一种以罗非鱼鳞原料生产鱼胶原蛋白肽的方法
阅读说明：本技术 一种以罗非鱼鳞原料生产鱼胶原蛋白肽的方法 (Method for producing fish collagen peptide by using tilapia mossambica scale as raw material ) 是由 张格� 李江 王辉 林冰莹 王璇 于 2021-01-14 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种以罗非鱼鳞原料生产鱼胶原蛋白肽的方法,是由以下步骤制得：预处理；活化处理；胶原蛋白的提取；胶原蛋白肽的提取。本发明的方法可以彻底酶解胶原蛋白,酶解产物分子量小且集中,酶解产物氨基酸含量低,所得胶原蛋白肽为白色无味粉末,得率高,灰分含量小于0.6g/100g,不仅保证胶原蛋白肽的高得率,而且所制备的胶原蛋白肽的分子量小且集中,成品细腻,水溶性好,有利于规模化生产。(The invention discloses a method for producing fish collagen peptide by using tilapia mossambica scale as raw material, which comprises the following steps: pre-treating; activating treatment; extracting collagen; and (4) extracting collagen peptide. The method of the invention can carry out enzymolysis on collagen completely, the molecular weight of the enzymolysis product is small and concentrated, the amino acid content of the enzymolysis product is low, the obtained collagen peptide is white odorless powder, the yield is high, the ash content is less than 0.6g/100g, the high yield of the collagen peptide is ensured, the molecular weight of the prepared collagen peptide is small and concentrated, the finished product is fine and smooth, the water solubility is good, and the method is beneficial to large-scale production.)
技术领域
本发明涉及鱼胶原蛋白肽制备领域，具体是一种以罗非鱼鳞原料生产鱼胶原蛋白肽的方法。
背景技术
胶原蛋白(Collagen)是一种高分子蛋白质，是动物体内含量最多的蛋白质，约占人体蛋白质的25～33％，相当于人体重的6％，具有支撑器官、保护机体的功能。胶原蛋白是由3条肽链拧成螺旋纤维状蛋白质，广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼、内脏细胞间质及肌腔、韧带、巩膜等部位。骨骼中有机物的70％～80％是胶原蛋白，骨骼生成时，首先必须合成充足的胶原蛋白纤维来组成骨骼的框架。因此，有人称胶原蛋白为骨骼中的骨骼。胶原蛋白也是肌肤中的主要成分，占肌肤细胞中蛋白质含量的71％以上。皮肤的生长、修复和营养都离不开胶原蛋白。
我国是水产大国，水产资源丰富。目前我国水产品加工仍以粗加工为主，精深加工产品的比例不高。在水产加工业高速发展的同时会产生大量的鱼下脚料，例如鱼皮、鱼鳞、内脏、鱼头等，这些下脚料约占原料鱼的40～50％，除了少量用来生产鱼粉和鱼饲料，大部分都被丢弃，不仅造成了资源极大的浪费，而且还会造成环境污染。因此，如何高效利用鱼下脚料中的营养活性物质已经引起国内外科研工作者的高度重视。
胶原蛋白肽是指以胶原组织为原料，通过深度水解获得的具有特殊功能的低分子量的生物活性肽，分子量小，与胶原蛋白相比，胶原蛋白肽更易被人体吸收，吸收率约95％以上，而胶原蛋白的吸收率只有25％。胶原蛋白肽的亲水基团较多，因此水溶性更好，利用降解手段切断胶原蛋白的肽键，使功能性的片断显露出来，使得胶原蛋白肽中存在大量的生物活性组分，包括具有抗氧化、抑制ACE活性、抗溃疡、抑制关节炎、提高免疫力、增强骨密度以及预防骨质疏松等生物活性的肽，因此可被广泛应用于化妆品、保健食品和医药制品等领域中。
目前，制备鱼鳞胶原蛋白肽最主要的方法有酸法、碱法、酶法，以及多种方法结合使用。利用酸、碱法提取胶原蛋白肽，产品分子量分布广泛，均匀度差，为了制备分子量较小的胶原蛋白肽，在提取过程中必须消耗大量的酸和碱，并且提取产品成分非常复杂，后续纯化处理麻烦。除了酸、碱法外，还有酶解法可以提取胶原蛋白肽，与酸、碱法相比，酶法具有水解效率高、条件温和、易于控制水解进程等优点。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供了一种安全环保、高得率、产品纯度高、分子量小且集中的以罗非鱼鳞原料生产鱼胶原蛋白肽的方法。
为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：
一种以罗非鱼鳞原料生产鱼胶原蛋白肽的方法，是由以下步骤制得：
1)预处理：将清洗干净的罗非鱼鳞加至0.05mol/L的NaOH溶液中，搅拌8～10h，控干水分；再加至0.04mol/L的HCl溶液中浸泡2h，控干水分；最后加至复合液中浸泡30～50min，清水洗涤至中性，得预处理鱼鳞；
复合液中，氯化钙在溶液中易被吸附，保护鱼鳞组织；甲酸性质温和，在脱钙的同时保护鱼鳞组织；冰乙酸穿透速度快，帮助甲酸脱钙，减少甲酸对鱼鳞组织的破坏，并适当膨胀鱼鳞组织。复合液在有效脱钙的同时还能保护鱼鳞组织，提高胶原蛋白的提取率。
2)活化处理：将预处理鱼鳞加至活化液中，35～45℃条件下浸泡2～4h，升温至90～95℃，保持3～5min，自然冷却至室温，水洗，控干水分，烘干，粉碎后过80～100目筛，得活化鱼鳞粉；
本发明中，预处理鱼鳞通过活化液浸泡，膨胀鱼鳞组织结构；升温至90～95℃，高温破坏胶原蛋白分子非共价键平衡，促进酸和水分子进入胶原蛋白原有空腔，显著提高胶原蛋白提取率。
3)胶原蛋白的提取：将活化鱼鳞粉、酸性蛋白酶和去离子水混合，在45±2℃、pH＝6条件下提取1～3h，离心，收集上清液，得一次胶原蛋白液和一次残渣；将一次残渣、中性蛋白酶和去离子水混合，在50±2℃、pH值7条件下提取1～2h，离心，收集上清液，得二次胶原蛋白液和二次残渣；将二次残渣、碱性蛋白酶和去离子水混合，在55±2℃、pH值9条件下提取30～50min，收集上清液，得三次胶原蛋白液；将一次胶原蛋白液、二次胶原蛋白液和三次胶原蛋白液合并，截留分子量为3000～5000Da的超滤膜进行脱盐浓缩后，喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白；
本发明采用不同的酶进行处理，利用率高，能够控制胶原蛋白酶解程度。
4)胶原蛋白肽的提取：将鱼鳞胶原蛋白和去离子水混合均匀，然后加入复合蛋白酶和磁性氧化铁Fe3O4颗粒，在pH值6～7、40～60℃的条件下恒温酶解3～5h，灭酶，离心，收集上清液，减压浓缩，喷雾干燥，得鱼胶原蛋白肽。
本发明中，磁性氧化铁Fe3O4颗粒作为胶原蛋白胞外电子穿梭体，激发胶原蛋白酶解潜力，提高酶解效率，降低反应时间，显著提高鱼胶原蛋白肽得率。
所述的，复合液是由以下重量份的原料制得：氯化铝5～9份、甲酸10～20份、冰乙酸0.2～0.4份、水100份。
所述的，活化液是由以下重量份的原料制得的：氯化钾1～5份、聚谷氨酸钠1～3份、柠檬酸2～4份、水100份。
所述的，活化鱼鳞粉、酸性蛋白酶和去离子水的重量比为100：2～4：1000～1200。
所述的，一次残渣、中性蛋白酶和去离子水的重量比为100：1～3：800～1000。
所述的，二次残渣、碱性蛋白酶和去离子水的重量比为100：1：500～700。
所述的，鱼鳞胶原蛋白、去离子水、复合蛋白酶和磁性氧化铁Fe3O4颗粒的重量比为100：1500～2000：1～2：0.3～0.5。
所述的，磁性氧化铁Fe3O4颗粒的粒径为30～50nm。
本发明的有益效果：
1、本发明通过复合液在有效脱钙的同时保护鱼鳞组织，提高胶原蛋白的提取率；通过活化液浸泡膨胀鱼鳞组织结构，促进胶原蛋白的溶出，提高蛋白质的水解效果；通过高温提高胶原蛋白提取率；通过不同的酶处理，有效控制胶原蛋白酶解程度；最后通过磁性氧化铁Fe3O4颗粒的作用，激发胶原蛋白酶解潜力，提高酶解效率，降低反应时间，显著提高鱼胶原蛋白肽得率，降低鱼胶原蛋白肽的分子量。
2、本发明的方法可以彻底酶解胶原蛋白，酶解产物分子量小且集中，酶解产物氨基酸含量低，所得胶原蛋白肽为白色无味粉末，得率高，灰分含量小于0.6g/100g，不仅保证胶原蛋白肽的高得率，而且所制备的胶原蛋白肽的分子量小且集中，成品细腻，水溶性好，有利于规模化生产。
3、本发明的原料为水产加工废弃物，有效避免环境污染，提高资源利用率。
具体实施方式
下面将以实施例的方式对本申请作进一步的详细描述，以使本领域技术人员能够实践本申请。应当理解，可以采用其他实施方式，并且可以做出适当的改变而不偏离本申请的精神或范围。为了避免对于使本领域技术人员能够实践本申请来说不必要的细节，说明书可能省略了对于本领域技术人员来说已知的某些信息。因此，以下详细描述不应以限制性的意义来理解，且本发明的范围仅由所附权利要求界定。以下的实施例便于更好地理解本申请，但并不用来限制本申请的范围。
实施例1
一种以罗非鱼鳞原料生产鱼胶原蛋白肽的方法，是由以下步骤制得：
1)预处理：将清洗干净的罗非鱼鳞加至0.05mol/L的NaOH溶液中，搅拌8～10h，控干水分；再加至0.04mol/L的HCl溶液中浸泡2h，控干水分；最后加至复合液中浸泡50min，清水洗涤至中性，得预处理鱼鳞；
2)活化处理：将预处理鱼鳞加至活化液中，35℃条件下浸泡4h，升温至90℃，保持5min，自然冷却至室温，水洗，控干水分，烘干，粉碎后过80目筛，得活化鱼鳞粉；
3)胶原蛋白的提取：将活化鱼鳞粉、酸性蛋白酶和去离子水混合，在45±2℃、pH＝6条件下提取3h，离心，收集上清液，得一次胶原蛋白液和一次残渣；将一次残渣、中性蛋白酶和去离子水混合，在50±2℃、pH值7条件下提取1h，离心，收集上清液，得二次胶原蛋白液和二次残渣；将二次残渣、碱性蛋白酶和去离子水混合，在55±2℃、pH值9条件下提取30min，收集上清液，得三次胶原蛋白液；将一次胶原蛋白液、二次胶原蛋白液和三次胶原蛋白液合并，截留分子量为5000Da的超滤膜进行脱盐浓缩后，喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白；
4)胶原蛋白肽的提取：将鱼鳞胶原蛋白和去离子水混合均匀，然后加入复合蛋白酶和磁性氧化铁Fe3O4颗粒，在pH值6、60℃的条件下恒温酶解3h，灭酶，离心，收集上清液，减压浓缩，喷雾干燥，得鱼胶原蛋白肽。
所述的，复合液是由以下重量份的原料制得：氯化铝9份、甲酸10份、冰乙酸0.4份、水100份。
所述的，活化液是由以下重量份的原料制得的：氯化钾1份、聚谷氨酸钠3份、柠檬酸2份、水100份。
所述的，活化鱼鳞粉、酸性蛋白酶和去离子水的重量比为100：4：1000。
所述的，一次残渣、中性蛋白酶和去离子水的重量比为100：3：800。
所述的，二次残渣、碱性蛋白酶和去离子水的重量比为100：1：700。
所述的，鱼鳞胶原蛋白、去离子水、复合蛋白酶和磁性氧化铁Fe3O4颗粒的重量比为100：1500：2：0.3。
所述的，磁性氧化铁Fe3O4颗粒的粒径为50nm。
实施例2
一种以罗非鱼鳞原料生产鱼胶原蛋白肽的方法，是由以下步骤制得：
1)预处理：将清洗干净的罗非鱼鳞加至0.05mol/L的NaOH溶液中，搅拌8～10h，控干水分；再加至0.04mol/L的HCl溶液中浸泡2h，控干水分；最后加至复合液中浸泡30min，清水洗涤至中性，得预处理鱼鳞；
2)活化处理：将预处理鱼鳞加至活化液中，45℃条件下浸泡2h，升温至95℃，保持3min，自然冷却至室温，水洗，控干水分，烘干，粉碎后过100目筛，得活化鱼鳞粉；
3)胶原蛋白的提取：将活化鱼鳞粉、酸性蛋白酶和去离子水混合，在45±2℃、pH＝6条件下提取1h，离心，收集上清液，得一次胶原蛋白液和一次残渣；将一次残渣、中性蛋白酶和去离子水混合，在50±2℃、pH值7条件下提取2h，离心，收集上清液，得二次胶原蛋白液和二次残渣；将二次残渣、碱性蛋白酶和去离子水混合，在55±2℃、pH值9条件下提取50min，收集上清液，得三次胶原蛋白液；将一次胶原蛋白液、二次胶原蛋白液和三次胶原蛋白液合并，截留分子量为3000Da的超滤膜进行脱盐浓缩后，喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白；
4)胶原蛋白肽的提取：将鱼鳞胶原蛋白和去离子水混合均匀，然后加入复合蛋白酶和磁性氧化铁Fe3O4颗粒，在pH值7、40℃的条件下恒温酶解5h，灭酶，离心，收集上清液，减压浓缩，喷雾干燥，得鱼胶原蛋白肽。
所述的，复合液是由以下重量份的原料制得：氯化铝5份、甲酸20份、冰乙酸0.2份、水100份。
所述的，活化液是由以下重量份的原料制得的：氯化钾5份、聚谷氨酸钠1份、柠檬酸4份、水100份。
所述的，活化鱼鳞粉、酸性蛋白酶和去离子水的重量比为100：2：1200。
所述的，一次残渣、中性蛋白酶和去离子水的重量比为100：1：1000。
所述的，二次残渣、碱性蛋白酶和去离子水的重量比为100：1：500。
所述的，鱼鳞胶原蛋白、去离子水、复合蛋白酶和磁性氧化铁Fe3O4颗粒的重量比为100：2000：1：0.5。
所述的，磁性氧化铁Fe3O4颗粒的粒径为30nm。
实施例3
一种以罗非鱼鳞原料生产鱼胶原蛋白肽的方法，是由以下步骤制得：
1)预处理：将清洗干净的罗非鱼鳞加至0.05mol/L的NaOH溶液中，搅拌8～10h，控干水分；再加至0.04mol/L的HCl溶液中浸泡2h，控干水分；最后加至复合液中浸泡40min，清水洗涤至中性，得预处理鱼鳞；
2)活化处理：将预处理鱼鳞加至活化液中，40℃条件下浸泡3h，升温至92℃，保持4min，自然冷却至室温，水洗，控干水分，烘干，粉碎后过90目筛，得活化鱼鳞粉；
3)胶原蛋白的提取：将活化鱼鳞粉、酸性蛋白酶和去离子水混合，在45±2℃、pH＝6条件下提取2h，离心，收集上清液，得一次胶原蛋白液和一次残渣；将一次残渣、中性蛋白酶和去离子水混合，在50±2℃、pH值7条件下提取1.5h，离心，收集上清液，得二次胶原蛋白液和二次残渣；将二次残渣、碱性蛋白酶和去离子水混合，在55±2℃、pH值9条件下提取40min，收集上清液，得三次胶原蛋白液；将一次胶原蛋白液、二次胶原蛋白液和三次胶原蛋白液合并，截留分子量为4000Da的超滤膜进行脱盐浓缩后，喷雾干燥，得鱼鳞胶原蛋白；
4)胶原蛋白肽的提取：将鱼鳞胶原蛋白和去离子水混合均匀，然后加入复合蛋白酶和磁性氧化铁Fe3O4颗粒，在pH值6.5、50℃的条件下恒温酶解4h，灭酶，离心，收集上清液，减压浓缩，喷雾干燥，得鱼胶原蛋白肽。
所述的，复合液是由以下重量份的原料制得：氯化铝7份、甲酸15份、冰乙酸0.3份、水100份。
所述的，活化液是由以下重量份的原料制得的：氯化钾3份、聚谷氨酸钠2份、柠檬酸3份、水100份。
所述的，活化鱼鳞粉、酸性蛋白酶和去离子水的重量比为100：3：1100。
所述的，一次残渣、中性蛋白酶和去离子水的重量比为100：2：900。
所述的，二次残渣、碱性蛋白酶和去离子水的重量比为100：1：600。
所述的，鱼鳞胶原蛋白、去离子水、复合蛋白酶和磁性氧化铁Fe3O4颗粒的重量比为100：1800：1.5：0.4。
所述的，磁性氧化铁Fe3O4颗粒的粒径为40nm。
对比例1
和实施例3不同之处在于，未使用磁性氧化铁Fe3O4颗粒。
对比例2
和实施例3不同之处在于，不进行复合液浸泡。
对比例3
和实施例3不同之处在于，不进行活化处理步骤，将预处理鱼鳞直接控干水分，烘干，粉碎后过90目筛，得鱼鳞粉。
性能测试
将实施例1-3和对比例1-3制备的鱼胶原蛋白肽进行性能测试，分子量分布参照《中华人民共和国国家标准GB/T22729-2008》附录A中的方法进行，羟脯氨酸检测方法参照《中华人民共和国国家标准GB/T9695.23-2008》进行，总氮检测方法参照《中华人民共和国国家标准GB/T5009.5-2016》进行，灰分检测方法参照《中华人民共和国国家标准GB/T5009.4-2016》进行，结果如下表1所示。
表1实施例1-3和对比例1-3制备的鱼胶原蛋白肽性能测试结果
由表1可知，实施例1-3制备的鱼胶原蛋白肽的各项性能均优于对比例1-3制备的鱼胶原蛋白肽，说明本发明的方法可以彻底酶解胶原蛋白，酶解产物分子量小且集中，羟脯氨酸含量高，灰分含量小于0.6g/100g。
最后应说明的是：以上具体实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述具体实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施方式所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施方式和具体实施例技术方案的精神和范围。
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