具体实施方式

根据上下文的详细描述、权利要求书和附图，本发明的其他目的和优点将变得更加明显。

本发明的一个方面提供了表位，其包含选自具有SEQ ID NO：1所示序列的SMO蛋白的第106位至第485位氨基酸的1个至10个氨基酸。

Hedgehog(Hh)是在胚胎发育中起至关重要作用的蛋白质。Hedgehog会影响各种器官的发育，包括背轴和腹轴以及神经和肌肉骨骼系统中的器官的发育。成人组织中的Hedgehog与干细胞的维持有关，已知其异常活跃会引起多种癌症，例如基底细胞癌和脑癌。在发育过程之后，Hedgehog信号转导活性仅在某些特定的成年组织中得以维持，而在大多数体细胞中却降低。体细胞阶段的Hedgehog信号转导基因(Ptch、Smo、Sufu、Gli等)的突变会引起异常的信号转导活性，从而导致癌变。

Hedgehog信号转导通路是由Sonic Hedgehog与Patched1(Ptch1)结合而启动的，Patched1(Ptch1)是存在于细胞膜中的12-跨膜受体。Ptch1对7-跨膜Gli蛋白偶联受体SMO具有抑制作用。但是，当Sonic Hedgehog与Ptch1结合时，Ptch1会失去对SMO的抑制活性，从而导致SMO的激活。激活后，SMO将激活转录因子Gli，以激活Hedgehog靶基因的表达。换句话说，hedgehog作为配体与细胞膜上存在的Ptch1受体结合，以促进活性受Phch1抑制的GPCR样跨膜蛋白SMO迁移至原发纤毛，并且促进作为最终的Hedgehog信号转导效应子的Gli转录因子的活性。

SMO如下调节Gli转录因子的活性。SMO通过hedgehog迁移至原发纤毛并调节Sufu，从而抑制Gli转录因子在下游信号转导阶段向核的迁移或增加原发纤毛中Gli蛋白的稳定性并将非活性Gli转化为转录活性状态。Gli转录因子的激活诱导受hedgehog影响的基因表达增加，从而使细胞迁移、增殖和分化过程得以进行。

作为经过大量努力发现可控制癌症的新抗原的结果，本发明的发明人成功地确定了作为抗原的SMO蛋白在hedgehog信号转导通路中与各种癌症有关的特定表位(Sonic(SHH))/PATCHED/(PTCH1)/SMOOTHENED(SMO))，靶向并能够在免疫学上识别该SMO蛋白的抗体与之特异性结合，从而完成了本发明。

如本文所用，术语“表位”是指抗体或其片段可以特异性结合的抗原的局部区域。表位通常由分子表面基团如氨基酸或糖侧链组成，并且通常具有特定的三维结构特征和特定的电荷特征。构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂的存在下，与前者的结合会丧失，而与后者的结合不会丧失。表位可以包括直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性成分)和不直接参与结合的其他氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(换句话说，氨基酸残基在特异性抗原结合肽的足迹范围内)。

本发明的表位可包含选自SMO蛋白的第106位至第115位、第125位至第133位、第159位至第166位、第216位至第224位、第299位至第307位、第391位至第399位和第477位至第485位的氨基酸的1个至10个氨基酸。

当在疫苗或组合物中使用时，可以将包含在SMO蛋白的限定位置处的氨基酸的表位与载体结合，以维持其结构。载体没有特别限制，只要它是生物相容的并且可以实现本发明的期望效果即可。优选地，载体选自肽、血清白蛋白、免疫球蛋白、血蓝蛋白和多糖。

具体而言，如图1所示，本发明的表位由存在于Smoothened(SMO)蛋白的富含半胱氨酸的结构域(CRD)或口袋位置(SMO-7TM)中的一些或全部氨基酸残基组成。第106位至第115位的氨基酸残基为LVLWSGLRNA(SEQ ID NO：2)，第125至第133位的氨基酸残基为LLCAVYMPK(SEQ ID NO：3)，第159至第166位的氨基酸残基为RERGWPDF(SEQ ID NO：4)，第216至第224位的氨基酸残基为QCQNPLFTE(SEQ ID NO：5)，第299至第307位的氨基酸残基为GTMRLGEPT(SEQ ID NO：6)，第391至第399位的氨基酸残基为FVGYKNYRY(SEQ ID NO：7)，第477至第485位的氨基酸残基为QAEWERSFR(SEQ ID NO：8)。优选地，本发明的表位包括上述一种、一些或全部氨基酸序列。氨基酸序列可以是连续的或非连续的。序列中的某些氨基酸可以互换。

SMO蛋白可以具有SEQ ID NO：1所示的序列，其可以在GenBank数据库中找到。

Smoothened(SMO)是7-跨膜Gli蛋白偶联受体，已知其可调节Gli转录因子的活性，而Gli转录因子是hedgehog信号转导通路中的最终效应子。然而，新开发的用于抑制hedgehog信号转导过度活跃引起的癌症的化合物仅设计为靶向Hedgehog信号转导通路中Ptch1或Hedgehog蛋白的活性或抑制SMO的抑制活性。这些化合物无法完全抑制Hedgehog信号转导通路，并且难以应用于由SMO突变引起的耐药性癌细胞。因此，如上所述，迫切需要开发对多种类型的癌症(包括普通癌症、耐药性癌症和复发性癌症)表现出治疗效果的SMO抑制剂。

本发明的另一个方面提供了抗体或其片段，该抗体或其片段识别作为抗原的具有SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：15中任一项所示序列的SMO表位，并特异性结合SMO表位，其中抗体包括具有SEQ ID NO：16所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：17所示序列的HCDR2、具有SEQID NO：18所示序列的HCDR3、具有SEQ ID NO：19所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO：20所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO：21所示序列的LCDR3。

本发明的另一个方面提供了抗体或其片段，该抗体或其片段识别作为抗原的具有SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：15中任一项所示序列的SMO表位，并特异性结合SMO表位，其中抗体与参照抗体交叉竞争与SMO蛋白表位的结合，参照抗体包括具有SEQ ID NO：16所示序列的HCDR1、具有SEQ ID NO：17所示序列的HCDR2、具有SEQ ID NO：18所示序列的HCDR3、具有SEQ ID NO：19所示序列的LCDR1、具有SEQ ID NO：20所示序列的LCDR2和具有SEQ ID NO：21所示序列的LCDR3。

已知成人组织中hedgehog的过度活跃会引起各种癌症，例如基底细胞癌和脑癌。共有三种哺乳动物的hedgehog：Sonic、Indian和Desert，其中研究最多的是Sonichedgehog(SHH)信号转导通路，在其中可发现hedgehog的全身性表达。

Sonic hedgehog信号转导通路是由Sonic hedgehog与Patched1(Ptch1)结合而启动的，Patched1(Ptch1)是存在于细胞膜中的12-跨膜受体。Ptch1对7-跨膜Gli蛋白偶联受体SMO具有抑制作用。但是，当Sonic hedgehog与Ptch1结合时，Ptch1会失去对SMO的抑制活性，从而导致SMO的激活。激活后，SMO将激活转录因子Gli，以激活hedgehog靶基因的表达。换句话说，hedgehog作为配体与细胞膜上存在的Ptch1受体结合，以促进活性受Phch1抑制的GPCR样跨膜蛋白SMO迁移至原发纤毛，并且促进作为最终的hedgehog信号转导效应子的Gli转录因子的活性。SMO蛋白在癌细胞中具有最高的活性，而SMO蛋白的高表达或激活与癌症患者或癌细胞的低存活率相关，如以下实验示例部分所述。

发现SMO蛋白的高表达与结直肠癌患者的低存活率有关。还发现与在正常细胞中相比，在结直肠癌细胞系中SMO蛋白的表达增加。还发现在DLD-1、HCT15、HCT116、HT29、WIDR、SW48、SNUC2A、colo205、SNU283、SW480、SW620、HCT8、SNUC1和LS174T结直肠癌细胞系中，作为hedgehog信号转导成分的SMO和GLI1蛋白的表达增加。这些结果表明，Gil蛋白作为最终的hedgehog信号转导效应子，受SMO蛋白活化的调节。还发现抗体特异性结合SMO蛋白的表位区域以抑制或约束SMO蛋白的活化。基于这些发现完成了本发明。

根据本发明的优选实施方案，抗原结合蛋白与具有SEQ ID NO：1所示序列的SMO蛋白特异性结合并抑制或约束，并且只要其是使用作为抗原的SMO蛋白或其一部分(表位)产生的，就没有特别限制。

如本文所用，术语“表位”是指抗体或其片段可以特异性结合的抗原的局部区域。例如，表位可以由多肽抗原的连续氨基酸组成。或者，表位可以通过在多肽中的三级折叠由两个或多于两个不连续的区域组成。该表位可以在抗原的独特空间构象中包含至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个连续或不连续的氨基酸。根据本发明的抗体或其片段识别并特异性结合作为抗原的SMO，并且可以特异性结合由选自SMO蛋白的第106位至第485位氨基酸残基的1个至10个氨基酸组成的表位。表位可以包含一个或多于一个氨基酸。

用于确定给定抗体结合哪些表位的方法(即表位作图)是本领域众所周知的，包括例如免疫印迹测定法和免疫沉淀测定法。确定表位的空间构象的方法包括各种技术，例如X射线晶体学、二维核磁共振和HDX-MS(Epitope Mapping Protocols in Methods inMolecular Biology，Vol.66，G.E.Morris，Ed.(1996))。

根据本发明的优选实施方案，根据本发明的抗体或其片段可以结合的表位可以通过例如NMR光谱、X射线衍射晶体学研究、ELISA分析、氢/氘交换与质谱(HDX-MS)、基于阵列的寡肽扫描分析和/或诱变图谱确定(Giege R等人.，(1994)Acta Crystallogr D BiolCrystallogr 50(Pt 4)：339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189：1-23；ChayenNE(1997)Structure 5：1269-1274；McPherson A(1976)J Biol Chem 251：6300-6303)。

如本文所用，术语“抗体”可以是免疫球蛋白分子的任何类型(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)或任何亚类(例如人的IgG1、IgG2、IgG3和IgG4，以及小鼠的IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)。免疫球蛋白(例如，IgG1)以几种同种异型存在。术语“抗体”可以是IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚类或其任何杂合体(例如，IgG2和IgG4的杂合体)。

如本文所用，术语“单克隆抗体”是指对特定表位表现出单一结合特异性和亲和力的抗体。

本发明的单克隆抗体可以通过首次在Kohler等人的Nature 256，495(1975)中引入的杂交瘤技术或重组DNA技术产生。可通过例如在Clackson等人的Nature 352，624-628(1991)和Marks等人的J.Mol.Biol.222，581-597(1991)中所述的技术从噬菌体抗体库中分离出单克隆抗体。单克隆抗体可以从合适的来源产生。本发明的单克隆抗体可以从杂交瘤中产生，所述杂交瘤是从表达SMO抗原的细胞中获得的，或者是从以编码SMO抗原的核酸形式的目标抗原免疫的小鼠中获得的细胞中获得的。单克隆抗体也可以由杂交瘤产生，该杂交瘤来源于免疫的人或非人哺乳动物(例如大鼠、狗或灵长类动物)的表达抗体的细胞。

单克隆抗体在本文中意在包括其片段。优选地，片段是指抗原结合片段。片段可以通过本领域已知的各种方法来制备。例如，Fab和F(ab′)2片段可通过使用诸如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)之类的酶通过蛋白水解切割免疫球蛋白分子来产生。

术语“片段”可以是Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv、单链Fv(scFv)或由单体VH或VL结构域组成的sdAb。这样的片段是本领域众所周知的。

根据本发明的单克隆抗体或其片段包括抗原结合蛋白，该抗原结合蛋白与具有SEQ ID NO：1所示序列的SMO蛋白的表位结合并抑制与SMO介导的癌症生长和转移相关的生理效应。具体而言，通过激活癌症的hedgehog信号转导机制，作为最终效应子的Gli蛋白表达增加。通过hedgehog的SMO表达涉及此过程。SMO蛋白的激活或表达会增加hedgehog信号转导通路中的Gli蛋白并引起癌症。即，SMO蛋白被hedgehog信号转导机制增加或激活，从而影响癌症的生长和发展。用包括抗原结合蛋白或其片段的单克隆抗体进行的处理对于抑制和约束SMO蛋白的表达或活性是有用的。

如本文所用，术语“抑制生长”旨在包括与不与单克隆抗体或其片段接触的相同细胞的生长相比，与本发明的单克隆抗体或其片段接触时细胞的生长的任何可测量的减少(例如，将细胞培养基中的细胞生长抑制约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％)。细胞生长的减少可以通过多种机制来实现。

抗原结合蛋白包括一个或多于一个CDR(例如1个、2个、3个、4个、5个或6个CDR)。抗原结合蛋白是与作为抗原的SMO结合的多肽，并且包括一个或多于一个本文所述的互补决定区(CDR)。CDR在抗原结合蛋白中定向以获得合适的抗原结合特性。本文公开的抗原结合蛋白可以抑制、阻断、减少或调节SMO的表达或活化。结果，抗原结合蛋白可以抑制对象中存在的SMO，从而抑制由hedgehog信号转导通路介导的癌症发展、生长和转移。

已知hedgehog信号转导通路的调节障碍导致对化学疗法和放射疗法的耐药性癌症、复发性癌症或转移性癌症的发生。尽管尚未明确建立基本的耐药性机制，但是发现向对常规抗癌药有耐药性的癌细胞施用根据本发明的SMO抗体可显著抑制癌细胞的生长。总之，本发明的抗体或其片段对耐药性癌症、复发性癌症和转移性癌症以及普通癌症具有显著的治疗作用。

VH结构域或其一个或多于一个CDR可与恒定结构域连接以形成重链。VL结构域或其一个或多于一个CDR可与恒定结构域连接以形成轻链。全长重链和全长轻链结合形成全长抗体。

如上所述，抗原结合蛋白与包含选自具有SEQ ID NO：1所示序列的SMO蛋白第106至第485位氨基酸残基的1个至10个氨基酸的表位结合。与SMO特异性结合的抗原结合蛋白可有效抑制、阻断和抑制hedgehog信号转导通路以及表达和活化SMO蛋白。

优选地，抗原结合蛋白具有与SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：15中列出的所有或一些氨基酸序列互补的序列，从而使其能够特异性或选择性地与SMO蛋白结合。

抗原结合蛋白由于其抑制、约束或调节SMO的一种或多于一种生物学活性的能力而可以用于治疗用途。抗原结合蛋白与SMO蛋白特异性结合，并实质上抑制SMO，这在随后的实验实施例部分中通过体外竞争性结合得到证明。

免疫球蛋白链的可变区通常表现出相同的总体结构，包括由三个高变区(通常称为“互补决定区”或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)。来自上述每个重链/轻链对的两条链的CDR通常通过框架区排列以形成与靶蛋白(例如，PCSK9)上的特定表位或结构域特异性结合的结构。从N端到C端，天然存在的轻链和重链可变区通常都符合以下这些元件的顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。已经设计出一种编号系统，用于给在这些结构域的每一个中占据位置的氨基酸分配编号。该编号系统在Kabat Sequences of Proteins ofImmunological Interest(1987 and 1991，NIH，Bethesda，Md.)或Chothia&Lesk，1987，J.Mol.Biol.196：901-917；Chothia等人，1989，Nature 342：878-883中定义。

可以在本文中提供各种重链和轻链可变区。这些可变区中的每一个可以连接至上述重链和轻链恒定区，以分别形成完整的抗体重链和轻链。此外，每个这样产生的重链和轻链序列可以结合以形成完整的抗体结构。

根据本发明的优选实施方案，所述抗体或其片段是包括与SMO表位结合的本文公开的CDR或可变区的SMO抗体。在特定的实施方案中，抗体或其片段包括HCDR1、HCDR2和HCDR3，以及LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO：16、SEQID NO：17和SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。

根据本发明的优选实施方案，抗体或其片段与包含本文公开的CDR和可变区的SMO抗体交叉竞争与SMO表位的结合(或抑制该结合)。在某些实施方案中，所述抗体或其片段抑制参照抗体的结合，所述参照抗体包括HCDR1、HCDR2和HCDR3以及LCDR1、LCDR2和LCDR3，其中HCDR1、HCDR2和HCDR3分别包含SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：17和SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列，LCDR1、LCDR2和LCDR3分别包含SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：20和SEQ ID NO：21所示的氨基酸序列。

在一些实施方案中，参照抗体包括(1)包含SEQ ID NO：22所示序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：27所示序列的轻链可变区(VL)；(2)包含SEQ ID NO：23所示序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：28所示序列的轻链可变区(VL)；(3)包含SEQ ID NO：24所示序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：29所示序列的轻链可变区(VL)；(4)包含SEQID NO：25所示序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：29所示序列的轻链可变区(VL)；或(5)包含SEQ ID NO：26所示序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：29所示序列的轻链可变区(VL)。

优选地，参照抗体包括(2)包含SEQ ID NO：23所示序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：28所示序列的轻链可变区(VL)；(3)包含SEQ ID NO：24所示序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：29所示序列的轻链可变区(VL)；(4)包含SEQ ID NO：25所示序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：29所示序列的轻链可变区(VL)；或(5)包含SEQ ID NO：26所示序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：29所示序列的轻链可变区(VL)。最优选地，参照抗体包括(4)包含SEQ ID NO：25所示序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：29所示序列的轻链可变区(VL)，或(5)包含SEQ ID NO：26所示序列的重链可变区(VH)和包含SEQ ID NO：29所示序列的轻链可变区(VL)。

在某些实施方案中，本发明的抗体或其片段将参照抗体与SMO蛋白的结合抑制至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。竞争抗体结合相同的表位、重叠的表位或邻近的表位(例如，通过位阻证明)。可以使用本领域已知的竞争实验例如RIA和EIA来确定两种抗体是否彼此竞争结合靶标。

根据本发明的抗体或其片段能够与人SMO蛋白的至少一个表位结合，例如，如通过抗体与人SMO蛋白的片段的结合所确定的。在一些实施方案中，抗体或其片段结合至少一个表位，该表位包括选自具有SEQ ID NO：1所示序列的SMO蛋白的第106位至第485位氨基酸残基的1个至10个氨基酸。在一些实施方案中，抗体及其片段结合SEQ ID NO：2至SEQ ID NO：15所示的全部或一些氨基酸序列。根据优选的实施方案，本发明的抗体可以结合至少一种具有SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：13所示序列的SMO表位。在一些实施方案中，所述至少一个表位具有与SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：13至少90％、至少约95％、至少约96％、至少约97％、至少约98％、至少约99％或约100％相同的氨基酸序列。

本文所述的VH结构域或其一个或多于一个CDR也可以连接至恒定结构域以形成重链，例如全长重链。类似地，本文所述的VL结构域或其一个或多于一个CDR可与恒定结构域连接以形成轻链，例如全长轻链。全长重链和全长轻链结合形成全长抗体。

根据优选的实施方案，本发明的抗体是嵌合抗体、人抗体或人源化抗体。

本发明的另一方面提供了编码所述多肽的核酸分子，包含所述核酸分子的载体或包含所述载体的宿主细胞。

本发明的核酸分子可以是经分离的或重组的核酸分子。此类核酸分子的实例包括单链和双链DNA和RNA及其相应的互补序列。经分离的核酸可以从天然来源分离。在这种情况下，经分离的核酸与存在于要从其分离核酸的对象的基因组中的外周基因序列分离。经分离的核酸可以理解为由模板酶促或化学合成的核酸，例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸。在这种情况下，由该程序产生的核酸可以理解为经分离的核酸分子。经分离的核酸分子代表单独片段形式或作为较大核酸构建体的组分的核酸分子。当核酸与另一核酸序列以功能关系排列时，核酸是“可操作地连接”。例如，当作为前蛋白表达时，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，其中前蛋白是前分泌多肽。当排列以促进翻译时，将影响多肽序列转录的启动子或增强子可操作地连接至编码序列，或将核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，术语“可操作地连接”是指要连接的DNA序列彼此相邻。在分泌前导序列的情况下，术语“可操作地连接”是指在相同的引导框架中彼此相邻存在的分泌前导序列。

然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制酶位点连接来进行连接。在该位点不存在的情况下，根据本领域已知的合适方法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

如本文所用，术语“载体”用于指在其中可以插入核酸序列以引入到其中可以复制核酸序列的细胞中的载体。核酸序列可以是“外源的”或“异源的”。载体包括质粒、黏粒和病毒(例如噬菌体)。本领域技术人员可以通过标准重组技术(Maniatis等人，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988；和Ausubel等人，In：Current Protocols in Molecular Biology，John，Wiley&Sons，Inc，NY，1994等)构建载体。

如本文所用，术语“表达载体”是指含有编码至少部分能够转录的基因产物的核酸序列的载体。在某些情况下，RNA分子然后被翻译成蛋白质、多肽或肽。表达载体可以包含各种“调控序列”。除了控制转录和翻译的调控序列以外，载体和表达载体还可包含具有其他功能的核酸序列。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指能够复制载体或表达由载体编码的基因的任何转基因生物。合适的生物包括真核生物和原核生物。宿主细胞可以被载体转染或转化。转染或转化是指用于将外源核酸分子转移或引入宿主细胞的过程。

本发明的宿主细胞优选是细菌细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、BHK-21细胞、COS7细胞、COP5细胞、A549细胞或NIH3T3细胞，但不限于此。

本发明的另一个方面提供了用于预防或治疗癌症的疫苗组合物，其包含表位、编码该表位的核酸分子或包含该核酸分子的载体，该表位包括选自具有SEQ ID NO：1所示序列的SMO蛋白第106至第485位氨基酸的1个至10个氨基酸。

本发明的核酸分子可以是经分离的或重组的核酸分子。此类核酸分子的实例包括单链和双链DNA和RNA及其相应的互补序列。经分离的核酸可以从天然来源分离。在这种情况下，经分离的核酸与存在于要从其分离核酸的对象的基因组中的外周基因序列分离。经分离的核酸可以理解为从模板酶促或化学合成的核酸，例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸。在这种情况下，由该程序产生的核酸可以理解为经分离的核酸分子。经分离的核酸分子代表单独片段形式或作为较大核酸构建体的组分的核酸分子。当核酸与另一核酸序列以功能关系排列时，核酸是“可操作地连接”。例如，当作为前蛋白表达时，前序列或分泌前导序列的DNA与多肽的DNA可操作地连接，前蛋白是前分泌多肽。当排列以促进翻译时，将影响多肽序列转录的启动子或增强子可操作地连接至编码序列，或将核糖体结合位点可操作地连接至编码序列。通常，术语“可操作地连接”是指要连接的DNA序列彼此相邻。在分泌前导序列的情况下，术语“可操作地连接”是指在相同的引导框架中彼此相邻存在的分泌前导序列。

然而，增强子不必是连续的。通过在方便的限制酶位点连接来进行连接。在该位点不存在的情况下，根据本领域已知的合适方法使用合成的寡核苷酸衔接子或接头。

如本文所用，术语“载体”用于指在其中可以插入核酸序列以引入到其中可以复制核酸序列的细胞中的载体。核酸序列可以是“外源的”或“异源的”。载体包括质粒、黏粒和病毒(例如噬菌体)。本领域技术人员可以通过标准重组技术(Maniatis等人，MolecularCloning，A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Press，Cold Spring Harbor，N.Y.，1988；和Ausubel等人，In：Current Protocols in Molecular Biology，John，Wiley&Sons，Inc，NY，1994等)构建载体。

如本文所用，术语“表达载体”是指含有编码至少部分能够转录的基因产物的核酸序列的载体。在某些情况下，RNA分子然后被翻译成蛋白质、多肽或肽。表达载体可以包含各种“调控序列”。除了控制转录和翻译的调控序列以外，载体和表达载体还可包含具有其他功能的核酸序列。

如本文所用，术语“宿主细胞”是指能够复制载体或表达由载体编码的基因的任何转基因生物。合适的生物包括真核生物和原核生物。宿主细胞可以被载体转染或转化。转染或转化是指用于将外源核酸分子转移或引入宿主细胞的过程。

本发明的宿主细胞优选是细菌细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、BHK-21细胞、COS7细胞、COP5细胞、A549细胞或NIH3T3细胞，但不限于此。

疫苗可以是活疫苗、减毒疫苗或灭活疫苗。

通过预防或治疗癌症的主动免疫，本发明的疫苗组合物不仅可以诱导针对SMO蛋白的免疫应答，而且可以诱导全身免疫应答。主动免疫是指个体暴露于病原体时会产生自己的抗体。

可将本发明的疫苗组合物施用于对象以预防或治疗癌症。

癌症可以选自脑瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、小肠癌、直肠癌、输卵管癌、肛门癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、淋巴结癌、膀胱癌、胆囊癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。癌症可以是晚期癌症、耐药性癌症、复发性癌症或转移性癌症。特别地，耐药性癌症是指对药物具有耐受性的癌症。用于耐药性癌症的合适治疗药物包括但不特别限于氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、纳拉替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼洛替尼、塞马西尼、博舒替尼、阿西替尼、西地尼布、来舒替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗奥唑米星、替伊莫单抗、七铂、甲基氨基乙酰丙酸、氨氯地林、阿仑单抗、普卡巴嗪、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多西氟啶、培美曲塞、替加福、卡培他滨、吉美拉西、奥他拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、恩西他汀、氟他胺、地西他滨、卡培他滨、巯基嘌呤、硫代鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫呋、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛特坎、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春花碱、替尼泊苷、阿霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、柔红霉素、放线霉素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、阿司他汀、达卡巴嗪、噻替帕、尼莫斯汀、苯丁酸氮芥、米托乐醇、亚叶酸、维甲酸、依西美坦、氨基谷氨酰胺、阿那格雷、纳韦尔滨、法得唑、他莫昔芬、托瑞米芬、睾丸内酯、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑、比卡鲁胺、洛莫司汀、伏立诺他、恩替诺特、5FU和卡氮芥。优选地，复发性癌症是对奥沙利铂或西妥昔单抗具有耐药性的癌症。

本发明的另一方面提供了一种组合物，其包含抑制SMO基因表达的抗体或其片段、核酸分子、载体或抑制剂。

根据优选的实施方案，本发明的组合物是用于预防或治疗癌症、抑制癌症转移或预防或治疗耐药性癌症、复发性癌症或转移性癌症的药物组合物。

本发明的另一个方面提供了新的抑制SMO基因表达的核酸或其片段、核酸分子、载体或抑制剂在制备用于预防或治疗癌症、抑制癌症转移或预防或治疗耐药性癌症、复发性癌症或转移性癌症的药物中的用途。

癌症可以选自脑瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、小肠癌、直肠癌、输卵管癌、肛门癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、淋巴结癌、膀胱癌、胆囊癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。癌症可以是晚期癌症、耐药性癌症、复发性癌症或转移性癌症。特别地，耐药性癌症是指对药物具有耐受性的癌症。用于耐药性癌症的合适治疗药物包括但不特别限于：氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、纳拉替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼洛替尼、塞马西尼、博舒替尼、阿西替尼、西地尼布、来舒替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗奥唑米星、替伊莫单抗、七铂、甲基氨基乙酰丙酸、氨氯地林、阿仑单抗、普卡巴嗪、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多西氟啶、培美曲塞、替加福、卡培他滨、吉美拉西、奥他拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、恩西他汀、氟他胺、地西他滨、卡培他滨、巯基嘌呤、硫代鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫呋、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛特坎、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春花碱、替尼泊苷、阿霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、柔红霉素、放线霉素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、阿司他汀、达卡巴嗪、噻替帕、尼莫斯汀、苯丁酸氮芥、米托乐醇、亚叶酸、维甲酸、依西美坦、氨基谷氨酰胺、阿那格雷、纳韦尔滨、法得唑、他莫昔芬、托瑞米芬、睾丸内酯、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑、比卡鲁胺、洛莫司汀、伏立诺他、恩替诺特、5FU和卡氮芥。优选地，复发性癌症是对奥沙利铂或西妥昔单抗具有耐药性的癌症。

本发明的药物组合物可以包括(a)抗体或其片段、核酸分子、包含该核酸分子的载体或抑制SMO基因表达的抑制剂和(b)药学上可接受的载体。

癌症是由SMO基因或蛋白质的过表达引起的。可以在GenBank数据库中找到SMO基因。

术语“过表达”用于表示其中SMO蛋白过表达的癌症，并且是指如通过合适的表达测定所测量的，SMO的表达水平是对比细胞(例如正常结直肠细胞)的至少1.1倍、优选至少2倍。

根据本发明的组合物的最大特征是该组合物靶向SMO基因或蛋白质并抑制该SMO基因的表达水平或该SMO蛋白的表达或活性以治疗癌症、抑制癌症转移或治疗耐药性癌症、复发性癌症或转移性癌症。

抑制剂可以选自小干扰RNA(siRNA)、短发夹RNA(shRNA)、微RNA(miRNA)、核酶、DNA酶、肽核酸(PNA)、反义寡核苷酸及其组合。抑制剂优选是短发夹RNA或小发夹RNA(shRNA)，其特异性结合基因的mRNA。抑制剂可以抑制SMO基因的表达。

本发明的另一方面提供了用于预防或治疗癌症的方法，其包括施用药物组合物。本发明的另一个方面提供了用于预防或治疗转移性癌症的方法，包括施用药物组合物。

通过本发明预防或治疗的癌症类型不受限制。可以施用本发明的药物组合物以治疗多种癌症，包括选自以下的成人常见实体瘤：脑瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、小肠癌、直肠癌、输卵管癌、肛门癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、淋巴结癌、膀胱癌、胆囊癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。

药物组合物具有针对晚期癌症、耐药性癌症、复发性癌症或转移性癌症的治疗作用。特别地，耐药性癌症是指对药物具有耐受性的癌症。用于耐药性癌症的合适治疗药物包括但不特别限于氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、纳拉替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼洛替尼、塞马西尼、博舒替尼、阿西替尼、西地尼布、来舒替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗奥唑米星、替伊莫单抗、七铂、甲基氨基乙酰丙酸、氨氯地林、阿仑单抗、普卡巴嗪、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多西氟啶、培美曲塞、替加福、卡培他滨、吉美拉西、奥他拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、恩西他汀、氟他胺、地西他滨、卡培他滨、巯基嘌呤、硫代鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫呋、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛特坎、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春花碱、替尼泊苷、阿霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、柔红霉素、放线霉素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、阿司他汀、达卡巴嗪、噻替帕、尼莫斯汀、苯丁酸氮芥、米托乐醇、亚叶酸、维甲酸、依西美坦、氨基谷氨酰胺、阿那格雷、纳韦尔滨、法得唑、他莫昔芬、托瑞米芬、睾丸内酯、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑、比卡鲁胺、洛莫司汀、伏立诺他、恩替诺特、5FU和卡氮芥。优选地，复发性癌症是对奥沙利铂或西妥昔单抗具有耐药性的癌症。

根据本发明的疫苗组合物和药物组合物中的每一种可以包含一种或多于一种通常用于制剂的药学上可接受的载体。药学上可接受的载体的实例包括但不限于乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、藻酸盐、明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。本发明的药物组合物还可以包含一种或多于一种选自润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、助悬剂和防腐剂的添加剂。合适的药学上可接受的载体和制剂的详细信息可以在Remington’s Pharmaceutical Sciences(第19版，1995年)中找到。

本发明的疫苗组合物和药物组合物可以口服施用或胃肠外施用，优选胃肠外施用。合适的肠胃外施用途径的实例包括静脉内注射、局部注射和腹膜内施用途径。

根据本发明的疫苗组合物和药物组合物的合适剂量可能会因多种因素而变化，例如制剂、施用方式、患者的年龄、体重、性别、病理状况和饮食、施用时间、施用途径、排泄率和反应性。熟练的医师可以容易地确定并开出对于所需治疗和预防有效的根据本发明的疫苗组合物和药物组合物的剂量。根据优选的实施方案，根据本发明的疫苗组合物和药物组合物中的每一种可以以0.0001mg/kg至100mg/kg的日剂量施用。

可以根据本领域技术人员容易进行的方法，将本发明的疫苗组合物和药物组合物中的每一种与一种或多于一种药学上可接受的载体和/或赋形剂一起配制。疫苗组合物和药物组合物可以单位剂型提供或分配在多剂量容器中。制剂可以是在油或水性介质中的溶液、悬浮液或乳液的形式，或者可以是提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊的形式。制剂还可以包括分散剂或稳定剂。

本发明的疫苗组合物和药物组合物中的每一种可单独使用或与一种或多于一种其他常规化学疗法和/或放射疗法组合使用。这种组合疗法对癌症治疗更为有效。化疗剂可以与本发明的组合物组合使用。化疗剂的实例包括顺铂、卡铂、丙卡巴肼、甲乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、美法仑、苯丁酸氮芥、白消安(bisulfan)、亚硝基脲、放线菌素、柔红霉素、阿霉素、博来霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷、他莫昔芬、紫杉醇、反铂、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤。放射疗法可以与本发明的组合物组合使用。例如，放射疗法可以是X射线照射和γ射线照射。

本发明的另一个方面提供了定量样品中SMO蛋白的方法，包括用抗体或其片段处理从对象分离的样品。

由于本发明的抗体或其片段与SMO蛋白特异性结合的能力，因此其可用于准确测量样品中SMO蛋白的表达水平。另外，抗体或其片段的使用确保了与耐药性癌症、复发性癌症或转移性癌症相关的SMO蛋白的表达水平的测量。

本发明的另一个方面提供了用于提供用于诊断由SMO蛋白过表达引起的疾病的信息的方法，该方法包括(a)从对象中分离样品，(b)用抗体或其片段或编码该抗体或其片段的核酸分子处理样品和(c)确定样品中SMO的表达水平是否高于正常组样品中SMO的表达水平。

SMO蛋白参与hedgehog信号转导通路，并将作为最终效应子的Gli转化为转录活性状态，从而促进细胞迁移、增殖和分化过程。SMO蛋白在多种癌症中过表达，例如膀胱癌、肺癌、卵巢癌、肾癌、结直肠癌、前列腺癌、乳腺癌、子宫癌、横纹肌肉瘤和成胶质细胞瘤、耐药性癌症、转移性癌症和复发性癌症。由于过表达的SMO蛋白直接参与主要的癌症进展过程，例如癌细胞的增殖、迁移、渗透和转移，因此hedgehog信号转导通路中SMO蛋白表达水平与健康对象中SMO蛋白表达水平的比较可为诊断SMO蛋白过表达引起的疾病提供信息。

根据本发明的一个优选的实施方案，由SMO蛋白的过表达引起的疾病是癌症。

癌症可以选自脑瘤、黑色素瘤、骨髓瘤、非小细胞肺癌、口腔癌、肝癌、胃癌、结肠癌、乳腺癌、肺癌、骨癌、胰腺癌、皮肤癌、头癌、颈癌、宫颈癌、卵巢癌、结直肠癌、小肠癌、直肠癌、输卵管癌、肛门癌、子宫内膜癌、阴道癌、外阴癌、霍奇金病、食道癌、淋巴结癌、膀胱癌、胆囊癌、内分泌腺癌、甲状腺癌、甲状旁腺癌、肾上腺癌、软组织肉瘤、尿道癌、阴茎癌、前列腺癌、慢性或急性白血病、淋巴细胞性淋巴瘤、肾癌、输尿管癌、肾细胞癌、肾盂癌、中枢神经系统肿瘤、原发性中枢神经系统淋巴瘤、脊髓肿瘤、脑干神经胶质瘤、垂体腺瘤、淋巴瘤、白血病和多发性骨髓瘤。癌症可以是晚期癌症、耐药性癌症、复发性癌症或转移性癌症。特别地，耐药性癌症是指对药物具有耐受性的癌症。用于耐药性癌症的合适治疗药物包括但不特别限于氮芥、伊马替尼、奥沙利铂、利妥昔单抗、厄洛替尼、纳拉替尼、拉帕替尼、吉非替尼、凡德他尼、尼洛替尼、塞马西尼、博舒替尼、阿西替尼、西地尼布、来舒替尼、曲妥珠单抗、吉非替尼、硼替佐米、舒尼替尼、卡铂、索拉非尼、贝伐单抗、顺铂、西妥昔单抗、槲寄生、天冬酰胺酶、维甲酸、羟基脲、达沙替尼、雌莫司汀、吉妥珠单抗奥唑米星、替伊莫单抗、七铂、甲基氨基乙酰丙酸、氨氯地林、阿仑单抗、普卡巴嗪、前列地尔、硝酸钬壳聚糖、吉西他滨、多西氟啶、培美曲塞、替加福、卡培他滨、吉美拉西、奥他拉西、阿扎胞苷、甲氨蝶呤、尿嘧啶、阿糖胞苷、氟尿嘧啶、氟达拉滨、恩西他汀、氟他胺、地西他滨、卡培他滨、巯基嘌呤、硫代鸟嘌呤、克拉屈滨、卡莫呋、雷替曲塞、多西他赛、紫杉醇、伊立替康、贝洛特坎、托泊替康、长春瑞滨、依托泊苷、长春新碱、长春花碱、替尼泊苷、阿霉素、伊达比星、表柔比星、米托蒽醌、丝裂霉素、博来霉素、柔红霉素、放线霉素、吡柔比星、阿柔比星、培洛霉素、替西罗莫司、替莫唑胺、白消安、异环磷酰胺、环磷酰胺、美法仑、阿司他汀、达卡巴嗪、噻替帕、尼莫斯汀、苯丁酸氮芥、米托乐醇、亚叶酸、维甲酸、依西美坦、氨基谷氨酰胺、阿那格雷、纳韦尔滨、法得唑、他莫昔芬、托瑞米芬、睾丸内酯、阿那曲唑、来曲唑、伏氯唑、比卡鲁胺、洛莫司汀、伏立诺他、恩替诺特、5FU和卡氮芥。优选地，复发性癌症是对奥沙利铂或西妥昔单抗具有耐药性的癌症。

本发明的另一个方面提供了用于定量SMO蛋白的试剂盒，其包括抗体或其片段或编码该抗体或其片段的核酸分子。

本发明的定量试剂盒可以通过通过抗原-抗体结合反应分析针对抗体的抗原来定量SMO蛋白的量。抗原-抗体结合反应优选选自但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、放射免疫测定(RIA)、夹心式测定、聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白质印迹、免疫印迹测定和免疫组化染色。

抗原-抗体结合反应的支持物选自但不限于硝酸纤维素膜、PVDF膜、由聚乙烯或聚苯乙烯树脂制成的孔板和载玻片。

第二抗体优选地用显色的试剂标记。显色试剂可以选自荧光素和染料。荧光素可以是例如辣根过氧化物酶(HRP)、碱性磷酸酶、胶体金、聚-L-赖氨酸-荧光素异硫氰酸酯(FITC)和罗丹明-B-异硫氰酸酯(RITC)。根据显色试剂，优选使用用于引起显色的底物。底物优选选自但不限于3，3′，5，5′-四甲基联苯胺(TMB)、2，2′-叠氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸(ABTS)和邻苯二胺(OPD)。

实施方式

参考以下实施例更具体地解释本发明。对于本领域技术人员显而易见的是，本发明的范围不受根据本发明的主旨的这些实施例的限制。

<生产实施例1至5：SMO抗体的生产>

通过用具有SEQ ID NO：1所示序列的SMO蛋白的约15聚体氨基酸残基作为抗原免疫小鼠来产生抗体。请求BIOONE(韩国)生产抗体。

1)小鼠免疫和杂交瘤细胞的生产

使用在SMO蛋白的第100至第115位的氨基酸残基(SEQ ID NO：9；SMO抗体21号和283号)、第214至第228位的氨基酸残基(SEQ ID NO：10；SMO抗体324号、401号和408号)、第124至第138位的氨基酸残基(SEQ ID NO：11)、第155至第169位的氨基酸残基(SEQ ID NO：12)、第475至第488位的氨基酸残基(SEQ ID NO：13)、第389至第403位的氨基酸残基(SEQID NO：14)和第297至310位的氨基酸残基(SEQ ID NO：15)作为抗原生产SMO单克隆抗体。选择SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：15作为有效生产抗体的靶肽。

将用于生产抗体的每种靶肽(SEQ ID NO：9至SEQ ID NO：15)注射到小鼠中后，从小鼠的脾脏产生针对抗原的生产抗体的细胞(B细胞、B淋巴细胞)。将生产抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。在仅杂交瘤细胞可以存活的HAT培养基中培养后，通过ELISA实验确认了抗体的活性。

2)分离和表征

从杂交瘤细胞中选择能够特异性识别SMO蛋白的单克隆杂交瘤细胞，并将其注射到小鼠的腹腔中。从腹水中回收单克隆抗体，并使用蛋白A和蛋白G柱进行纯化。此后，分离出能够特异性识别SMO的单克隆抗体(SMO mAb)，并使用SMO构建体和siRNA通过Western印迹和免疫荧光进行表征。

从作为抗原的SMO蛋白的第100至第115位的氨基酸残基(SEQ ID NO：9)分离并鉴定了SMO抗体21号(生产实施例1)和283号(生产实施例2)。从作为抗原的SMO蛋白的第214至第229位的氨基酸残基(SEQ ID NO：10)分离并鉴定了SMO抗体324号(生产实施例3)、401号(生产实施例4)和408号(生产实施例5)。

<生产实施例6至10：5号、7号、15号、16号和17号人源化SMO抗体的生产>

通过用具有SEQ ID NO：1所示序列的SMO蛋白的约15聚体氨基酸残基作为抗原免疫小鼠来生产抗体。请求BIOONE(韩国)生产抗体。

1)小鼠免疫和杂交瘤细胞的生产

使用SMO蛋白的第214至第228位的氨基酸残基(SEQ ID NO：10)作为抗原来产生单克隆抗体。选择该氨基酸残基作为用于生产抗体的靶肽。

将用于生产抗体的每种靶肽注射到小鼠中后，从小鼠的脾脏产生针对抗原的生产抗体的细胞(B细胞、B淋巴细胞)。将生产抗体的细胞与骨髓瘤细胞融合以形成杂交瘤细胞。在仅杂交瘤细胞可以存活的HAT培养基中培养后，通过ELISA实验确认了抗体的活性。

2)分离和杂交瘤测序

从5×10⁶杂交瘤细胞中提取抗SMO抗体的总RNA，并根据制造商的说明使用cDNA合成试剂盒(Roche)从总RNA合成互补DNA(cDNA)。使用小鼠Ig引物(Millipore)通过PCR扩增重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)编码区。将PCR产物克隆到T载体(Promega)中用于测序。对抗体进行了测序，结果列于表1。如Kabat等人，Sequences of Proteins ofImmunological Interest，第5版，Public Health Service，美国国立卫生研究院，贝塞斯达，马里兰州(1991)中所述确定CDR序列。

[表1]

3)转化为人源化抗体

为了产生人源化抗体，将小鼠SMO抗体的重链和轻链可变区的氨基酸序列与IMGT数据库中人抗体的氨基酸序列进行比较。作为比较和分析的结果，选择相似性最高的人抗体可变区的重链基因IGHV1-3*01、IGHV1-46*01和IGHV1-69-2*01以及轻链基因IGKV2-30*20、IGKV2D-28*01和IGKV1-39*01。为了使小鼠SMO抗体人源化，将小鼠SMO抗体的CDR插入人抗体可变区的基因中，并用小鼠抗体的氨基酸残基代替人源化FR的氨基酸残基。表2显示了人源化抗体的完整序列。

[表2]

CDR1、CDR2和CDR3序列用下划线表示。

实施例

<实施例1>判断SMO蛋白是否在结直肠癌组织中表达

1、目标

从2005年至2009年手术后切除了206例结直肠癌组织，并以距肿瘤0.5cm以上的27例结直肠组织(正常组织)作为对照。

2、组织微阵列构建

将正常组织和结直肠癌组织用甲醛固定并包埋在石蜡中。将每个组织连续切成四个3μm厚的切片，将其附着在用3-氨基-丙基三乙氧基硅烷处理过的载玻片上。其中一个切片用10％的Mayer苏木精染色，另外三个切片用SMO抗原进行免疫组织化学染色。对苏木精染色载玻片上的病例进行组织学检查，标记代表性区域，并选择石蜡块中的相应区域。使用切片机将所选区域打孔至2mm大小，以用于组织微阵列块的构建(MICROM international)。在预先准备好的接收块中钻出直径为2mm、深度为2mm的微孔，然后将从病例块中冲出的组织碎片插入总共233个微孔中。将组织微阵列块在50℃下静置30分钟以使横截面平坦。

3、免疫组织化学染色(IHC)

将组织微阵列载玻片浸入柠檬酸盐缓冲溶液(10mM，pH 6.0)中以回收抗原，并使用微波炉在磷酸盐缓冲溶液(PBS，10mM，pH 6.0)中处理3次，每次5分钟。此后，向处理过的载玻片添加3％过氧化氢，用PBS洗涤10分钟，用10％绵羊血清处理以抑制非特异性结合，并用一抗处理。将抗SMO抗体(abcam，MA，美国)(1∶50)在室温下孵育1小时。抗体用PBS洗涤3次，在室温下用二抗(DAKO，Carpinteria，美国)孵育1小时，用PBS洗涤3次，并用链霉亲和素-HRP(DAKO，Carpinteria，美国)孵育10分钟。

此后，用3，3′-二氨基联苯胺(DAB)显色，用10％的Mayer′s苏木精复染，用流动的水洗涤，固定并用光学显微镜观察。

4、结论

图3示出了正常组织和结直肠癌组织的随机选择的免疫组织化学染色的切片的光学显微镜图像(上图)，以及示出了组织的免疫组织化学染色的结果的图(下图)。如图3所示，SMO蛋白在结直肠癌组织中的表达水平高于正常组织。特别是，在结直肠癌组织中，SMO表达的染色强度在统计学上显著更高(p＜0.0001)。

<实施例2>根据SMO在结直肠癌组织中的表达水平来确定存活率

根据SMO的表达水平，分析实施例1中获得的206例结直肠癌组织的存活率。将结直肠癌组织分为具有低SMO表达水平的组(弱SMO，蓝线)和具有高SMO表达水平的组(强SMO，绿线)。比较两组的生存曲线。使用统计程序SPSS分析总体生存曲线。

图4示出了在实施例1中获得的206例结直肠癌组织的存活曲线，将其分为具有低SMO表达水平的组(“弱SMO”)和具有高SMO表达水平的组(“强SMO”)。

如图4所示，与SMO低表达水平的组(弱SMO)相比，SMO高表达水平的组(强SMO)显示出较差的预后。两组之间的总生存率存在统计学显著的差异(p＝0.05)。

<实施例3>正常组织和结直肠癌组织的蛋白质印迹

1、对象

在实施例1中获得的206例结直肠癌组织和27例正常组织中，选择16个结直肠癌组织和16个正常组织(#1、#2、#3、#4、#5、#6、#7、#10、#21、#22、#27，、#28和#30)作为最终对象。收集后立即将对象置于液氮中进行快速冷冻，并于-80℃下保存在冰箱中。实验前将对象解冻用于蛋白质的分离。

2、蛋白质的分离

在加入了蛋白酶的裂解缓冲液(7M尿素、2M硫脲、4％CHAPS、40mM Tris、100mMDTT)中通过机械均质化和超声处理的组合破坏组织，然后在15000rpm和4℃下离心30分钟。使用Bradford方法通过ELISA对上清液中的蛋白质进行定量。

3、蛋白质印迹法

从收集的组织中分离出的30μg蛋白质经过电泳，转移到PVDF膜上，用抗SMO抗体(abcam，MA，美国)作为一抗标记，将HRP偶联的抗兔抗体作为二抗标记，并通过化学发光染色进行检测。将通过增强化学发光(ECL)方法测量的SMO的表达水平表示为相对于肌动蛋白水平(“1”)。

在图5中，#之后的数字是样本编号，并且每个样本编号中的正常组织和结直肠癌组织分别由字母N(正常)和T(肿瘤)表示。

4、结论

图5显示了显示正常组织和结直肠癌组织的蛋白质印迹结果的照片图像。图6显示了图5量化后的相对SMO表达。

如图5和图6所示，SMO蛋白在结直肠癌组织(肿瘤：T)中的表达水平高于在大多数正常组织中的表达水平(正常：N)。正常组织和结直肠癌组织中SMO的表达水平有统计学显著的差异(P＜0.01)。

<实施例4>分析各种结直肠癌细胞系中的hedgehog和SMO信号转导表达

1、结直肠癌细胞系培养

结直肠癌细胞系(DLD-1、HCT15、HCT116、HT29、WIDR、SW48、SNUC2A、colo205、SNU283、SW480、SW620、HCT8、SNUC1和LS174T)购自韩国细胞系库。每个结直肠癌细胞系传代三次，并在60mm培养板(Falcon)中以1×10⁵/cm²的密度培养。每3天更换一半培养基。96孔培养板(Falcon)用于细胞毒性测试。补充有青霉素-链霉素(100U/ml)和10％胎牛血清的RPMI1640用作培养基。在潮湿的5％CO₂培养箱(Forma，美国)中进行培养。

2、蛋白质印迹法

研究了作为hedgehog信号转导成分的GLI1、GLI2、GLI3、SHH、SMO、PTCH1和SUFU蛋白的表达水平。为此，将每种结直肠癌细胞系在PRO-PREP蛋白提取溶液(IntronBiotechnology，首尔，韩国)中裂解。然后，使用前提取蛋白质并用BCA(ThermoScientific，Rockford，IL，USA)进行定量。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，将其转移至PVDF膜(Millipore，Billerica，MA，美国)，并用5％脱脂奶封闭。此后，将封闭的蛋白质在4℃下用GLI1、GLI2、GLI3、SHH、SMO、PTCH1、SUFU抗体和β-肌动蛋白(Santa Cruz，CA，美国)标记过夜。第二天，将蛋白质用TBST洗涤，并在室温下用山羊抗小鼠IgG-HRP(Santa Cruz)标记1小时。使用ECL检测试剂(Bionote，Hwaseong，韩国)确定蛋白质的表达水平。

3、结论

图7显示了针对14种结直肠癌细胞系的蛋白质印迹结果，以分析hedgehog信号转导成分GLI1、GLI2、GLI3、SHH、SMO、PTCH1和SUFU蛋白的表达水平。如图7所示，观察到结直肠细胞的不同的蛋白质表达谱。特别是，SMO和GLI1蛋白在HCT116、SNU283和SW620细胞中具有高表达，而在DLD-1中具有低表达。

<实施例5>SMO抗体在结直肠癌细胞系GCT116中的结合能力的分析

1、HCT116结直肠癌细胞系培养

HCT116结直肠癌细胞系购自韩国细胞系库。将结直肠癌细胞系传代三次，并在60mm 96孔培养板(Falcon)中以1×10⁵/cm²的密度培养。每3天更换一半培养基。补充有青霉素-链霉素(100U/ml)和10％胎牛血清的RPMI 1640用作培养基。在潮湿的5％CO₂培养箱(Forma，美国)中培养24小时。

2、流式细胞术

培养完成后，通过用0.05％胰蛋白酶处理数分钟分离细胞，收集细胞，并用PBS洗涤两次。将洗涤后的细胞固定在3.7％甲醛中，加入小鼠SMO抗体作为一抗和Abcam SMO抗体(阳性对照)，并在4℃放置过夜。然后，将细胞用PBS洗涤3次，用缀合有Alexa 594的二抗染色，并通过流式细胞术进行分析。

3、结论

图8示出了流式细胞术确定结直肠癌细胞HCT116中的21号抗体(生产实施例1)和283号抗体(生产实施例2)的结合能力的结果。在图8中，下图显示了通过流式细胞术测量的HCT116细胞中抗体的平均荧光强度。

图9示出了流式细胞术确定结直肠癌细胞HCT116中的324号抗体(生产实施例3)、401号抗体(生产实施例4)和408号抗体(生产实施例5)的结合能力的结果。在图9中，下图显示了通过流式细胞术测量的HCT116细胞中抗体的平均荧光强度。

如图8和图9所示，在SMO和GLI1的表达相对较高的HCT116细胞系中分析了SMO抗体的结合能力，结果显示，21号抗体(生产实施例1)和283号抗体(生产实施例2)与细胞系中的SMO蛋白特异性结合。具体地，21号抗体(生产实施例1)与SMO蛋白结合的能力大于283号抗体(生产实施例2)与SMO蛋白结合的能力。

发现324号抗体(生产实施例3)、401号抗体(生产实施例4)和408号抗体(生产实施例5)有效且特异性地结合至HCT116中表达的SMO蛋白。

<实施例6>小鼠SMO抗体在结直肠癌细胞系SW620 con shRNA和SW620SMO shRNA中的结合能力的测定

1、Sw620 con shRNA(Con shRNA)的制备和培养

将SW620细胞感染shRNA慢病毒颗粒(santacruz，MA，美国A)后，将1000个细胞接种在100mm皿中，并培养至少一周。通过用嘌呤霉素二盐酸盐进行菌落选择获得SMO shRNA稳定细胞，并通过蛋白质印迹法鉴定。

在该实验例中，培养进行了24小时。

2、SW620 SMO shRNA(SMO shRNA)的制备和培养

将SW620细胞感染SMOshRNA慢病毒颗粒(santacruz，LS-40161-V，MA，美国)后，将1000个细胞接种在100mm皿中，并培养至少一周。通过用嘌呤霉素二盐酸盐进行菌落选择获得SMO shRNA稳定细胞，并通过蛋白质印迹法鉴定。选择并使用了敲除菌落。

在该实验例中，培养进行了24小时。

3、流式细胞术

培养完成后(24小时)，通过用0.05％胰蛋白酶处理数分钟分离细胞，收集细胞，并用PBS洗涤两次。将洗涤后的细胞固定在3.7％甲醛中，加入小鼠SMO抗体作为一抗和AbcamSMO抗体(阳性对照)，并在4℃放置过夜。然后，将细胞用PBS洗涤3次，用缀合有Alexa 594的二抗染色，并通过流式细胞术进行分析。

4、结论

图10(A)显示SW620 con shRNA和SW620 SMO shRNA细胞的蛋白质印迹结果，图10(B)显示通过流式细胞术确定SW620 con shRNA和SW620 SMO shRNA细胞中21号抗体(生产实施例1)和283号抗体(生产实施例2)的结合能力的结果，图10(C)显示图10B中通过流式细胞术测量的HCT116细胞中抗体的平均荧光强度。

用shRNA处理表达SMO的结直肠癌细胞系SW620，以制备SMO表达减少的细胞，将其用抗(生产实施例1和2)处理，以确定SMO抗体能否结合SMO蛋白。如图10所示，当用21号抗体(生产实施例1)和283号抗体(生产实施例2)处理SMO蛋白表达减少的SMO shRNA细胞时，未观察到抗体与SMO蛋白的结合。相反，观察到在Con shRNA中抗体与SMO蛋白的结合增加，证明了SMO抗体特异性结合SMO蛋白的能力。

<实施例7>使用BODIPY-环巴胺测定结直肠癌细胞系HCT116中竞争性结合SMO的能力

1、HCT116结直肠癌细胞系培养

HCT116结直肠癌细胞系购自韩国细胞系库。将结直肠癌细胞系传代三次，并在60mm培养板(Falcon)中以1×10⁵/cm²的密度培养。每3天更换一半培养基。补充有青霉素-链霉素(100U/ml)和10％胎牛血清的RPMI 1640用作培养基。在潮湿的5％CO₂培养箱(Forma，美国)中培养24小时。

2、本发明的SMO抗体和BODIPY-环巴胺(BC)的体外竞争

根据Roudaut等人的Mol.Pharmacol.79：453-460，2011中描述的方案进行该实验。具体地，用本发明的SMO抗体(生产实施例1或2)将细胞在存在BC(10nM)的情况下培养24小时，或在不存在BC(10nM)的情况下培养2小时。培养完成后，将细胞固定在3.7％的甲醛中，并通过蓝色DAPI染色观察细胞核。接下来，固定细胞并通过共聚焦显微镜观察反应性氧的产生。

SMO抗体(生产实施例1或2)对BODIPY-环巴胺(BC)结合的抑制作用是通过荧光减少来测量，荧光减少是使用PCI 6.2软件(Hamamatsu Corporation)拍摄并定量然后将其参照照片上存在的核的表面积测量的。

3、结论

图11示出了在用BODIPY-环巴胺(BC)和本发明的SMO抗体同时处理以分析SMO抗体和BC的体外竞争结合能力之后的共聚焦显微镜图像。

在用BODIPY-环巴胺(绿色)和21号抗体(生产实施例1)或283号抗体(生产实施例2)同时处理后，观察本发明的抗体是否与BODIPY-环巴胺竞争结合结直肠癌细胞系HCT116中的SMO蛋白。

如图11所示，当单独用BODIPY-环巴胺处理在未经本发明的SMO抗体处理的HCT116细胞时，BODIPY-环巴胺与细胞中的SMO蛋白良好结合，这可以通过绿色的增加来解释。相反，当同时用BODIPY-环巴胺和21号抗体或283号抗体处理细胞时，通过本发明的SMO抗体(生产实施例1或2)抑制了BODIPY-环巴胺(BC)的结合，这可以通过绿色荧光强度的降低来解释。从这些结果得出结论，21号抗体和283号抗体对细胞中的SMO蛋白具有高亲和力。

<实施例8>小鼠SMO抗体对GLI的抑制活性的测定

1、NIH3T3-GLI细胞系培养

Gli报告物-NIH3T3细胞系购自BPS Bioscience(CA，美国)。

2、NIH3T3-GLI报告物检测

将具有GLI转录活性的NIH3T3-GLI细胞以1×10⁴细胞/cm²的密度接种在96孔板中24小时后，用Sonic hedgehog肽处理细胞30分钟。接着，将细胞用21号抗体或283号抗体处理24小时，并使用报告物测定试剂盒(Promega，WI，USA)通过发光测量GLI1报告物活性(％)。重复上述步骤，不同之处在于，将SMO小分子抑制剂维莫德吉或erismodegib代替本发明的SMO抗体用作阳性对照。

3、结论

图12显示了本发明的SMO抗体在NIH3T3-GLI细胞中的Gil1报告物活性(％)。具体而言，GLI是hedgehog信号转导通路中的下游信号转导成分，并从用不同物质处理过的NIH3T3-GLI细胞中分析了Gil1报告物活性，以确定GLI的转录调控能力。结果，发现使用本发明的抗体(21号抗体和283号抗体)比用维莫德吉或erismodegib处理的阳性对照显著抑制GLI的转录活性。本发明的SMO抗体的Gil1报告物活性在数值上比阴性对照组(IgG)低至少2倍，并且比常规SMO小分子抑制剂低1.5倍或类似。

证实了本发明的SMO抗体可有效抑制SHH诱导的GLI转录活性，表明在高SMO表达的细胞系中处理SMO抗体可抑制细胞生长。总之，预期使用本发明的SMO抗体可用于个性化治疗。

<实施例9>小鼠SMO抗体对结直肠癌细胞系中的细胞生长的抑制活性的测定

1、正常结直肠细胞和结直肠癌细胞系的培养

CCD-18Co(正常结直肠细胞)、HCT116、DLD-1、HCT16、Colo205和SW620细胞购自韩国细胞系库。将每种细胞系传代三次，并在60mm 96孔培养板(Falcon)中以1×10⁵/cm²的密度培养。每3天更换一半培养基。补充有青霉素-链霉素(100U/ml)和10％胎牛血清的RPMI1640用作培养基。在潮湿的5％CO₂培养箱(Forma，美国)中培养24小时。

2、SW620(con shRNA)和SW620(SMOshRNA)细胞的制备和培养

如下制备并培养SW620(con shRNA)细胞。SW620细胞被shRNA慢病毒颗粒(santacruz，MA，美国A)感染后，将1000个细胞接种在100mm皿中，并培养至少一周。通过用嘌呤霉素二盐酸盐进行菌落选择获得SMO shRNA稳定细胞，并通过蛋白质印迹法鉴定。在该实验例中，培养进行了24小时。

如下制备并培养SW620(SMOshRNA)细胞。SW620细胞被SMO shRNA慢病毒颗粒(santacruz，LS-40161-V，MA，美国A)感染后，将1000个细胞接种在100mm皿中，并培养至少一周。通过用嘌呤霉素二盐酸盐进行菌落选择获得SMO shRNA稳定细胞，并通过蛋白质印迹法鉴定。选择并使用了敲除菌落。在该实验例中，培养进行了24小时。

3、蛋白质印迹法

将每种细胞系在PRO-PREP蛋白提取溶液(Intron Biotechnology，首尔，韩国)中裂解。然后，使用前提取蛋白质并用BCA(Thermo Scientific，Rockford，IL，USA)进行定量。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，将其转移至PVDF膜(Millipore，Billerica，MA，美国)，并用5％脱脂奶封闭。此后，将封闭的蛋白质在4℃下用本发明的SMO抗体和β-肌动蛋白(SantaCruz，CA，美国)标记过夜。第二天，将蛋白质用TBST洗涤，并在室温下用山羊抗小鼠IgG-HRP(Santa Cruz)标记1小时。使用ECL检测试剂(Bionote，Hwaseong，韩国)确定蛋白质的表达水平。

4、WST-1测定

将结直肠癌细胞和正常细胞铺板在96孔板中24小时后，将不同浓度(0μg/ml和10μg/ml)的21号抗体(生产实施例1)和283号抗体(生产实施例2)添加到孔板中。24小时后，将细胞用WST-1溶液孵育4小时，并通过测量450nm的吸光度评估细胞生存力。

5、结论

图13中，(A)显示SMO在正常细胞和结直肠癌细胞中的表达，(B)显示用21号抗体(生产实施例1)和283号抗体(生产实施例2)处理后的细胞生存力，其分别是通过蛋白质印迹法和WST-1测定法测量的。

如图13所示，不管是否存在本发明的SMO抗体，正常结直肠细胞CCD-18Co的生长都没有实质性变化。相反，在表达SMO蛋白的HCT116和SW620 con shRNA细胞中用21号抗体和283号抗体处理抑制了细胞生长。即，当SMO蛋白的表达相对较低时，DLD-1和SW620 SMOshRNA细胞的取决于SMO抗体存在与否的生长变化是微不足道的。总之，本发明的SMO抗体对结直肠癌细胞的生长具有特异性抑制活性。

图14显示了通过WST-1测定法测量的用324号抗体(生产实施例3)、401号抗体(生产实施例4)和408号抗体(生产实施例5)处理后结直肠癌细胞的生存力。如图14所示，证实向结直肠癌细胞系HCT16以及Colo205和SW620细胞中添加SMO抗体(生产实施例3至5)抑制细胞生长。具体地，证实SMO抗体(生产实施例3)比SMO抗体(生产实施例4或5)在抑制细胞生长方面更加有效。

<实施例10>使用3D培养确定小鼠SMO抗体对结直肠癌细胞系中细胞生长的抑制活性

1、通过3D培养分析SMO抗体的作用

将Colo205、HCT116和SW620结直肠癌细胞以1×10⁴细胞/cm²的密度接种在96孔板中进行3D培养，并培养72小时。用10μg/ml的一种SMO抗体处理细胞(实施例1至5)。培养3天至4天后，加入WST-1溶液，然后孵育4小时。通过测量450nm处的吸光度评估细胞存活率(％)。

2、结论

图15显示在3D培养系统中用SMO抗体(生产实施例1至5)处理的HCT116细胞的图像，以确定抗体对细胞生长的抑制活性。图16显示了在用抗体(生产实施例1至5)处理后，通过WST-1测定法确定的抗体对不同结直肠癌细胞生长的抑制活性。

如图15和图16所示，使用3D培养系统证实了SMO抗体(生产实施例1至5)对结直肠癌细胞系HCT116以及Colo205和SW620细胞的生长的抑制作用。具体地，用SMO抗体(生产实施例1至5)处理结直肠癌细胞导致球体出芽。这种出芽导致细胞从外部被破坏。相反，对照(IgG)细胞保持其圆形。即，发现本发明的SMO抗体在抑制癌细胞生长而不影响正常细胞方面非常有效。

<实施例11>分析在本发明的SMO抗体存在下结直肠癌细胞中凋亡蛋白的表达谱

1、结直肠癌细胞系培养

HCT116结直肠癌细胞系购自韩国细胞系库。将结直肠癌细胞系传代三次，并在60mm培养板(Falcon)中以1×10⁵/cm²的细胞密度培养。每3天更换一半培养基。96孔培养板(Falcon)用于细胞毒性测试。补充有青霉素-链霉素(100U/ml)和10％胎牛血清的RPMI1640用作培养基。在潮湿的5％CO₂培养箱(Forma，美国)中进行培养。

2、蛋白质印迹法

确定添加SMO抗体是否增加了癌细胞的凋亡。为此，分析了凋亡相关标记蛋白PARP和胱天蛋白酶-9的切割形式。

首先，在24小时培养后，用各种浓度(0μg、5μg、10μg、20μg)的SMO抗体(生产实施例1或2)处理结直肠癌细胞系。24小时后，收获细胞并通过裂解提取蛋白质。通过SDS-PAGE电泳分离蛋白质，将其转移至PVDF膜(Millipore，Billerica，MA，美国)，并用5％脱脂奶封闭。此后，将c-PARP(细胞信号转导，MA，美国)、c-胱天蛋白酶-9抗体(细胞信号转导，MA，美国)和β-肌动蛋白(Santa Cruz，CA，美国)在4℃偶联过夜，第二天用TBST洗涤，并在室温下与山羊抗小鼠IgG-HRP抗体(Santa Cruz)偶联1小时。使用ECL检测试剂(Bionote，Hwaseong，韩国)确定蛋白质的表达水平。

3、结论

图17显示了用各种浓度的SMO抗体处理的结直肠癌细胞系HCT116的蛋白质印迹结果，以分析凋亡相关PARP和胱天蛋白酶-9的切割形式的表达。如图17所示，用SMO抗体处理后，随着结直肠癌细胞系HCT116中的21号抗体和283号抗体的浓度增加，凋亡蛋白的表达量增加。这些结果得出结论，本发明的SMO抗体也诱导癌细胞的凋亡。

<实施例12>SMO抗体(生产实施例1)对于耐奥沙利铂的结直肠癌细胞系和耐西妥昔单抗的结直肠癌细胞系的抗癌作用分析

1、耐奥沙利铂的结直肠癌细胞系和耐西妥昔单抗的结直肠癌细胞系的培养

用低浓度至高浓度的抗癌药治疗耐奥沙利铂的结直肠癌细胞系DLD-1R^oxa和耐西妥昔单抗的结直肠癌细胞系SW48R^cet。培养经处理的细胞系。

2、抗癌作用分析(WST-1分析)

将耐奥沙利铂的结直肠癌细胞系和耐西妥昔单抗的结直肠癌细胞系接种在96孔板中，培养24小时，并用各种浓度(0μg/ml和10μg/ml)的21号抗体处理(生产实施例1)。24小时后，将细胞用WST-1溶液孵育4小时，并通过测量450nm的吸光度评估细胞生存力。

3、结论

图18显示了在用各种浓度的SMO抗体处理后，通过WST-1测定法确定的，SMO抗体(生产实施例1)对于耐奥沙利铂的结直肠癌细胞系(DLD-1R^oxa)和耐西妥昔单抗的结直肠癌细胞系(SW48R^cet)的生长的抑制活性。如图18所示，用21号抗体处理后，耐奥沙利铂的结直肠癌细胞系和耐西妥昔单抗的结直肠癌细胞系的存活率显著降低至40％至60％。

总之，本发明的SMO抗体对现有的耐药癌细胞具有抗癌活性。

<实施例13>使用结直肠癌细胞系HC116-Luc分析SMO抗体(生产实施例1)对异种移植小鼠模型中的肿瘤的抑制活性

1、异种移植动物模型

在该实验中，将6周龄的BALB/c-nu/nu雌性小鼠用作实验动物。将1×10⁶HCT116-Luc细胞注射到小鼠的皮下脂肪中(n＝6)以生成异种移植肿瘤动物模型。一周后，肿瘤大小达到250mm³至300mm³。

2、实验步骤

首先，当异种移植动物模型的肿瘤大小为250mm³至300mm³时，每天一次将0mg/kg(对照)、10mg/kg和20mg/kg的SMO抗体(生产实施例1)每天一次注射到肿瘤组织中，持续6天。每3天测量肿瘤大小。大约一个月后，使用体内成像系统测量萤光素酶活性。处死动物模型并切除肿瘤组织。

3、结论

图19示出了(A)施用0mg/kg(对照)、10mg/kg和20mg/kg SMO抗体(生产实施例1)的异种移植动物模型的荧光显微镜图像，(B)施用0mg/kg(对照)、10mg/kg和20mg/kg的SMO抗体(生产实施例1)的异种移植动物模型的光学显微镜图像，(C)在施用0mg/kg(对照)、10mg/kg和20mg/kg SMO抗体(生产实施例1)后约1个月从异种移植动物模型切除的肿瘤组织的照片图像，(D)异种移植动物模型中肿瘤体积的时间依赖性变化。

如图19所示，通过施用10mg/kg和20mg/kg的SMO抗体(生产实施例1)，异种移植动物模型中的肿瘤尺寸减小到小于对照组的肿瘤尺寸的一半。总之，本发明的SMO抗体在抑制肿瘤生长和转移方面基本上是有效的。

<实施例14>人源化SMO抗体对GLI的抑制活性的测定

1、NIH3T3-GLI细胞系培养

GLI报告物-NIH3T3细胞系购自BPS Bioscience(CA，美国)。

2、NIH3T3-GLI报告物检测

将具有GLI转录活性的NIH3T3-GLI细胞以1.5×10⁴细胞/cm²的密度2％BCS接种在96孔板中后，用Sonic hedgehog肽处理。15小时后，用不同浓度(10μg/ml和20μg/ml)的人源化抗体5号(生产实施例6)、7号(生产实施例7)、15号(生产实施例8)、16号(生产实施例9)和17号(生产实施例10)处理细胞的每种处理6小时。使用报告物分析试剂盒(Promega，WI，USA)，通过荧光法测量GLI1报告物活性(％)。重复上述步骤，不同之处在于，将SMO小分子抑制剂vismodegib或erismodegib代替本发明的SMO抗体用作阳性对照。

3、结论

图20显示了NIH3T3-GLI细胞中人源化SMO抗体的GLI报告物活性(％)。在图20中，标出了人源化SMO抗体的数量和浓度。例如，“SMO 5-10”表示用10μg/ml的5号人源化SMO抗体进行处理。

具体而言，GLI是hedgehog信号转导通路中的下游信号转导成分，并分析了用不同物质处理过的NIH3T3-GLI细胞中的GLI报告物活性，以确定GLI的转录调控能力。结果，发现不仅用维莫德吉或erismodegib治疗的阳性对照，而且除了5号人源化SMO抗体外，本发明的7号、15号、16号和17号人源化SMO抗体的使用显著抑制了GLI的转录活性。在数值上嵌合抗体和小鼠抗体的GLI报告物活性类似。从杂交瘤细胞中收集小鼠抗体，然后在生产实施例6中转化为人源化抗体。

证实了本发明的人源化SMO抗体(5号、7号、15号、16号和17号)可有效抑制SHH诱导的GLI转录活性，表明在高SMO表达的细胞系中人源化SMO抗体处理可抑制细胞生长。总之，预期使用本发明的人源化SMO抗体(5号、7号、15号、16号和17号)可用于个性化治疗。

<实施例15>人源化SMO抗体在hedgehog过表达的细胞系中对GLI1的抑制作用

1、HCT116细胞系培养和抗体处理

HCT116细胞系购自韩国细胞系库。将细胞以5×10⁵细胞/cm²的密度接种在100孔板中24小时后，在无血清培养基中分别用不同浓度(10μg/ml和20μg/ml)的人源化SMO抗体5号、7号、15号、16号和17号进行处理。

2、蛋白质的分离

在加入了蛋白酶的裂解缓冲液(7M尿素、2M硫脲、4％CHAPS、40mM Tris、100mMDTT)中通过机械均质化和超声处理的组合破坏细胞，然后在15000rpm和4℃下离心20分钟。上清液中的蛋白质通过二辛可酸(BCA)分析用NanoDrop定量。

3、蛋白质印迹法

从收集的组织中分离出的30μg蛋白质经过电泳，转移到PVDF膜上，用抗GLI1抗体(细胞信号转导，MA，美国)、抗SMO抗体(Santa Cruz，CA，美国)和抗β-肌动蛋白抗体作为一抗标记，并将缀合有HRP的抗兔抗体作为二抗标记，并通过化学发光染色检测。通过增强化学发光(ECL)方法测量SMO蛋白的表达水平。

4、结论

图21显示了HCT116细胞系的蛋白质印迹结果的图像。如图21所示，发现用7号、15号、16号和17号人源化SMO抗体处理可降低GLI1和SMO蛋白的表达水平。

<实施例16>在结直肠癌细胞系中通过人源化SMO抗体的细胞增殖测定

1、WST-1方法

将结直肠癌细胞和正常细胞接种在96孔板中24小时后，添加不同浓度(0μg/ml、10μg/ml和20μg/ml)的7号、15号、16号和17号人源化SMO抗体。24小时后，将细胞与WST-1溶液孵育4小时，并通过测量500nm的吸光度评估细胞生存力。

2、结论

图22显示了WST-1测定法测定的用(a)7号人源化SMO抗体、(b)15号人源化SMO抗体、(c)16号人源化SMO抗体和(d)17号人源化SMO抗体处理的正常细胞和结直肠癌细胞的增殖。

如图22所示，无论是否存在人源化SMO抗体，均未观察到正常结直肠细胞(CCD-18Co)和结直肠癌细胞(DLD-1，HCT116)的生长有实质性变化。总之，本发明的人源化SMO抗体不影响结直肠癌细胞的增殖。

<实施例17>HCT116细胞系中的通过人源化SMO抗体的细胞生存力测定

1、Transwell迁移分析

将HCT116细胞系铺板在transwell中后，分别以10μg/ml的浓度添加7号、15号、16号和17号人源化SMO抗体。48小时后，使用Diff-Quik试剂盒测量细胞迁移性。

2、结论

图23a显示了用7号、15号、16号和17号人源化SMO抗体处理的HCT116细胞系的运动性。图23b显示了用7号、15号、16号和17号人源化SMO抗体处理的HCT116细胞系的光学显微镜图像，这些图像是在固定细胞并将其染色以测量其实用性之后拍摄的。如图23所示，与使用维莫德吉或erismodegib的治疗(阳性对照)相比，使用本发明的16号和17号抗体可显著抑制细胞迁移。这些结果表明，人源化的SMO抗体7号、15号、16号和17号抑制了细胞中GLI1和SMO蛋白的表达，导致细胞迁移性降低。总之，本发明的人源化SMO抗体可以有效地抑制癌症转移。

特别是，人源化SMO抗体16号和17号显示出通过抑制GLI1降低细胞迁移性的最高活性，表明它们对癌症转移的抑制活性最高。

尽管已经详细描述了本发明的细节，但是对于本领域技术人员而言显而易见的是，这些细节仅是优选的实施方案，并不意图限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围由所附权利要求及其等同物限定。