室温下以200-300rpm的搅拌速度水提1-4h，过滤去残渣，得到滤液；
步骤二、将所得滤液室温静置，离心取上清液，即为所述芸豆水溶液。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，步骤二中，还包括如下处理：将所述上清液于压力40-50MPa下进行微波处理10-12min，其中，微波功率为80～100W，得到所述芸豆水溶液。本发明在压力条件下对芸豆水溶液进行微波处理，压力和微波的协同作用使得芸豆水溶液的溶解更好，更加均一一致，显著提高芸豆提取物中α-淀粉酶抑制物的抑制活性。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，将上清液进行干燥处理后通过旋风磨处理即得到粉末状的芸豆α-淀粉酶抑制剂提取物，其中，干燥方法包括冷冻干燥与喷雾干燥。
在本发明的其中一个实施例中，作为优选，所述芸豆为花芸豆。
本发明还提供无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物，所述高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物由如上任一项所述的方法制备得到。
本发明还提供酸性水解酶于无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物的提取中的应用。
为使本领域技术人员更好地理解本发明的技术方案，以下结合实施例进一步详细说明本发明，但是本发明的范围并不限制于以下实施例中：
本发明提供了一种无凝集活力的芸豆α-淀粉酶抑制剂提取物的制备方法，该方法在一定pH与温度条件下，通过酸性蛋白酶处理花芸豆水提液，在去除凝集素的同时保留了α-淀粉酶抑制活力，同时还具有一定的体外抗氧化能力；
该方法具体包括以下步骤：
S1、芸豆的预处理，磨粉、过筛、水提、过滤除渣，得到滤液；
S2、将所得滤液室温静置，使得淀粉充分沉降，离心取上清；
S3、调节滤液pH，加入蛋白酶，一定温度水浴，回调pH后离心取上清；
S4、将所得的上清液进行干燥处理后通过旋风磨处理即得到粉末状的芸豆α-淀粉酶抑制剂提取物。
可选的，在步骤S1中，芸豆的预处理，是指20-80筛的花芸豆粉，每100g芸豆粉400-1000mL蒸馏水的量，将芸豆粉于室温下以200-300rpm的搅拌速度水提1-4h。用8层纱布过滤去残渣，得到滤液。
可选的，在步骤S2中，将所述上清液于压力40-50MPa下进行微波处理10-12min，其中，微波功率为80-100W，得到所述芸豆水溶液。
可选的，在步骤S3中，pH调节可用盐酸等酸，最后调节pH可以是pH2-4之间。
可选的，在步骤S3中，加入花芸豆水提物的酶是酸性蛋白酶等蛋白酶。
可选的，在步骤S3中，加入酶解凝集素的酶的量为500-1500U/g样品及更高。
可选的，在步骤S3中水浴温度可在30-70℃之间，水浴时间可在0.5-2h之间。
可选的，在步骤S4中，干燥包括冷冻干燥与喷雾干燥但不仅限于这两种干燥方法。
本公开提供了一种无凝集活力的花芸豆α-淀粉酶抑制剂提取物的制备方法，该提取物使用上述方法制得。
通过上述技术方案，本公开制备的芸豆提取物，采用酸性蛋白酶在一定pH及温度下处理芸豆水提物，可以在保留α-淀粉酶抑制活力的同时去除凝集素活力，还具有一定的体外抗氧化能力，操作简单，经济价值高，易于工艺化生产，在满足普通消费者控制体重的同时，也可以满足糖尿病患者的辅助治疗需求。
下述实施例中所述方法，如无特殊说明，均为常规方法；所述材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。
芸豆提取物α-淀粉酶抑制活力测定：
将芸豆提取物适当稀释，取0.25mLα-淀粉酶溶液(1.5U/mL)和0.25mL稀释后的待测样品加入到0.5mL PBS(pH6.9，100mmol磷酸盐缓冲液，下同)，于37℃水浴10min后，加入0.25mL 1％(w/w)可溶性淀粉溶液，精确反应5min后加入1mL DNS试剂，沸水浴10min后冰浴冷却，加入5mL去离子水，在540nm波长下测定吸光值。在测定过程中，设置空白管、空白对照管和抑制对照管，测定体系如表1所示。
表1：α-淀粉酶抑制剂活力测定体系
芸豆提取物α-淀粉酶抑制率可按下式计算：
抑制率(％)＝(1-(A3-A4)/(A1-A2))*100％
式中A1、A2、A3、A4分别为540nm下空白管、空白对照管、抑制管和抑制对照管的吸光值。
芸豆提取物凝集活力测定：
采用96孔血凝板法进行测定，每孔中加入50μL PBS(10mmol，pH7.4磷酸盐缓冲液，下同)，向每排第一孔加入50μL的提取液，混匀，从第1孔中吸出50μL的混合液加入第2孔，混匀，从第2孔中吸出50μL的混合液加入到第3孔，混匀，以此类推，倍比稀释，从第12孔中吸出50μL的混合液，弃去。向每孔中加入50μL的兔红细胞悬液，于4℃静置1.5h，观察凝血结果。
芸豆提取物凝集活力可按下式计算：
凝集活力＝(2n)/(C(pr)*V)(n≥2)
式中n表示96孔板上显示血凝的最大孔数，C(pr)表示样品蛋白浓度，单位为(mg/mL)，V表示添加样品的体积，单位为(mL)
体外抗氧化能力测定：
DPPH·自由基清除能力的测定：将1mL适当稀释的提取物或标准品添加到含有1mLDPPH工作溶液(0.2mmol/L)的离心管中，总体积为2mL。混合液室温下避光反应30分钟后在517nm处测定吸光度。结果用水溶性VE当量表示(μmolTE/g DW)。
ABTS+·自由基清除能的测定：将500μL适当稀释的样品提取物或标准品与2mLABTS工作溶液混合(7mmol ABTS溶液与2.45mmol过硫酸钾溶液(1：1；v：v)混合，将混合物在黑暗中放置12小时，使其在734nm处的吸光度为0.70±0.05)，室温下避光反应30分钟，并在734nm处读取吸光度。结果用水溶性VE当量表示(μmolTE/g DW)。
铁离子还原抗氧化能力FRAP的测定：将100μL适当稀释的样品提取物或标准品与1.8mL FRAP试剂(0.3mol醋酸钠缓冲液：20mmol FeCl3溶液：10mmol TPTZ溶液＝10：1：1；v：v：v)混合，37℃水浴条件下反应10分钟，在593nm处读取吸光度。结果以μmolFe(II)当量表示(μmolFe(II)/g DW)
实施例1
将常见的五种芸豆(黑芸豆、白芸豆、奶花芸豆、红芸豆和花芸豆)用旋风磨粉碎，过60目筛，以料液比1：5(w/v)用去离子水在室温下水提2h，提取过程中以200rpm的速度搅拌，提取完成后，用8层纱布过滤去除残渣，得到滤液，滤液于室温下静置1h，待淀粉沉淀后，取上清，10000rpm离心30min后取上清，于-20℃冷冻后，进行冷冻干燥。
表2是5种不同芸豆对α-淀粉酶的抑制率以及体外抗氧化能力的测定结果。数据表明，红芸豆与花芸豆对α-淀粉酶的抑制剂率最高且差异不显著，黑芸豆、白芸豆与奶花芸豆则较低；白芸豆体外抗氧化能力最低，奶花芸豆体外抗氧化能力最高，综合上述结果，花芸豆对α-淀粉酶的抑制率最高且具有较高的抗氧化能力，所以选择花芸豆作为最佳品种进行提取。
表2 5种芸豆α-淀粉酶的抑制率与体外抗氧化能力
黑芸豆
白芸豆
奶花芸豆
红芸豆
花芸豆
α-淀粉酶抑制率(％)
53.58
53.50
52.54
60.20
60.17
DPPH(μmol TE/g DW)
12.52
3.46
17.93
10.24
11.47
ABTS(μmol TE/g DW)
45.98
13.09
49.77
28.55
33.84
FRAP(μmol Fe(II)/g DW)
20.61
9.11
27.53
16.94
19.43
实施例2
将花芸豆用旋风磨粉碎，过60目筛，以料液比1：5(w/v)用去离子水在室温下水提2h，提取过程中以200rpm的速度搅拌，提取完成后，用8层纱布过滤去除残渣，得到滤液，滤液于室温下静置1h，待淀粉沉淀后，取上清，10000rpm离心30min后取上清，于-20℃冷冻后，进行冷冻干燥。
实施例3
将芸豆用万能磨粉碎，过60目筛，以料液比1：5(w/v)用去离子水在室温下水提2h，提取过程中以200rpm的速度搅拌，提取完成后，用8层纱布过滤去除残渣，得到滤液，滤液于室温下静置1h，待淀粉沉淀后，取上清，10000rpm离心30min取上清，用1M盐酸调节pH至3，于70℃下水浴1h，随后冰浴冷却，用1M NaOH回调pH至6.4，10000rpm离心30min，取上清于-20℃冷冻后，进行冻干。
实施例4
将芸豆用万能磨粉碎，过60目筛，以料液比1：5(w/v)用去离子水在室温下水提2h，提取过程中以200rpm的速度搅拌，提取完成后，用8层纱布过滤去除残渣，得到滤液，滤液于室温下静置1h，待淀粉沉淀后，取上清，10000rpm离心30min取上清，用1M盐酸调节pH至3，酸性蛋白酶添加量为1000U/g，于50℃下水浴1h，随后冰浴冷却，用1M NaOH回调pH至6.4，10000rpm离心30min，取上清于-20℃冷冻后，进行冻干。
实施例5
将芸豆用万能磨粉碎，过60目筛，以料液比1：5(w/v)用去离子水在室温下水提2h，提取过程中以200rpm的速度搅拌，提取完成后，用8层纱布过滤去除残渣，得到滤液，滤液于室温下静置1h，待淀粉沉淀后，取上清，10000rpm离心30min取上清，用1M盐酸调节pH至3，酸性蛋白酶添加量为1000U/g，于50℃下水浴2h，随后冰浴冷却，用1M NaOH回调pH至6.4，10000rpm离心30min，取上清于-20℃冷冻后，进行冻干。
实施例6
将芸豆用万能磨粉碎，过60目筛，以料液比1：5(w/v)用去离子水在室温下水提2h，提取过程中以200rpm的速度搅拌，提取完成后，用8层纱布过滤去除残渣，得到滤液，滤液于室温下静置1h，待淀粉沉淀后，取上清，10000rpm离心30min取上清，用1M盐酸调节pH至3，酸性蛋白酶添加量为1000U/g，于60℃下水浴1h，随后冰浴冷却，用1M NaOH回调pH至6.4，10000rpm离心30min，取上清于-20℃冷冻后，进行冻干。
实施例7
将芸豆用万能磨粉碎，过60目筛，以料液比1：5(w/v)用去离子水在室温下水提2h，提取过程中以200rpm的速度搅拌，提取完成后，用8层纱布过滤去除残渣，得到滤液，滤液于室温下静置1h，待淀粉沉淀后，取上清，10000rpm离心30min取上清，用1M盐酸调节pH至3，酸性蛋白酶添加量为1000U/g，于60℃下水浴2h，随后冰浴冷却，用1M NaOH回调pH至6.4，10000rpm离心30min，取上清于-20℃冷冻后，进行冻干。
实施例8
将芸豆用万能磨粉碎，过60目筛，以料液比1：5(w/v)用去离子水在室温下水提2h，提取过程中以200rpm的速度搅拌，提取完成后，用8层纱布过滤去除残渣，得到滤液，滤液于室温下静置1h，待淀粉沉淀后，取上清，10000rpm离心30min取上清，用1M盐酸调节pH至3，酸性蛋白酶添加量为1000U/g，于70℃下水浴1h，随后冰浴冷却，用1M NaOH回调pH至6.4，10000rpm离心30min，取上清于-20℃冷冻后，进行冻干。
实施例9
将芸豆用万能磨粉碎，过60目筛，以料液比1：5(w/v)用去离子水在室温下水提2h，提取过程中以200rpm的速度搅拌，提取完成后，用8层纱布过滤去除残渣，得到滤液，滤液于室温下静置1h，待淀粉沉淀后，取上清，10000rpm离心30min取上清，用1M盐酸调节pH至3，酸性蛋白酶添加量为1000U/g，于70℃下水浴2h，随后冰浴冷却，用1M NaOH回调pH至6.4，10000rpm离心30min，取上清于-20℃冷冻后，进行冻干。
实施例10
将芸豆用万能磨粉碎，过80目筛，以料液比1：10(w/v)用去离子水在室温下水提1h，提取过程中以200rpm的速度搅拌，提取完成后，用8层纱布过滤去除残渣，得到滤液，滤液于室温下静置1h，待淀粉沉淀后，取上清，10000rpm离心30min取上清，将所述上清液于压力40MPa下进行微波处理12min，其中，微波功率为100W，得到芸豆水溶液。然后用1M盐酸调节pH至2，酸性蛋白酶添加量为1500U/g，于30℃下水浴0.5h，随后冰浴冷却，用1M NaOH回调pH至6.4，10000rpm离心30min，取上清于-20℃冷冻后，进行冻干。
将上述实施例得到的提取物进行α-淀粉酶抑制活力与凝集活力的测定，为了便于比较将抑制活力换算成相对抑制率。测得的结果见表3。
表3：不同处理后芸豆提取物α-淀粉酶相对抑制活力及凝集活力
注：相对抑制率＝处理后提取物抑制活力/未处理提取物抑制活力
相对凝集活力＝处理后提取物凝集活力/未处理提取物凝集活力
DPPH及ABTS清除能力以μmol TE/g DW表示
FRAP抗氧化能力以μmol Fe(II)/g DW表示
通过表2及图1可以得出应用本公开制备的芸豆提取物，凝集活力几乎为0，且抑制率保留约81.87％，同时处理条件对体外抗氧化能力无显著影响。
对本发明的无凝集活力的高α-淀粉酶抑制活力芸豆提取物及制备方法的应用、修改和变化对本领域的技术人员来说是显而易见的。
尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，可容易地实现另外的修改，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节和这里示出与描述的图例。
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