一种epb41l5的表位及单克隆抗体
阅读说明：本技术 一种epb41l5的表位及单克隆抗体 (Epitope and monoclonal antibody of EPB41L5 ) 是由 崔敬喆 尹昊勤 郑裁镐 郑美贤 于 2019-08-08 设计创作，主要内容包括：本公开鉴定了TGF-β/Smad3/EPB41L5分子对癌细胞的作用机理,并且发现EPB41L5的过表达与癌症患者的总体生存率低相关,表明EPB41L5是潜在的癌症预后标记物。因此,本公开指定了能够将EPB41L5识别为抗原的EPB41L5的表位,并且涉及了特异性结合到所述表位的抗体或其片段。本公开的抗体可以用作EPB41L5相关癌症的有效治疗药物。(The present disclosure identifies the mechanism of action of TGF- β/Smad3/EPB41L5 molecules on cancer cells and finds that overexpression of EPB41L5 correlates with low overall survival of cancer patients, indicating that EPB41L5 is a potential prognostic marker for cancer. Accordingly, the present disclosure specifies an epitope of EPB41L5 capable of recognizing EPB41L5 as an antigen, and relates to an antibody or a fragment thereof that specifically binds to the epitope. The antibodies of the present disclosure may be used as effective therapeutic agents for EPB41L 5-related cancers.)
技术领域
本公开涉及一种EPB41L5(EPB41L5红细胞膜带4.1蛋白类似物5)蛋白的表位和与其特异性结合的单克隆抗体。
背景技术
癌症是一种非常致命的疾病，它可以导致组织细胞异常且无限增殖而形成阻止器官发挥正常功能的肿瘤，进而威胁个体的生命。2017年，韩国人的第一大死亡原因是恶性肿瘤(癌症)，癌症引起的死亡占总死亡人数的27.6％。
在癌症疾病中，胃癌是最主要的死亡原因之一。特别是，转移性胃癌是世界上已知的5年生存率低于30％的恶性疾病。虽然已经进行了与治疗这种转移性胃癌的新生物标记物相关的研究，但是转移性胃癌的具体发病机制仍不清楚。
迄今为止开发的靶向治疗药物包括HER2靶向治疗药物、VEGFR2靶向治疗药物等。尤其是，Genetec/Roche公司发现HER2与乳腺癌、卵巢癌或胃癌的不良预后有关，因此Genetec/Roche公司开发了一种人源化单克隆抗体(赫赛汀或曲妥珠单抗)，所述抗体可结合HER2/neu的胞外结构域。此外，赫赛汀/曲妥珠单抗是目前在全球销售的畅销药物，仅在2011年上半年就在美国创下了9.5亿美元的销售额。然而，众所周知，赫赛汀/曲妥珠单抗的缺点在于，除乳腺癌之外，对其他显著过表达HER2/neu的癌症没有临床效果，并且长期服用赫赛汀/曲妥珠单抗的患者对赫赛汀/曲妥珠单抗有耐药性。
因此，需要识别与癌症生长和转移相关的生物分子，并能够通过靶向这些生物分子来发现控制癌症生长和转移的新的癌症靶向治疗的生物标记。
上述“背景技术”部分中公开的信息仅用于增强对本公开背景的理解，并不应被视为承认所述信息形成了本领域技术人员已知的常规技术。
发明内容
技术问题
本公开的一个目的是提供一种选自EPB41L5(EPB41L5红细胞膜带4.1蛋白类似物5)蛋白的第619～624个氨基酸残基的1～6-聚体表位，所述EPB41L5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本公开的另一个目的是提供一种单克隆抗体或其片段，所述单克隆抗体将EPB41L5蛋白识别为抗原并与其特异性结合，所述EPB41L5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
本公开的另一个目的是提供一种编码单克隆抗体或其片段的核酸分子及包含所述核酸分子的载体。
本公开的另一个目的是提供一种用于预防或治疗癌症的疫苗组合物，所述疫苗组合物包括以下活性成分：选自由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的EPB41L5(EPB41L5红细胞膜带4.1蛋白类似物5)蛋白的第619～624个氨基酸残基的1～6-聚体表位；编码所述表位的核酸分子；或包含所述核酸分子的载体。
本公开的另一个目的是提供一种用于预防、缓解或治疗癌症的药物组合物，所述药物组合物包括作为活性成分的上述的单克隆抗体或其片段；编码所述单克隆抗体或其片段的核酸分子；或包含核酸分子的载体。
本公开的另一个目的是提供一种为诊断由EPB41L5过表达引起的疾病提供信息的方法。
本公开的其他目的和优点将通过以下对本公开的详细描述、所附权利要求和附图更清楚地理解。
技术方案
本发明人发现，与正常对照组相比，EPB41L5(EPB41L5红细胞膜带4.1蛋白类似物5)蛋白的过表达与癌症生长和转移有关，并做出了大量的工作以寻找新的癌症靶向治疗的生物标记，通过靶向EPB41L5蛋白来控制癌症的生长和转移。结果，本发明人已鉴定出通过转化生长因子β(TGF-β)-EPB41L5信号传导抑制癌症恶化和转移的EPB41L5蛋白的表位，从而完成本公开。
根据本公开的一个方面，本公开提供了一种选自EPB41L5(红细胞膜带4.1蛋白类似物5)蛋白的第619～624个氨基酸残基的1～6-聚体表位，所述EPB41L5蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
在本公开中，EPB41L5蛋白可由SEQ ID NO:1表示，其序列信息可在基因库(GenBank)登录号为NM_020909中找到。
在本公开中，EPB41L5(红细胞膜条带4.1蛋白类似物5)蛋白属于红细胞膜条带4.1蛋白超家族的NBL4亚族，其N端具有FERM结构域，C末端具有非同源序列。
在本说明书中，术语“表位”是指可与抗体或其片段特异性结合的抗原的局部区域。表位通常由氨基酸或糖侧链等分子的表面基团组成，通常具有特定的三维结构特征以及特定的电荷特征，构象表位和非构象表位的区别在于，在变性溶剂存在下，与构象表位结合而不是非构象表位的丢失。表位可包括直接参与结合的氨基酸残基(也称为表位的免疫显性成分)和不直接参与结合的其他氨基酸残基，例如被特异性抗原结合肽有效阻断的氨基酸残基(即氨基酸残基在特异性抗原结合肽的结合区域内)。
在本公开中，所述表位可包含EPB41L5蛋白的619、620、621、622、623和624位氨基酸残基中的任何一个或多个氨基酸。
在本公开中，所述表位可由EPB41L5蛋白的第619～624个氨基酸组成，优选由SEQID NO:2表示的氨基酸序列组成，但不限于此。
在本公开中，当含有上述位置氨基酸的表位用于疫苗或组合物时，可与载体结合使用，以保持其结构。尽管本公开中的载体不受特别限制，只要其具有生物相容性并且可在本公开中达到预期效果即可，但其优选地选自肽、血清白蛋白、免疫球蛋白、血蓝蛋白和多糖。
根据本公开的另一方面，本公开提供了一种单克隆抗体或其片段，所述抗体或其片段识别由SEQ ID NO:1表示的EPB41L5蛋白作为抗原并与其特异性结合。
根据本公开的优选实施例，本公开的抗体或其片段可与从EPB41L5蛋白的第619～624个氨基酸中选择的1～6-聚体表位结合。
上皮细胞间质转化(EMT)是胃癌转移的主要原因，许多研究报道转化生长因子β(TGF-β)信号通路调控上皮细胞间质转化。转化生长因子β(TGF-β)配体通过丝氨酸/苏氨酸激酶转化生长因子β(TGF-β)受体Ⅱ与转化生长因子β(TGF-β)受体Ⅰ结合。转化生长因子β(TGF-β)受体二聚体被Smad2/3磷酸化激活，然后，磷酸化Smad2/3与共享型Smad(Smad4)结合，这种蛋白复合物进入细胞核并调节上皮细胞间质转化相关基因，如PAI-1、ZEB1、Slug等。有研究表明，TGF-β1在胃癌患者的粘膜、血清和组织中表达增强，且TGF-β1的过表达与胃癌患者的低生存率有关。
在本公开中，通过寡核苷酸微阵列分析和Kaplan-Meier生存分析证实了，当EPB41L5基因及其编码的蛋白质的表达水平较高时，癌症患者的生存率较低。此外证实了，TGF-β1增加了四种胃癌细胞系(KATOIII、MKN28、SNU1和SNU719)中EPB41L5的mRNA和蛋白表达，并且TGF-β1诱导的EPB41L5表达增加由Smad依赖性转化生长因子β(TGF-β)信号调节。转化生长因子β(TGF-β)信号诱导的EPB41L5蛋白表达增加可能通过与细胞粘附分子p120-连环蛋白相互作用影响肿瘤转移。因此，本公开的单克隆抗体或其片段特异性地结合表位，所述表位是在形成EPB41L5/p120-连环蛋白复合物时结合的氨基酸序列，因此所述单克隆抗体或其片段可以通过有效抑制EPB41L5/p120-连环蛋白复合物的形成而非常有效地抑制癌症的发生、转移或生长。
根据本公开的一个优选实施例，单克隆抗体及其片段特异性地与SEQ ID NO:1所示的EPB41L5结合，并阻断EPB41L5和p120-连环蛋白之间的相互作用。尽管单克隆抗体及其片段并没有特别限定，只要应用由SEQ ID NO:1所示的EPB41L5蛋白作为抗原产生即可，其最优选但不限于应用SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列作为抗原产生。
在本说明书中，术语“表位”是指可与抗体或其片段特异性结合的抗原的局部区域。例如，抗原多肽的连续氨基酸可以作为表位，或者多肽三级折叠的两个或多个非连续区域可以一起作为表位。表位可包含抗原独特三维结构中的至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个、至少11个、至少12个、至少13个、至少14个或至少15个连续或非连续氨基酸。本公开中的抗体或其片段将EPB41L5识别为抗原并与其特异性结合。具体而言，抗体或其片段可特异性地与选自EPB41L5的第619～624个氨基酸残基中的1～6-聚体表位结合，并且所述表位可包含一个或多个氨基酸。
确定给定抗体结合的表位的方法(例如，表位作图)包括，例如基于抗体反应性测试的免疫印迹和免疫沉淀测试的各种方法。确定表位的三维空间结构有x射线晶体学、二维核磁共振法和HDX-MS等多种方法(分子生物学方法中的表位作图方案(Epitope MappingProtocols in Methods in Molecular Biology)，第66卷，G.E.Morris，Ed.(1996))。
根据本公开的优选实施例，可通过核磁共振谱(NMR)、X射线衍射晶体学、酶联免疫吸附测定法(ELISA)、氢/氘交换质谱(HDX-MS)、基于阵列的寡肽扫描分析法和/或突变图谱(Giege R et al.,(1994)Acta Crystallogr D Biol Crystallogr 50(Pt 4):339-350；McPherson A(1990)Eur J Biochem 189:1-23；Chayen NE(1997)Structure 5:1269-1274；McPhersonA(1976)J Biol Chem 251:6300-6303)来测定可与本公开的抗体或其片段结合的表位。
如本文所用，术语“抗体”可以是免疫球蛋白分子中的任何类型的抗体(例如IgG、IgE、IgM、IgD、IgA或IgY)，或者可以是任何同种类型的抗体(例如人源IgG1、IgG2、IgG3和IgG4；鼠源IgG1、IgG2a、IgG2b和IgG3)。免疫球蛋白(例如IgG1)可以以几种异型存在，并且本文所使用的术语“抗体”包括公知的同种型和同种异型。此外，本文中使用的术语“抗体”可以是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或其杂合(例如，IgG2和IgG4的杂合)。
如本文所用，术语“单克隆抗体”是指对特定表位显示单一结合特异性和亲和力的抗体。
本公开的单克隆抗体可以通过例如Kohler等在《自然》256、495(1975)中首次描述的杂交瘤方法或通过重组DNA方法制备。此外，可使用例如Clackson等在《自然》352，624-628(1991)和Marks等在《分子细胞生物学杂志》222,581-597(1991)中描述的技术从噬菌体抗体库中分离单克隆抗体。单克隆抗体可以从任何合适的来源获得。本公开中的单克隆抗体可从表达EPB41L5抗原的细胞产生的杂交瘤获得，或从用编码EPB41L5抗原的核酸形式的目的抗原免疫小鼠获得的细胞获得。单克隆抗体也可由免疫人类或非人类哺乳动物(例如大鼠、狗、灵长类动物等)的抗体表达细胞衍生的杂交瘤中获得。
在本说明书中，所述单克隆抗体的应用包括其片段的应用，并且所述片段优选抗原结合片段。可以使用本领域已知的各种方法来生产片段。例如，Fab片段和F(ab')2片段可通过使用酶，例如木瓜蛋白酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生(F(ab')2片段)，对免疫球蛋白分子蛋白进行水解裂解而产生。
如本文所用，术语“片段”可以是Fab、Fab'，F(ab')2、Fv、单链Fv(scFv)或含有单体结构(VH或VL结构域)的sdAb片段，并且所述片段在本领域是众所周知的。
在本公开中，所述抗体可以是但不限于嵌合抗体、人源化抗体、二价双特异性分子、微聚体(minibody)、结构域抗体、双特异性抗体、抗体模拟物、双链抗体、三聚体、四聚体或其片段。
在本公开中，所述“嵌合抗体”是通过重组小鼠抗体的可变区和人类抗体的恒定区获得的抗体，并且与小鼠抗体相比，免疫力显著提高。
此外，在本公开中，所述“人源化抗体”是指通过修饰源自非人类物种的抗体的蛋白质序列而获得的抗体，以便与人类自然产生的抗体变体的蛋白质序列相似。例如，可通过将鼠源CDR与人源性抗体FR重组以产生人源化可变区，并与所需的人源抗体的恒定区重组来产生人源化抗体。
本公开的单克隆抗体或其片段可抑制由EPB41L5基因或其编码的蛋白质介导的癌症的生长和转移相关的生理效应。具体而言，鉴定出肿瘤中TGF-β1表达增加，通过TGF-β1增加EPB41L5蛋白的表达水平，但EPB41L5蛋白的表达水平由Smad依赖的转化生长因子β(TGF-β)信号调节。也就是说，TGF-β1诱导的EPB41L5蛋白表达水平的升高通过上皮细胞间质转化影响肿瘤的转移和侵袭，并且，通过用包含上述抗原结合蛋白的单克隆抗体或其片段处理，可非常有效地抑制由EPB41L5蛋白介导的细胞信号传导。
如本文所用，与不接触本公开的单克隆抗体或其片段的相同细胞的生长相比，表达“抑制生长”旨在包括与本公开的单克隆抗体或其片段接触的细胞生长的任何可测量的减少，例如，对细胞培养物的生长抑制约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或100％。细胞生长的减少可能是由多种机制引起的。
如本文所述，单克隆抗体或其片段包含一个或多个CDR(例如，1、2、3、4、5或6个CDR)。与作为抗原的EPB41L5蛋白结合的单克隆抗体或其片段是包含一个或多个互补决定区(CDR)的多肽。在抗原结合蛋白中，将所述CDR定向以获得CDR的适当抗原结合特性。一般而言，本文提供的抗原结合蛋白可干扰、阻断、减少或调节EPB41L5与p120-连环蛋白之间的相互作用。也就是说，抗原结合蛋白可以通过抑制受试者中EPB41L5/p120-连环蛋白复合物的形成来抑制TGF-β1介导的癌症转移和生长。
在本公开中，单克隆抗体或其片段可包括但不限于：
一种重链可变区，包含由SEQ ID NO:6表示的重链CDR1、由SEQ ID NO:7表示的重链CDR2和由SEQ ID NO:8表示的重链CDR3；以及一种轻链可变区，包含由SEQ ID NO:9表示的轻链CDR1、由SEQ ID NO:10表示的轻链CDR2和由SEQ ID NO:11表示的轻链CDR3。
在本公开中，单克隆抗体或其片段可包括但不限于：
由SEQ ID NO:12表示的重链可变区和由SEQ ID NO:13表示的轻链可变区。
重链可变区(VH)或其一个或多个CDR可链接到恒定区以形成重链。类似地，轻链可变区(VL)或其一个或多个CDR可链接到恒定区以形成轻链。全长重链和全长轻链结合形成全长抗体。
在本公开中，如上所述，与选自由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的EPB41L5蛋白的第619～624个氨基酸残基的1～6-聚体表位结合的单克隆抗体或其片段，特异性地与SEQID NO:1所示的EPB41L5结合，从而表现出阻断EPB41L5与p120-连环蛋白相互作用的效果。
在本公开中，所述单克隆抗体或其片段可用于疾病的治疗。具体而言，可以抑制、控制或调节EPB41L5基因或其编码的蛋白质的一个或多个生物活性，并且可以特异性地与EPB41L5蛋白结合，从而通过与可与EPB41L5蛋白结合的蛋白质(例如TGF-β1)的竞争性结合，而基本上抑制EPB41L5蛋白诱导的细胞信号传导。因此，单克隆抗体或其片段可非常有效地用于治疗。
免疫球蛋白链的可变区通常表现出相同的整体结构，包括由三个高变区(通常称为“互补决定区”或CDR)连接的相对保守的框架区(FR)。来自上述每个重链/轻链对的两条链的CDR通常通过框架区排序，以形成与靶蛋白(例如PCSK9)上的特定表位特异结合的结构。从N-端到C-端，天然存在的轻链和重链可变区通常都符合这些因素的以下顺序：FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3和FR4。为了给占据这些结构域中每个位置的氨基酸分配编号，人们设计了一种编号系统，所述编号系统在Kabat免疫蛋白序列数据库(1987和1991，NIH，Bethesda，MD)或Chothia和Lesk，1987，J.分子细胞生物学杂志.196:901-917；Chothia等，1989，自然342:878-883中均有介绍。
本文可以提供各种重链和轻链可变区，并且如上所述，这些可变区中的每一个可以连接到上述重链和轻链恒定区以分别形成完整的抗体重链和轻链。此外，每个所形成的重链和轻链序列均可组合形成完整的抗体结构。
本公开的单克隆抗体或其片段可包括氨基酸序列的变体，只要其可特异性结合到EPB41L5。例如，可修饰抗体的氨基酸序列，以提高抗体的结合亲和力和/或其它生物学特性。此类修饰包括例如抗体的氨基酸序列中的一个或多个残基的缺失、插入和/或替换。
此类氨基酸变体基于氨基酸侧链取代基的相对相似性，例如，它们的疏水性、亲水性、电荷、大小等。对氨基酸侧链取代基的大小、形状和类型的分析表明，精氨酸、赖氨酸和组氨酸残基均带正电荷；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸都具有相似的尺寸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸都具有相似的形状。因此，基于这些考虑，精氨酸、赖氨酸和组氨酸；丙氨酸、甘氨酸和丝氨酸；苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸；可被定义为生物学功能等效物。
为了引入变体，可以考虑氨基酸的亲水指数。每种氨基酸都根据其疏水性和电荷特性被赋予了一个亲水指数，如下所示：异亮氨酸(+4.5)；缬氨酸(+4.2)；亮氨酸(+3.8)；苯丙氨酸(+2.8)；半胱氨酸/胱氨酸(+2.5)；蛋氨酸(+1.9)；丙氨酸(+1.8)；甘氨酸(-0.4)；苏氨酸(-0.7)；丝氨酸(-0.8)；色氨酸(-0.9)；酪氨酸(-1.3)；脯氨酸(-1.6)；组氨酸(-3.2)；谷氨酸(-3.5)；谷氨酰胺(-3.5)；天冬氨酸(-3.5)；天冬酰胺(-3.5)；赖氨酸(-3.9)；精氨酸(-4.5)。亲水性氨基酸指数在赋予蛋白质交互生物功能中的重要性在本领域中被普遍理解。众所周知，某些氨基酸可以被具有相似亲水指数的氨基酸取代，并仍然保持相似的生物活性。为了参照亲水指数引入变体，替换的氨基酸之间的亲水指数差的范围优选为±2、较优选为±1、更优选为±0.5。
同时，众所周知，具有相似亲水性值的氨基酸之间的取代产生具有等效生物活性的蛋白质。如专利号为4,554,101的美国专利所公开的以下氨基酸残基的亲水指数：精氨酸(+3.0)；赖氨酸(+3.0)；天冬氨酸(+3.0±1)；谷氨酸(+3.0±1)；丝氨酸(+0.3)；天冬酰胺(+0.2)；谷氨酰胺(+0.2)；甘氨酸(0)；苏氨酸(-0.4)；脯氨酸(-0.5±1)；丙氨酸(-0.5)；组氨酸(-0.5)；半胱氨酸(-1.0)；蛋氨酸(-1.3)；缬氨酸(-1.5)；亮氨酸(-1.8)；异亮氨酸(-1.8)；酪氨酸(-2.3)；苯丙氨酸(-2.5)；色氨酸(-3.4)。为了参照亲水指数引入变体，替换的氨基酸之间的亲水指数差的范围优选为±2、较优选为±1、更优选为±0.5。
本领域公知，蛋白质中的氨基酸交换通常不会改变分子的活性(H.Neurath，R.L.Hill，the proteins，Academic Press，NewYork(1979))。最常见的交换是氨基酸残基Ala/Ser、Val/Ile、Asp/Glu、Thr/Ser、Ala/Gly、Ala/Thr、Ser/Asn、Ala/Val、Ser/Gly、Tyr/Phe、Ala/Pro、Lys/Arg、Asp/Asn、Leu/Ile、Leu/Val和Gln/Glu之间的交换。
考虑到上述具有生物等效活性的变体，可以解释为本公开的结合分子还包括与序列表中所述序列显示出实质相同的序列。
如本文所用，术语“实质相同”是指显示至少61％同源性、更优选70％同源性、甚至更优选80％同源性、最优选90％同源性的序列，所述序列是通过将本公开的序列与任何其他序列进行比对以尽可能彼此对应，并使用本领域中常用的算法来分析比对来确定。用于序列比对的方法是本领域已知的。史密斯(Smith)和沃特曼(Waterman)公开了用于比对的各种方法和算法。Adv.Appl.Math.2:482(1981)；Needleman andWunsch,J.Mol.Bio.48:443(1970)；皮尔森(Pearson)和利普曼(Lipman)，Methods in Mol.Biol.24:307-31(1988)；Higgins and Sharp,Gene 73:237-44(1988)；希金斯(Higgins)和夏普(Sharp)，基因73:237-44(1988)；Higgins and Sharp,CABIOS 5:151-3(1989)；科佩特(Corpet)等人，Nuc.Acids Res.16:10881-90(1988)；Huang等人，Comp.Appl.BioSci.8:155-65(1992)和Pearson等人，Meth.Mol.Biol.24:307-31(1994)。NCBI局部比对搜索基本工具(BLAST)(Altschul等人，J.Mol.Biol.215:403-10(1990))可从NCBI(美国国家生物技术信息中心)获得，并可与互联网上的测序程序(如blastp,blasm,blastx,tblastn和tblastx,)结合使用。BLAST可在http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST进行。应用此程序，序列同源性比较方法可以在线进行(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/blast_help.html).
在本公开中，尽管结合分子(优选抗体)可通过产生抗体的常规方法产生，但其可通过亲和力成熟产生。
如本文所用，术语“亲和力成熟”是指免疫应答过程中活化的B细胞产生对抗原亲和力增强的抗体的过程。出于本公开的目的，所述亲和力成熟可以基于突变和选择的原则，在自然界中发生的相同过程中，由于亲和力成熟而产生抗体或抗体片段。
根据本公开的另一方面，本公开提供了：编码单克隆抗体或其片段的核酸分子；包含所述核酸分子的载体；以及包含所述载体的宿主细胞。
本公开的核酸分子可以是分离的或重组的核酸分子。这种核酸分子包括单链和双链DNA和RNA及其相应的互补序列。“分离的核酸”可以从天然来源中分离出来。在这种情况下，分离出的核酸与分离出核酸的受试者基因组中存在的外周基因序列分离。分离的核酸可以理解为由模板酶促或化学合成的核酸，例如PCR产物、cDNA分子或寡核苷酸。在这种情况下，从此过程中产生的核酸可以理解为分离的核酸分子。分离的核酸分子代表以单独片段形式存在的核酸分子或作为较大核酸构建体的组分存在的核酸分子。当一个核酸与另一个核酸序列以功能关系排列时，它是“可操作连接”。例如，在作为前蛋白表达时，前序列或分泌先导的DNA(即分泌前多肽)与多肽的DNA“可操作连接”。当其被排列以促进翻译时，将影响多肽序列转录的启动子或增强子可操作地连接到编码序列，或者将核糖体结合位点可操作地连接到编码序列。一般来说，术语“可操作连接”是指要连接的DNA序列彼此相邻。就分泌先导而言，术语“可操作链接”是指分泌先导在同一先导框架中相邻。然而，增强子并不位于相邻的位置。连接是通过在方便的限制性内切酶位点进行连接。在所述位点不存在的情况下，根据常规方法使用合成寡核苷酸适配子或连接子。
如本文所用，术语“载体”是指可插入核酸序列以导入细胞的载体，在所述细胞中可被复制，核酸序列可以是外源的或者说异源的。
如本文所用，术语“表达载体”是指含有编码能够被转录的基因产物的至少一部分核酸序列的载体。在某些情况下，RNA分子被翻译成蛋白质、多肽或肽。表达载体可包含多种控制序列。除了调控转录和翻译的控制序列之外，载体和表达载体还可以包含提供其他功能的核酸序列。
在本公开的具体实施例中，表达载体可选自商业上广泛使用的pCDNA载体、F、R1、RP1、Col、pBR322、ToL、Ti载体；粘性质粒；噬菌体，如λ噬菌体(lambda)、λ形噬菌体(lambdoid)、M13、Mu、p1、P22、Qμ、T-even、T2、T3、T7等；植物病毒，但不限于此。本公开中可以使用本领域技术人员已知的任何表达载体，并且表达载体的选择取决于所选择的宿主细胞的性质。将载体导入宿主细胞可以通过但不限于磷酸钙转染、病毒感染、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质体转染或电穿孔，并且本领域技术人员可以选择和使用适用于所使用的表达载体和宿主细胞的导入方法。优选地，所述载体包含但不限于一个或多个选择性标签，并且不包含选择性标签的载体也可用于确定是否已产生产物。所述选择性标签的选择可以取决于但不限于所选择的宿主细胞，因为所述选择是使用本领域技术人员已知的方法来进行的。
为了促进本公开核酸分子的纯化，可将标签序列插入并融合到表达载体中。标签的示例包括但不限于六组氨酸标签、血凝素标签、myc标签或标记标签。本公开中可以使用本领域技术人员已知的任何有助于纯化的标签。
如本文所用，术语“宿主细胞”包括真核生物和原核生物，并指能够复制载体或表达由载体编码的基因的任何可转化生物体。宿主细胞可被载体转染或转化。所述转染或转化是指将外源性核酸分子转移或导入宿主细胞的过程。
本公开的宿主细胞的优选实例包括但不限于细菌细胞、CHO细胞、HeLa细胞、HEK293细胞、BHK-21细胞、COS7细胞、COP5细胞、A549细胞、NIH3T3细胞等。
根据本公开的另一方面，本公开提供了一种用于预防或治疗癌症的疫苗组合物，所述疫苗组合物含有以下活性成分：选自由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的EPB41L5(EPB41L5红细胞膜带4.1蛋白类似物5)蛋白的第619～624个氨基酸残基的1～6-聚体表位；编码所述表位的核酸分子；或包含所述核酸分子的载体。
在本公开的疫苗组合物中，与EPB41L5、表位、核酸分子和载体相关的内容与上述内容相同，因此省略其描述以避免本说明书过于复杂。
所述疫苗可以是活疫苗、减毒疫苗或者灭活疫苗，疫苗可以直接应用或者辅助应用。
本公开的疫苗组合物可通过主动免疫诱导对EPB41L5的免疫应答以及全身性免疫应答来预防或治疗癌症。主动免疫是指当病原体入侵时，生物体通过在自身体内产生抗体进行免疫。
此外，本公开的疫苗组合物可通过向受试者施用来预防或治疗癌症。
本公开中的癌症可能是被确定为EPB41L5基因或其编码的蛋白质过表达的癌症。
如本文所用，术语“过表达”是指当通过适当的表达测定法来测定EPB41L5的表达水平时，EPB41L5基因或其编码的蛋白质的表达水平是对照细胞(例如，相关器官的正常细胞)中的表达水平的1.1～2倍。本公开的癌症种类不受限制，本公开的疫苗组合物可用于治疗多种癌症，包括淋巴瘤，如白血病、急性淋巴细胞白血病、急性非淋巴细胞白血病、慢性淋巴细胞白血病、慢性髓性白血病、霍奇金病、非霍奇金淋巴瘤和多发性骨髓瘤；儿童实体瘤，如脑瘤、胶质母细胞瘤、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、视网膜母细胞瘤、肾母细胞瘤、骨肿瘤和软组织肉瘤；常见的成人实体瘤，如肺癌、乳腺癌、前列腺癌、膀胱癌、子宫癌、口腔癌，胰腺癌、黑色素瘤、皮肤癌、胃癌、卵巢癌、脑瘤、肝癌、喉癌、甲状腺癌、食管癌和睾丸癌。
本公开中的癌症可能为癌症干细胞。
如本文所用，术语“癌症干细胞”在广义上是指具有自我更新或分化能力的癌症细胞，这是干细胞的独特能力。肿瘤干细胞是已知存在于肿瘤中的一类干细胞，并且被认为是由于正常干细胞遗传信息的异常转移而发生。众所周知，肿瘤干细胞的存活和增殖是由于其生存的微环境(niches)的存在，而癌症干细胞周围存在的正常细胞、免疫相关细胞或分化的癌细胞影响这些癌干细胞特性的维持和增殖。与普通癌细胞不同，在癌症干细胞正常的肿瘤生长条件下(所述“正常肿瘤生长条件”是指细胞生长所需的营养(葡萄糖)充足，肿瘤微环境生长条件丰富，无细胞应激的状态)，癌症干细胞可以缓慢增殖，或可能保持休眠状态，因而可能对抗癌药物有抗药性。例如，与正常肿瘤细胞中的表达不同，转录调节因子的表达可能受到控制，因此其中主要代谢调节物质的功能可能与普通癌细胞中的功能不同。因此，术语“癌症干细胞”通常是指通过这种不同的代谢调节能力和与此机理相关的细胞信号系统的调节，在营养缺乏状态下获得对凋亡的抵抗性，并且具有侵袭和/或转移潜能的细胞。然而，癌症干细胞可以包括但不限于可分化成普通癌症细胞的任何细胞。
根据本公开的另一方面，本公开提供一种组合物，其包含：上述单克隆抗体或其片段；编码所述单克隆抗体或其片段的核酸分子；包含所述核酸分子的载体；或抑制EPB41L5基因表达的抑制剂。
根据本公开的优选实施例，本公开的组合物可用作预防或治疗癌症或抑制癌症转移的药物组合物。
在本公开的组合物中，与抗体或其片段、核酸分子、癌症、癌症干细胞等有关的内容与上述表位、单克隆抗体或其片段等的内容相同。因此省略其描述以避免本说明书的过度复杂。
本公开的药物组合物可包含：(a)抗体或其片段；编码所述抗体或其片段的核酸分子；包含所述核酸分子的载体；或抑制EPB41L5基因表达的抑制剂；和(b)药学上可接受的载体。
本公开的药物组合物的最大特征是，所述药物组合物通过靶向EPB41L5基因或其编码的蛋白质并抑制EPB41L5基因的表达水平或EPB41L5蛋白的表达或活性来治疗癌症或抑制癌症转移。
本公开的抑制剂可以是选自siRNA(小干扰RNA)、shRNA(短发夹RNA)、微小核糖核酸(miRNA)、核酶、DNA酶、PNA(肽核酸)和反义寡核苷酸中的一种或多种。优选地，所述抑制剂是特异性结合到所述基因的mRNA的siRNA(小干扰RNA)。siRNA作为抑制EPB41L5基因表达的抑制剂，其核苷酸序列可以如SEQ ID NO:4或SEQ ID NO:5所示。
根据本公开的另一方面，本公开提供了一种预防或治疗癌症的方法，所述方法包括施用所述药物组合物的步骤。
在本公开的用于预防或治疗癌症的方法中，与药物组合物相关的内容与上述关于药物组合物的内容相同，因此省略其描述以避免说明书的过度复杂。
如本文所用，术语“预防”可包括但不限于应用本公开的组合物使癌症引起的症状被阻断、抑制或延迟的任何作用。
如本文所用，术语“治疗”可包括但不限于应用本公开的组合物能够减轻或改善癌症引起的症状的任何作用。本公开的疫苗组合物和药物组合物中包含的药学上可接受的载体是常用的配制载体，其实例包括但不限于乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、淀粉、阿拉伯胶、磷酸钙、海藻酸盐，明胶、硅酸钙、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、纤维素、水、糖浆、甲基纤维素、二羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石粉、硬脂酸镁和矿物油。除上述组分外，本公开的药物组合物还可包含润滑剂、润湿剂、甜味剂、调味剂、乳化剂、悬浮剂、防腐剂等。合适的药学上可接受的载体和制剂在《雷氏药学大全》(Remington's PharmaceuticalSciences)(第19版，1995)中详细描述。
本公开的疫苗组合物和药物组合物可以口服或肠外给药，优选肠外给药。例如，所述组合物可通过静脉注射、局部注射或腹腔注射施用。
本公开的每种疫苗组合物和药物组合物的适用剂量取决于诸如制剂方法、给药方式、患者年龄、体重、性别和病理状况、饮食、给药持续时间、给药途径、排泄率和反应敏感性等因素，通常熟练的医生可以很容易地确定并开出用于治疗或预防的有效剂量。根据本公开的优选实施例，本公开的每种疫苗组合物和药物组合物的每日剂量为0.0001～100mg/kg。
可根据本领域技术人员易于施用的方法，使用药学上可接受的载体和/或赋形剂将本公开的疫苗组合物和药物组合物配制成单位剂型或多剂量包装的制剂。此时，所述制剂可为油或水介质中的溶液、悬浮液或乳液，或提取物、粉末、颗粒、片剂或胶囊，且可进一步包含分散剂或稳定剂。
本公开的每种疫苗组合物和药物组合物可作为单一疗法使用，但也可与其他常规化疗或放疗联合应用。当进行这种联合治疗时，癌症的治疗可能会更有效。可与本公开的组合物一起使用的化学治疗药物包括顺铂、卡铂、甲基苄肼、二氯甲基二乙胺、环磷酰胺、异环磷酰胺、米尔法兰、氯霉素、白消安、亚硝基脲、放线霉素D、柔红霉素、阿霉素、博莱霉素、普卡霉素、丝裂霉素、依托泊苷、三苯氧胺、紫杉醇、新型铂类、5-氟尿嘧啶、长春新碱、长春碱和甲氨蝶呤。可与本公开组合物一起使用的放射疗法包括X射线辐射和γ射线辐射。
根据本公开的另一个方面，本公开提供了一种为诊断由EPB41L5过表达引起的疾病提供信息的方法。
在本公开中，所述方法包括以下步骤：(a)获得受试者离体分离的样品；(b)用单克隆抗体或其片段处理样品；以及(c)确定来自受试者的样本中包含的EPB41L5的表达水平是否高于正常样本中包含的EPB41L5的表达水平。
在本公开提供信息的方法中，与EPB41L5过表达引起的疾病、癌症、癌症干细胞、单克隆抗体等相关的内容与上述内容相同，因此省略其描述以避免说明书的过度复杂。
根据本公开的另一方面，本公开提供了一种对样品中所含EPB41L5蛋白进行定量的方法，所述方法包括用单克隆抗体或其片段处理样品的步骤。
由于本公开的单克隆抗体或其片段与EPB41L5特异性结合，因此使用本公开的方法能够准确测定样品中所含EPB41L5的量。
在根据本公开的定量方法中，与EPB41L5过表达引起的疾病、癌症、癌症干细胞、单克隆抗体等相关的内容与上述内容相同，因此省略其描述以避免说明书的过度复杂。
根据本公开的另一方面，本公开提供了一种用于EPB41L5蛋白定量的试剂盒，所述试剂盒包含所述单克隆抗体或其片段。
本公开用于定量的试剂盒可通过抗原-抗体结合反应分析针对抗体的抗原，以对EPB41L5定量。抗原抗体结合反应优选地选自但不限于以下中的一种：常规ELISA(酶联免疫吸附测定法)、RIA(放射免疫测定)、免疫夹心法、聚丙烯酰胺凝胶上的蛋白印迹法、免疫印迹法和免疫组织化学染色。
用于本公开抗原抗体结合反应的载体可选自但不限于硝化纤维素膜、PVDF膜、使用聚乙烯树脂或聚苯乙烯树脂合成的孔板和载玻片。
二级抗体优选用常规着色剂标记，用于显色反应。具体而言，可以使用选自但不限于诸如荧光素(例如HRP(辣根过氧化物酶)、碱性磷酸酶、胶体金、FITC(聚赖氨酸-异硫氰基荧光素)或RITC(异硫氰酸罗丹明B))和染料组成中的任何一种标记剂。优选地，根据显色反应用标记试剂选择用于诱导显色的底物。具体而言，底物优选选自但不限于TMB(3,3',5,5'-四甲基联苯胺)、ABTS[2,2'-连氮基-双(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸]和OPD(邻苯二胺)的任一种。
有益效果
本公开的特征和优点总结如下：
(1)本公开提供一种将EPB41L5识别为抗原并与之特异性结合的单克隆抗体及其片段。
(2)本公开可用于鉴定特异性结合到EPB41L5表位的抗体，并且通过所述方法鉴定的抗体起到抑制EPB41L5信号传导的作用，这种功能使抗体能够有效地用作疫苗或治疗药物，以对抗与EPB41L5相关的癌症，特别是胃癌。
附图说明
图1a显示了对胃癌患者标本进行微阵列分析的结果，表明当EPB41L5的表达水平较高时，胃癌患者的预后较差。图1a显示在没有淋巴结转移的胃癌患者中进行寡核苷酸微阵列分析的结果。根据EPB41L5基因表达水平的中位数，将胃癌患者分为两组。图1b是两组胃癌患者10年生存率的分析结果。图1c显示了对两组胃癌患者进行Kaplan-Meier图分析的结果。
图2显示了为分析EPB41L5和间充质基因表达是否与TGF-β信号传导相关而进行的各种实验的数据。图2a显示通过蛋白印迹分析各种胃癌细胞的结果。
图2b显示了通过对经TGF-β1(10ng/ml)处理24小时的胃癌细胞和未经TGF-β1处理的胃癌细胞进行实时qPCR来分析EPB41L5基因表达水平的结果的柱形图。此处，对照组为未经TGF-β1处理的胃癌细胞中EPB41L5 mRNA的表达水平，TGF-β1表示经TGF-β1处理的胃癌细胞中EPB41L5 mRNA的表达水平。
图2c显示了通过对经TGF-β1(10ng/ml)处理24小时的胃癌细胞和未经TGF-β1处理的胃癌细胞进行蛋白印迹法来分析EMT相关基因(EPB41L5、p-Smad2、Smad2、p-Smad3、Smad3、PAI-1和β-actin)的表达水平的结果。
图2d显示了分析经TGF-β1(10ng/ml)处理24小时的NCI-N87细胞和KATOIII细胞以及未经TGF-β1处理的NCI-N87细胞和KATOIII细胞(对照)中内源性EPB41L5和E-钙粘蛋白的表达水平的结果。此处，绿色代表EPB41L5，红色代表E-钙粘蛋白，蓝色代表Hochest33258，比例尺代表20μm。
图2e显示了经TGF-β1处理或未经TGF-β1处理的KATOIII和SNU719细胞的细胞形态的图像。通过图2e观察TGF-β1的存在与否时的细胞形态。白色箭头指示细胞转化为间充质细胞。显示的KATOIII和SNU719细胞。比例尺代表20μm。
图3显示了为证实依赖Smad的TGF-β信号可调节EPB41L5表达而进行的实验的结果。图3a显示Smad4表达缺陷的MKN45细胞和NCI-N87细胞经TGF-β1处理或未经TGF-β1处理后进行蛋白印迹分析的结果。
图3b显示了免疫荧光染色分析的结果，用于分析经TGF-β1处理或未经TGF-β1处理的NCI-N87细胞中内源性EPB41L5和E-钙粘蛋白的表达水平。其中，绿色代表EPB41L5，红色代表E-钙粘蛋白，比例尺代表20μm。
图3c显示了经TGF-β1或siSmad4#1或#2处理或未经TGF-β1或siSMAD4#1或#2处理的KATOIII细胞中Smad4、EPB41L5、Slug和PAI-1的mRNA(诱导倍数)的分析结果图。实验结果以平均值±s.e.m表示，比例尺代表20μm。*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图3d显示了通过对经TGF-β1(10ng/ml)或siSmad4#1或#2处理的KATOIII细胞和未经处理的KATOIII细胞进行蛋白印迹法来分析EMT相关基因(EPB41L5、p-Smad4、αPAI-1、αSlug和α-微管蛋白)表达水平的结果。
图4显示了免疫荧光染色的结果，用于分析未经处理的KATOIII细胞、仅经TGF-β1处理的KATOIII细胞、经TGF-β1处理后再经TGF-β抑制剂处理的KATOIII细胞(LY2157299)中内源性EPB41L5和E-钙粘蛋白的表达。绿色表示EPB41L5，红色表示E-钙粘蛋白，蓝色表示Hochest 33258，比例尺表示20μm。
图5a显示了TGF-β1存在及不存在时对NC siRNA转染的KATOIII细胞和EPB41L5siRNA#1或EPB41L5 siRNA#2转染的KATOIII细胞进行实时qPCR的结果，以确认由EPB41L5引起的胃癌细胞的转移受TGF-β1治疗的调控。
图5b显示了TGF-β1存在及不存在时对NC siRNA转染的KATOIII细胞和EPB41L5siRNA#1或EPB41L5 siRNA#2转染的KATOIII细胞进行蛋白印迹分析的结果。
图5c显示了TGF-β1存在及不存在时测量NC siRNA转染的KATOIII细胞、EPB41L5siRNA#1-或EPB41L5 siRNA#2-转染的KATOIII细胞和SNU719细胞的形态变化的结果。白色箭头表示细胞转化为间充质细胞，比例尺表示20μm。
图5d显示了TGF-β1存在及不存在时对NC siRNA转染的KATOIII细胞和EPB41L5siRNA#1或EPB41L5 siRNA#2转染的KATOIII细胞进行体外转移和侵袭的分析结果。比例尺代表20μm。
图5e显示了TGF-β1存在及不存在时对NC(阴性对照)siRNA转染的KATOIII细胞和EPB41L5 siRNA#1或EPB41L5 siRNA#2转染的KATOIII细胞进行体外转移和侵袭的分析结果。实验结果用平均值±标准差表示，*P<0.05，**P<0.01，***P<0.001。
图6显示了抗EPB41L5单克隆抗体的特异性。图6a显示了对转染Flag-EPB41L5构建体的MKN28细胞进行蛋白印迹分析的结果，图6b显示了对转染EPB41L5 siRNA(#1或#2)的MKN28细胞进行蛋白印迹分析的结果。
图6c显示了对EPB41L5 siRNA转染的MKN28细胞(EPB41L5 siRNA)进行免疫荧光染色的结果。其中，绿色代表EPB41L5。
图6d显示了EPB41L5结构域的结构。
图6e显示了对用EPB41L5的FL(全长)、EPB41L5的FERM和EPB41L5的C端分别转染的293T细胞进行蛋白印迹分析的结果。
图6f显示了对用质粒(1-633、1-628、1-623、1-618和1-613)转染的293T细胞的总裂解物进行蛋白印迹分析的结果，其中在EPB41L5的C端的5个氨基酸残基被去除。
图6g显示了对分别用EPB41L5的FL(全长)和EPB41L5的△619～624组成的质粒转染的293T细胞的总裂解物进行蛋白印迹分析的结果。
图6h显示了对共转染EPB41L5 siRNA的MKN28细胞和从EPB41L5的FL(全长)、EPB41L5的FERM、EPB41L5的C端和EPB41L5的△619～624中的任何一个进行免疫荧光染色的结果。此处，使用抗EPB41L5单克隆抗体和抗Flag抗体进行免疫荧光染色。绿色代表EPB41L5，红色代表标记标签，蓝色代表宿主，比例尺代表20μm。
图7显示了细胞迁移图像(图7a)和结果分析图(图7b)，TGF-β1存在及不存在时，用不同浓度的抗EPB41L5单克隆抗体处理KATOIII细胞，以证实因TGF-β1而增加的胃癌细胞的侵袭和转移被抗EPB41L5单克隆抗体抑制。实验数据以平均值±s.e.m表示，比例尺代表20μm。**P<0.01和***P<0.001。
图8显示了在本公开的单克隆抗体和识别其他表位的抗体之间，因TGF-β1而增加的胃癌细胞的侵袭和转移被抗EPB41L5单克隆抗体的抑制程度比较结果。
图9显示了为确认EPB41L5与胃癌细胞肺转移相关性而进行的实验结果。图9a显示了对EPB41L5过表达的KATOIII细胞和对照细胞(载体)进行体外转移和侵袭分析的结果。此处，用1％的FBS作化学引诱剂。
图9b显示了对EPB41L5过表达的KATOIII细胞和对照细胞(载体)进行体外转移和侵袭分析的结果的量化。每组随机抽取15个细胞，用图像采集及分析(Fusion-Capt-advanced)软件进行细胞计数。实验数据表示为平均值±s.e.m。
图9c显示了通过尾静脉(每组10只小鼠)将EPB41L5过表达的KATOIII细胞(GFP标记)(EPB41L5(GFP))注射到裸鼠体内并使用IVIS光学成像系统分析细胞的肺转移所获得的结果。图9d示出了使用ROI工具对从图9c的图像测量强度进行量化的结果。实验数据表示为平均辐射效率±s.e.m.*P<0.05和**P<0.01。
图10a示出了通过尾静脉将EPB41L5过表达的KATOIII细胞注射到裸鼠体内，并将5mg/kg的抗EPB41L5单克隆抗体注射到裸鼠体内来制备(EPB41L5+mAb)组的示意图，每2天注射一次，持续2周。
图10b显示了通过IVIS光学成像系统对对照组(载体组)、(EPB41L5)组(通过尾静脉将EPB41L5过表达的KATOIII细胞注射到裸鼠体内)和(EPB41L5+mAb)组(通过尾静脉将EPB41L5过表达的KATOIII细胞注射到裸鼠体内，并将5mg/kg的抗EPB41L5单克隆抗体注射到裸鼠体内，每2天注射一次，持续2周)的分析结果。
图10c显示了通过ROI工具从图9b的图像强度量化的结果图。实验数据为平均辐射效率±s.e.m.**P<0.01。
图11显示了应用EBP41L5抗体、通过蛋白印迹法来分析EBP41L5蛋白在胃癌、肺癌和乳腺癌细胞中的表达和抗体功能的结果。
图12显示了用不同浓度的EBP41L5抗体处理的胃癌、肺癌和乳腺癌细胞的细胞活力的结果图。
具体实施方式
根据本公开的一个实施例，本公开提供了一种表位，所述表位选自由SEQ ID NO:1的氨基酸序列表示的EPB41L5蛋白的第619～624个氨基酸残基；以及一种用于预防或治疗癌症的疫苗组合物，所述疫苗组合物包含所述表位。
根据本公开的另一实施例，本公开提供一种单克隆抗体或其片段，其包含：一种重链可变区，包含由SEQ ID NO:6表示的重链CDR1、由SEQ ID NO:7表示的重链CDR2和由SEQID NO:8表示的重链CDR3；以及一种轻链可变区，包含由SEQ ID NO:9表示的轻链CDR1、由SEQ ID NO:10表示的轻链CDR2和由SEQ ID NO:11表示的轻链CDR3。
根据本公开的另一个实施例，本公开提供了一种用于预防或治疗癌症的组合物，其包含作为活性成分的单克隆抗体或其片段。
发明方案
在下文中，将参考实施例更详细地描述本公开。显然，对于本领域技术人员来说，这些实施例仅用于更详细地描述本公开，并且本公开的范围不受这些实施例的限制。
实验方法
1.病人标本
用于寡核苷酸微阵列和生存率分析的胃癌患者标本采自Severance医院临床试验中心(IRB编号：4-2016-0013)。
2.细胞培养和试剂
人胃癌细胞系：AGS、NCI-N87、KATO2、SK-GT-4、MKN1、MKN28、MKN45、SNU1、SNU5、SNU16、SNU216、SNU484、SNU638、SNU668和SNU719从延世大学(韩国首尔)的Cheong Jae Ho教授实验室获得。
所有胃癌细胞均在RPMI-1640培养基中在5％CO2下于37℃培养，所述培养基添加10％FBS和1％抗生素/抗真菌溶液(Corning，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)。293FT细胞在DMEM中培养。TGF-β1购自Prospec(美国新泽西州东布伦瑞克)，LY2157299购自Selleckchem(美国德克萨斯州休斯顿)。
3.质粒
通过PCR获得编码全长、FERM结构域、C-端、△619～624和C-端5个氨基酸的EPB41L5相关DNA构建体，并将其克隆到pSG5-KF2M1-Flag(Sigma-Aldrich，圣路易斯，密西根州，美国)中。所有质粒结构均经DNA测序验证。
4.siRNA转染
按照制造商的说明书，使用Lipofectamine RNAiMAX(尼通赛默飞世尔ThermoFisher Scientific，罗克福德，伊利诺伊州，美国)转染siRNA细胞。所使用的siRNA由Genolution公司(韩国首尔)合成，并具有以下siRNA序列：EPB41L5-1(EPB41L5 siRNA#1；siEPB41L5#1)(5'-GC AAUUGGCAGCUUAUAAUUU-3')、EPB41L5-2(EPB41L5 siRNA#2；siEPB41L5#2)(5'-UUCAGAUUC GUGCCUAUUCAGUU-3')、Smad4-1(5'-GCUACUUACCAUCAUAACAUU-3')和Smad4-2(5'-GUUCCAUUGCUUACUUUUUUUUU-3')。
5.单克隆抗体-抗EPB41L5单克隆抗体
用人EPB41L5抗原的第386～637个氨基酸残基(SEQ ID NO:3)免疫小鼠制备单克隆抗体，制备过程由ATgen(城南市，韩国)完成。
1)小鼠免疫及杂交瘤细胞的产生
使用人EPB41L5抗原的第386～637个氨基酸残基(SEQ ID NO:3)制备单克隆抗体。为有效制备抗体，选择SEQ ID NO:3作为制备抗体的靶肽。
将制备抗体的靶肽(SEQ ID NO:3)注射到小鼠体内，并产生针对所述抗原的抗体的细胞。取小鼠脾脏获得的抗体产生细胞(B淋巴细胞)与骨髓瘤细胞融合，获得杂交瘤细胞。将杂交瘤细胞置于只有杂交瘤细胞才能存活的HAT培养基中培养，用ELISA法检测抗体活性。
2)选择与识别
在杂交瘤细胞中，选择特异识别EPB41L5的单克隆杂交瘤细胞，将所选的单克隆杂交瘤细胞注射到小鼠腹腔，然后从腹水中回收单克隆抗体。使用蛋白A和蛋白G柱纯化从腹水中回收的本公开的单克隆抗体。
此后，使用EPB41L5构建体和siRNA通过蛋白印迹分析和免疫荧光染色筛选并鉴定特异性识别EPB41L5的单克隆抗体(EPB41L5单克隆抗体)。
6.EPB41L5过表达稳定细胞系的建立
将EPB41L5 DNA克隆到pCDH-CMV-MCS-EF1-puro载体(Addgene，剑桥，马萨诸塞州，美国)中。在293FT细胞中，将pCDH-EPB41L5或pLECE3-GFP转染包装质粒pRSV-Rev和pMD2.G，制备慢病毒颗粒。培养48小时后，收集上清液并用0.45μm过滤器过滤。用慢病毒颗粒感染KATO2细胞，然后用1μg/mL嘌呤霉素(Sigma-Aldrich)筛选。通过Aria II流式细胞仪(BD生物科学，Sparks，马里兰州，USA)用GFP对选定的稳定EPB41L5过表达细胞进行分类。
7.蛋白质印迹分析
在裂解缓冲液(20mmol/LTris-Cl、150mmol/LNaCl、1％Triton X-100、1.5％MgCl2、1mMEDTA、1mM Na2VO4、1mM苯甲基磺酰氟(PMSF)和蛋白酶抑制剂混合物(pH 7.5))中裂解细胞。将溶解液短暂涡旋，并在4℃下以13000rpm离心20分钟。收集上清液并转移到新的试管中。使用蛋白质测定试剂(尼通赛默飞世尔Thermo Fisher Scientific)在660nm处测量蛋白质浓度。制备等浓度的蛋白质样品，每个样品在SDS-聚丙烯酰胺凝胶上电泳，然后转移到硝化纤维素膜上(德国达塞尔沃特曼Whatman)。在含有0.1％(v/v)吐温20(Sigma-Aldrich)和5％(w/v)DifcoTM脱脂牛奶(BD生物科学)的Tris缓冲液(pH7.4)中封闭膜，并用一级抗体检测。使用以下抗体：多克隆EPB41L5(尼通赛默飞世尔Thermo FisherScientific)；EPB41L5(ATGen，城南市，韩国)；Flag标签抗体，β-肌动蛋白(Sigma-Aldrich)；α-微管蛋白(Abcam，剑桥，GB)，TβRI，TβRII，Smad2，Smad3，Smad4，p-Smad2，p-Smad3，Slug，ZEB1(细胞信号，丹佛斯，马萨诸塞州，美国)和PAI-1(Santa Cruz，达拉斯，德克萨斯州，美国)。信号由底物(尼通赛默飞世尔Thermo Fisher Scientific)根据制造商的说明书开发。
8.RNA分离及实时定量PCR
使用TRIzol试剂(Takara Bio，大津，滋贺，日本)提取总RNA，并根据制造商的说明书使用PrimeScript逆转录酶(Takara Bio，大津，滋贺，日本)和寡核苷酸(dT)合成cDNA。定量PCR(qPCR)使用SYBR Green Master(瑞士巴塞尔罗氏)和ABI Prism 7700序列检测系统(Applied Biosystems卡尔斯巴德，加利福尼亚州，美国)进行。使用以下引物检测转录产物：α-微管蛋白(5'-TTCTCCATTTACCCGGCACC-3')和(5'-GTTAGTGTAGGTTGGGCGCT-3')；EPB41L5(5'-GAAAGAAGGCCCAGCAAACG-3')和(5'-AGATCTCATCCCCCAAGCCT-3')；PAI-1(5'-CCCCACTTCTTCAGGCTGTT-3')和(5'-GCCGTTGAA GTAGAGGGCAT-3')；Slug(5'-TCATCTTTGGGGCGAGTGAG-3')和(5'-TGCAGCTGCTTATGTTTGGC-3')；ZEB1(5’-TATGAATGCCCAAACTGCAA-3’)和(5’-TGGTGATGCTGAAAGAGACG-3’)；Smad4(5’-TGCATGACTTTGAGGGACAG-3’)和(5’-GTGGAAGCCACAGGAATGTT-3’)。cDNA的量以α-微管蛋白为标准。所有实验一式三份，用比较法计算相对表达水平和标准差。
9.免疫荧光分析
将细胞在载玻片(SPL生命科学，抱川市，韩国)上培养，并在室温下在4％的多聚甲醛中固定30分钟。固定细胞经PBS洗涤后，用3％BSA孵育1h以阻断非特异性抗体。将抗EPB41L5、抗E-钙粘蛋白和抗标记标签在4℃下培养过夜，然后用Alexa-Fluor 488-或Alexa-Fluor 549-共轭羊抗兔或抗鼠二级抗体(尼通赛默飞世尔Thermo FisherScientific)染色。细胞核用Hoechst 33258染色。样品用LSM710共焦显微镜(卡尔蔡司，德国奥伯科亨)成像。
10.体外转移和侵袭检测
使用8.0μm孔聚碳酸酯膜插入物(Corning，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)通过Transwell测量细胞转移。对于侵袭检测，Transwell中的插入物涂有Matrigel(BD生物科学)。每孔向上室中加入1×105个细胞，并在下室中填充600μL无血清培养基，添加或不添加TGF-β1、LY2157299(TGF-β抑制剂)或抗EPB41L5单克隆抗体(mAb)作为化学引诱剂。培养24小时后，用棉签小心地从上室取出非转移或非侵袭性细胞。用0.2％结晶紫(Sigma-Aldrich)在20％甲醇中对转移或侵袭细胞染色，并在×200倍显微镜下计数。转移和侵袭试验一式三份。
11.体内转移试验
从Orient(韩国首尔)获得5周龄的无胸腺BALB/c nu/nu小鼠。将对照载体或pCDH-EPB41L5和pLECE3 GFP过表达的KATO2细胞(含有2×107细胞的200μLPBS溶液)注射到侧尾静脉。抗EPB41L5单克隆抗体每天5mg/kg，连续2周。使用IVIS成像系统(Caliper生命科学，霍普金顿，马萨诸塞州，美国)采集并分析荧光图像。
12.统计分析
使用Kaplan-Meier绘图仪分析从胃癌患者标本获得的数据中的总生存率(http://kmplot.com/analysis).使用的Affymetrix ID为220977_x_at，Kaplan-Meier绘图仪生存图使用时序检验。统计分析采用t检验比较两组独立实验(双侧)。数据以平均值±标准差(SD)表示，P<0.05具有统计学意义。
实施例
实施例1胃癌患者标本中EPB41L5基因表达水平分析
为了确定GC中潜在的靶分子，对78例无淋巴结转移的胃癌患者进行了寡核苷酸微阵列分析。根据EPB41L5基因表达水平的中位数将患者分为两组(第一组和第二组)。就EPB41L5基因的中位表达水平而言，第一组位于左侧，第二组位于右侧。
经证实，具有过表达APEG1、SMPX、GPR177和EPB41L5基因的第一组的复发率或死亡率高于基因表达水平不高的第二组(图1a)。在APEG1、SMPX、GPR177和EPB41L5基因中，EPB41L5被选为基于抗体的肿瘤治疗的靶蛋白。根据EPB41L5基因的中位表达水平(图1b)对两组未来10年生存率进行分析，可以看出，EPB41L5基因高表达水平患者的生存率低于EPB41L5基因低表达水平患者的生存率。
此外，通过对两组癌症患者(876名胃癌患者)进行Kaplan-Meier曲线图分析，在使用GEO、EGA或TCGA等数据库的Kaplan-Meier曲线图中证实，EPB41L5高表达的胃癌患者生存率较低(HR 1.73，第2.8E-10页)(图1c)。这些临床结果表明，EPB41L5的高表达水平与胃癌患者的不良预后有关。也就是说，EPB41L5基因高表达的胃癌患者生存率较低。
实施例2胃癌细胞中TGF-β1和EPB41L5蛋白表达模式分析
本发明人检测了哪些胃癌细胞对TGF-β信号有反应。通过对几个胃癌细胞系进行蛋白印迹分析来分析与TGF-β信号转导级联相关的蛋白质水平(图2a)。结果证实，在NCI-N87、MKN45、SNU216和SNU484细胞中未检测到Smad3或Smad4。
接下来，用TGF-β1处理胃癌细胞，以检测EPB41L5基因表达是否受TGF-β信号调节。结果证实，TGF-β1处理可显著增加KATOIII、MKN28、SNU1和SNU719细胞中EPB41L5基因的表达水平，但在Smad3/Smad4缺陷型GC细胞中不明显(图2b)。此外，通过TGF-β1处理，间充质基因如PAI-1、Slug和磷酸化Smad2和Smad3的表达显著增加(图2c)。
根据免疫荧光染色分析的结果(图2d)证实，上皮标记物E-钙粘蛋白在跨膜中的表达减少，并且在KATOIII的细胞膜中的TGF-β1增加了EPB41L5蛋白的表达水平。此外，通过TGF-β1处理，胃癌细胞KATOIII和SNU719的形态特征改变为间充质特征(图2e和2f)。
这些结果表明，TGF-β信号调节癌细胞(例如胃癌细胞)中EPB41L5基因及其编码蛋白的表达水平和上皮细胞间质转化。
实施例3Smad-依赖性TGF-β信号转导对EPB41L5蛋白表达水平的调控
为了检测TGF-β1诱导的EPB41L5蛋白表达水平的增加是否依赖于Smad，我们在Smad4缺陷的MKN45(Smad4敲除的MKN45)和NCI-N87细胞(胃癌)中进行了蛋白印迹分析和免疫荧光染色。经证实，经TGF-β1处理的每种细胞中这些基因和EPB41L5蛋白的水平没有改变(图3a和3b)。此外，证实了经TGF-β1处理的每种类型的细胞中的EPB41L5、PAI-1和Slug均上调，并且使用siRNA敲除Smad4的MKN28细胞中的EPB41L5、PAI-1和Slug的表达受到抑制(图3c和3d)。
综合这些结果，可以看出TGF-β信号传导依赖于Smad，表明TGF-β信号传导参与了胃癌细胞中EPB41L5表达的调节。
实施例4TGF-β1与EPB41L5蛋白的相关性分析
本公开分析了用有效的TGF-β受体I抑制剂LY2157299(Galunisertib)处理后EPB41L5蛋白表达水平的变化。
图4显示了免疫荧光染色的结果，用于分析未经处理的KATOIII细胞、仅经TGF-β1处理的KATOIII细胞和经TGF-β1处理然后经TGF-β抑制剂(LY2157299)处理的KATOIII细胞中内源性EPB41L5和E-钙粘蛋白的表达。绿色表示EPB41L5，红色表示E-钙粘蛋白，蓝色表示Hochest 33258，比例尺表示20μm。
如图4所示，通过对仅用TGF-β1处理的KATOIII细胞和依次用TGF-β1和LY2157299处理的KATOIII细胞进行免疫荧光染色，显示TGF-β1提高了EPB41L5蛋白的表达水平，但被LY2157299抑制。
实施例5EPB41L5对胃癌细胞转移的影响分析
本公开验证了EPB41L5是否影响胃癌细胞对TGF-β信号转导的反应。为此，用EPB41L5siRNA转染KATOIII细胞或SNU719细胞。具体而言，应用两种类型的siRNA(EPB41L5siRNA#1(SEQ ID NO 4:5'-GCAAUUGGCAGCUUAUAAUUU-3')和EPB41L5 siRNA#2(SEQID NO 5:5'-UUCAGAUUC GUGCCUAUUCAGUU-3'))敲除EPB41L5。经证实，与转染NC siRNA的KATOIII细胞相比，转染EPB41L5 siRNA#1或EPB41L5 siRNA#2的KATOIII细胞中EPB41L5和PAI-1的基因和蛋白质水平显著降低(图5a和5b)。然而，在转染EPB41L5siRNA#1或EPB41L5siRNA#2的KATOIII细胞中，未观察到磷酸化Smad3(αp-Smad3)和Smad3(αSmad3)的变化(图5b)。
另外，通过分析转染NC siRNA的KATOIII细胞和转染EPB41L5 siRNA#1或EPB41L5siRNA#2的KATOIII细胞经TGF-β1处理后的上皮细胞间质转化和胃癌细胞转移的结果，证实了敲除EPB41L5可阻断TGF-β1对上皮细胞间质转化和胃癌细胞转移的影响(图5c、5d和5e)。也就是说，EPB41L5是TGF-β诱导胃癌细胞转移和迁移的重要因素。
实施例6抗EPB41L5mAb(单克隆抗体)识别C端619～624氨基酸序列
本公开认为由于细胞粘附分子在转移中起重要作用，可以使用单克隆抗体和肽开发新的治疗药物。因此，研制了一种抗EPB41L5的单克隆抗体(mAb)。
为了验证所研制抗体的特异性，通过蛋白印迹分析和免疫荧光分析对转染Flag-EPB41L5或EPB41L5 siRNA的胃癌细胞进行分析。结果证实了在转染Flag-EPB41L5的胃癌细胞中检测到EPB41L5的过表达(图6a)，并且在转染EPB41L5 siRNA的胃癌细胞(NC、siRNA#1或siRNA#2)中EPB41L5沉默(图6b)。此外，通过免疫荧光染色分析EPB41L5 siRNA转染的胃癌细胞的结果，可以看出，在胃癌细胞中通过抗EPB41L5单克隆抗体明显检测到了EPB41L5(图6c)。通过蛋白印迹法分析本公开中的抗EPB41L5单克隆抗体，结果证实，抗EPB41L5单克隆抗体识别EPB41L5的C端，而不是EPB41L5的N端FERM结构域(图6d和6e)。
此外，通过分析依次去除了EPB41L5 C-端的5个氨基酸的抗体，结果证实了抗体识别EPB41L5的C-端的第619～624个氨基酸(图6f和6g)。考虑到非渗透性免疫荧光染色的特点，为了抑制内源性EPB41L5的表达，在EPB41L5的FL(全长)、EPB41L5的FERM、EPB41L5的C端和EPB41L5的△619～624中选择的任一质粒与EPB41L5 siRNA共转染细胞。用抗Flag抗体分析外源性EPB41L5的表达。在转染FL和C端构建体的FK细胞和未转染△619～624的MKN28细胞中检测到EPB41L5表达(图6h)。综合这些结果，可以看出抗EPB41L5单克隆抗体特异性识别EPB41L5的619～624氨基酸区。
实施例7抗EPB41L5单克隆抗体可变区序列测定
由ATgen(韩国)分析上述实施例6产生的单克隆抗体的可变区的序列。结果，本公开的单克隆抗体的重链可变区和轻链可变区的序列如下：
重链可变区
(SEQ ID NO:12)
QVQLKESGTVLARPGASVKMSCKASGYTFTSYWMHWVKQRPGQGLEWIGAIYPGNSDTSYNQKFKDKAKLTAVTSTSTAYMELSSLTDEASAVYYCTRGGKLPFAMDYWGQGTSVTVSS
轻链可变区
(SEQ ID NO:13)
DVLMTQTPLSLPVSLGDQASMSCRSSQSLVHSNGNTYLHWYLQKPGQSPKLLIYKVSNRFSGVPDRFSGSGSGTDFTLKISRVEAEDLGVYFCSQSTHVPWTFGGGTKLEIK
此外，本公开的单克隆抗体的重链可变区CDR1至CDR3和轻链可变区CDR1至CDR3的序列如下：
重链可变区CDR1:Gly Tyr Thr Phe Thr SerTyrTrp(SEQ ID NO:6)
重链可变区CDR2:Ile TyrPro GlyAsn SerAsp(SEQ ID NO:7)
重链可变区CDR3:ThrArg Gly Gly Lys LeuPro PheAlaMetAsp Tyr(SEQ ID NO:8)
轻链可变区CDR1:Gln Ser LeuVal His SerAsn GlyAsn Thr Tyr(SEQ ID NO:9)
轻链可变区CDR2:Lys Val Ser(SEQ ID NO:10)
轻链可变区CDR3:Ser Gln SerThr His Val Pro Trp Thr(SEQ ID NO:11)
实施例8抗EPB41L5单克隆抗体的疗效
本公开验证了抗EPB41L5单克隆抗体的特异性。在本实验中，通过评估抗EPB41L5单克隆抗体对有或没有TGF-β1处理的胃癌(GC)细胞转移的影响，证实TGF-β1能有效地促进KATOIII的转移。此外，证实抗EPB41L5单克隆抗体抑制了由于TGF-β1而增加的KATOIII细胞的转移(图7a和7b)。
实施例9抗EPB41L5单克隆抗体转移抑制作用的比较
以与实施例8相同的方式，在单克隆抗体识别的不同表位序列之间比较抗EPB41L5单克隆抗体抑制细胞转移的程度。如图8所示，证实了本公开的单克隆抗体(AtGen)显著(100％)抑制由于TGF-β1而增加的细胞转移，而识别EPB41L5蛋白638～708个氨基酸序列的抗体(Novus抗体)几乎不能抑制由于TGF-β1而增加的细胞转移。因此，可以看出，与特异性结合由其他氨基酸序列组成的表位的抗体相比，识别EPB41L5的C端区域619～624个氨基酸序列的抗体可以非常有效地抑制由于TGF-β1而增加的细胞转移。
实施例10EPB41L5与胃癌细胞转移的相关性分析
通过上述实验证实，由于TGF-β1而增加的EPB41L5表达参与胃癌细胞的体内转移和侵袭。因此，在本公开中，通过体外转移和侵袭试验分析EPB41L5对胃癌细胞转移的影响。
具体地，本公开制备了作为载体的EPB41L5过表达的KATOIII细胞和未经处理的KATOIII细胞。
通过分析EPB41L5过表达的KATOIII细胞的体外转移和侵袭试验，证实EPB41L5过表达的KATOIII细胞的转移和侵袭显著增加(图9a和9b)。为观察EPB41L5在胃癌细胞中的表达，将EPB41L5过表达的KATOIII细胞经尾静脉注射到裸鼠体内。结果证实，与载体(GFP)组相比，EPB41L5(GFP)组胃癌细胞的肺转移显著增加(图9c和9d)。综上所述，EPB41L5可以促进胃癌细胞的体内转移。
实施例11抗EPB41L5单克隆抗体抑制胃癌细胞转移能力的检测
检测抗EPB41L5单克隆抗体的体内疗效。为此，制备了以下各组：载体组；(EPB41L5)组，将EPB41L5过表达的KATOIII细胞通过尾静脉注射到裸鼠体内；(EPB41L5+mAb)组，将EPB41L5过表达的KATOIII细胞通过尾静脉注射到裸鼠体内，并将5mg/kg的抗EPB41L5单克隆抗体注射到裸鼠体内，每2天注射一次，持续2周(图10a)。
可以证实，在注射EPB41L5过表达细胞的裸鼠中，癌症的肺转移增加，但是在注射抗EPB41L5单克隆抗体的组中，胃癌细胞的肺转移比载体组降低(图10b和10c)。因此，可以看出，本公开的抗EPB41L5单克隆抗体对晚期胃癌具有治疗或预防作用。
实施例12特异性识别EBP41L5蛋白的抗EPB41L5单克隆抗体的功能的确认
为了证实抗EPB41L5单克隆抗体对EBP41L5的特异性，我们制备了KATOIII细胞和MKN28细胞作为胃癌细胞系。制备肺癌细胞系A549细胞和H226细胞，乳腺癌细胞系MCF7细胞和MDA-MB-231细胞。这些细胞来自延世大学的Cheong Jae Ho教授实验室和韩国细胞库。每个细胞系在37℃、5％CO2下，在补充有10％FBS和1％抗生素/抗真菌溶液(Corning，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)的RPMI-1640培养基中培养。
使用抗EPB41L5单克隆抗体，通过蛋白印迹法分析每个细胞组中的EBP41L5蛋白表达(图11)。结果，不仅在胃癌细胞系中，且在肺癌细胞系和乳腺癌细胞系中，通过抗EPB41L5单克隆抗体均检测到EBP41L5蛋白表达(图11)。这表明根据本公开的抗EPB41L5单克隆抗体不仅可有效地用于治疗或预防胃癌，还可用于治疗或预防肺癌和乳腺癌。
实施例13抗EPB41L5单克隆抗体的细胞特异性毒性检测
为了检测本公开的抗EPB41L5单克隆抗体对各种细胞的细胞活性的影响，我们制备了KATOIII细胞和MKN28细胞作为胃癌细胞系。制备肺癌细胞系A549细胞和H226细胞，乳腺癌细胞系MCF7细胞和MDA-MB-231细胞。这些细胞来自延世大学的Cheong Jae Ho教授实验室和韩国细胞库。
每个细胞系在37℃和5％CO2下，在补充有10％FBS和1％抗生素/抗真菌溶液(Corning，马纳萨斯，弗吉尼亚州，美国)的RPMI-1640培养基中培养。
将0、2、4或6μg抗EPB41L5单克隆抗体注射到每组细胞中，并且在24小时后，通过3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑溴盐(MTT)还原法分析每组细胞的细胞活力(％)(图12)。结果证实了当注射抗EPB41L5单克隆抗体时，细胞活力呈浓度依赖性降低，表明本公开的抗EPB41L5单克隆抗体表现出对晚期癌症或胃癌的治疗或预防作用(图12)。
结论
细胞粘附蛋白在肿瘤转移中起关键作用。因此，已讨论了利用细胞粘附蛋白抗体开发抗肿瘤转移药物的可能性。本发明人已努力开发一种基于与转移相关的新的粘附分子或复合物的新疗法，从而完成本公开。在EMT(上皮细胞间质转化)中，上皮细胞失去细胞间连接和细胞极性，肌动蛋白细胞骨架被重组以实现间充质表型。据报道，EPB41L5与p120-连环蛋白(其破坏E-钙粘蛋白)和帕西林(paxillin粘着斑激酶)相互作用。此外，已知EPB41L5与MPP5结合，MPP5是一种负性调节细胞极性的Crumbs复合物成分。另一种连接蛋白β-连环蛋白在肾上皮细胞基底外侧膜与EPB41L5共定位，但其结合尚未被证实。FAK在N端具有FERM结构域，与ASAP1/AMAP1和帕西林(C端EPB41L5的另一个结合伴侣)结合。
在本公开中，已发现EPB41L5与胃癌患者的不良预后有关。在这方面，已经证明EPB41L5在癌细胞中高度表达。同时，由于TGF-β具有促进胃癌转移的作用，推测TGF-β的表达与胃癌的淋巴结转移及预后有关。通过分析TGF-β与EPB41L5的相关性，在EPB41L5基因启动子上发现了大量的Smad结合基序。
因此，本公开证实了敲除EPB41L5可消除TGF-β1诱导的间充质转化和GC细胞转移的增加，表明EPB41L5是TGF-β信号传导的主要因素。综上所述，EPB41L5基因敲除可通过TGF-β/Smad3/EPB41L5途径调控上皮细胞间质转化引起的胃癌细胞的转移和侵袭。
在本公开中，证实了EPB41L5位于细胞表面并促进胃癌细胞的体外和体内转移，这表明特异性结合EPB41L5的抗体可以用作治疗性单克隆抗体。因此，本发明研制了EPB41L5单克隆抗体。证实EPB41L5单克隆抗体能有效阻断TGF-β1诱导的胃癌细胞转移和侵袭，并能显著抑制EPB41L5过表达细胞的肺转移。
此外，证实本公开的抗EPB41L5单克隆抗体显著抑制胃癌、肺癌和乳腺癌细胞系(尤其是胃癌细胞系)中的EPB41L5蛋白表达，并降低癌细胞的活力。
因此，可以看出，本公开的EPB41L5单克隆抗体是预防、治疗或抑制癌症转移特别是胃癌转移的非常有效的方法。
尽管已经参考具体特征对本公开进行了详细描述，但是对于本领域技术人员显而易见的是，本公开的描述只是其优选实施例，并不限制本公开的范围。因此，本公开的实质性范围将由所附权利要求及其等价范围来限定。
工业实用性
本公开的特征和优点总结如下：
(1)本公开提供一种将EPB41L5识别为抗原并与之特异结合的单克隆抗体及其片段。
(2)本公开可用于鉴定与EPB41L5表位特异性结合的抗体，并且通过所述方法鉴定的抗体具有抑制EPB41L5信号传导的功能，并且所述功能使得本公开的抗体能够有效地用作针对EPB41L5相关的癌症(特别是胃癌)的疫苗或治疗药物。
<110> 雷普吕鲁斯有限公司（REPUREUS）
<120> 一种EPB41L5的表位和单克隆抗体
<130> POPB187366PCT
<150> KR 10-2018-0093045
<151> 2018-08-09
<160> 13
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 733
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EPB41L5 蛋白
<400> 1
Met Leu Ser Phe Phe Arg Arg Thr Leu Gly Arg Arg Ser Met Arg Lys
1 5 10 15
His Ala Glu Lys Glu Arg Leu Arg Glu Ala Gln Arg Ala Ala Thr His
20 25 30
Ile Pro Ala Ala Gly Asp Ser Lys Ser Ile Ile Thr Cys Arg Val Ser
35 40 45
Leu Leu Asp Gly Thr Asp Val Ser Val Asp Leu Pro Lys Lys Ala Lys
50 55 60
Gly Gln Glu Leu Phe Asp Gln Ile Met Tyr His Leu Asp Leu Ile Glu
65 70 75 80
Ser Asp Tyr Phe Gly Leu Arg Phe Met Asp Ser Ala Gln Val Ala His
85 90 95
Trp Leu Asp Gly Thr Lys Ser Ile Lys Lys Gln Val Lys Ile Gly Ser
100 105 110
Pro Tyr Cys Leu His Leu Arg Val Lys Phe Tyr Ser Ser Glu Pro Asn
115 120 125
Asn Leu Arg Glu Glu Leu Thr Arg Tyr Leu Phe Val Leu Gln Leu Lys
130 135 140
Gln Asp Ile Leu Ser Gly Lys Leu Asp Cys Pro Phe Asp Thr Ala Val
145 150 155 160
Gln Leu Ala Ala Tyr Asn Leu Gln Ala Glu Leu Gly Asp Tyr Asp Leu
165 170 175
Ala Glu His Ser Pro Glu Leu Val Ser Glu Phe Arg Phe Val Pro Ile
180 185 190
Gln Thr Glu Glu Met Glu Leu Ala Ile Phe Glu Lys Trp Lys Glu Tyr
195 200 205
Arg Gly Gln Thr Pro Ala Gln Ala Glu Thr Asn Tyr Leu Asn Lys Ala
210 215 220
Lys Trp Leu Glu Met Tyr Gly Val Asp Met His Val Val Lys Ala Arg
225 230 235 240
Asp Gly Asn Asp Tyr Ser Leu Gly Leu Thr Pro Thr Gly Val Leu Val
245 250 255
Phe Glu Gly Asp Thr Lys Ile Gly Leu Phe Phe Trp Pro Lys Ile Thr
260 265 270
Arg Leu Asp Phe Lys Lys Asn Lys Leu Thr Leu Val Val Val Glu Asp
275 280 285
Asp Asp Gln Gly Lys Glu Gln Glu His Thr Phe Val Phe Arg Leu Asp
290 295 300
His Pro Lys Ala Cys Lys His Leu Trp Lys Cys Ala Val Glu His His
305 310 315 320
Ala Phe Phe Arg Leu Arg Gly Pro Val Gln Lys Ser Ser His Arg Ser
325 330 335
Gly Phe Ile Arg Leu Gly Ser Arg Phe Arg Tyr Ser Gly Lys Thr Glu
340 345 350
Tyr Gln Thr Thr Lys Thr Asn Lys Ala Arg Arg Ser Thr Ser Phe Glu
355 360 365
Arg Arg Pro Ser Lys Arg Tyr Ser Arg Arg Thr Leu Gln Met Lys Ala
370 375 380
Cys Ala Thr Lys Pro Glu Glu Leu Ser Val His Asn Asn Val Ser Thr
385 390 395 400
Gln Ser Asn Gly Ser Gln Gln Ala Trp Gly Met Arg Ser Ala Leu Pro
405 410 415
Val Ser Pro Ser Ile Ser Ser Ala Pro Val Pro Val Glu Ile Glu Asn
420 425 430
Leu Pro Gln Ser Pro Gly Thr Asp Gln His Asp Arg Lys Cys Ile Pro
435 440 445
Leu Asn Ile Asp Leu Leu Asn Ser Pro Asp Leu Leu Glu Ala Thr Ile
450 455 460
Gly Asp Val Ile Gly Ala Ser Asp Thr Met Glu Thr Ser Gln Ala Leu
465 470 475 480
Asn Asp Val Asn Val Ala Thr Arg Leu Pro Gly Leu Gly Glu Pro Glu
485 490 495
Val Glu Tyr Glu Thr Leu Lys Asp Thr Ser Glu Lys Leu Lys Gln Leu
500 505 510
Glu Met Glu Asn Ser Pro Leu Leu Ser Pro Arg Ser Asn Ile Asp Val
515 520 525
Asn Ile Asn Ser Gln Glu Glu Val Val Lys Leu Thr Glu Lys Cys Leu
530 535 540
Asn Asn Val Ile Glu Ser Pro Gly Leu Asn Val Met Arg Val Pro Pro
545 550 555 560
Asp Phe Lys Ser Asn Ile Leu Lys Ala Gln Val Glu Ala Val His Lys
565 570 575
Val Thr Lys Glu Asp Ser Leu Leu Ser His Lys Asn Ala Asn Val Gln
580 585 590
Asp Ala Ala Thr Asn Ser Ala Val Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro Leu
595 600 605
Pro Lys Glu Ser Leu Glu Thr Leu Met Leu Ile Thr Pro Ala Asp Ser
610 615 620
Gly Ser Val Leu Lys Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Ala Leu Leu Ala
625 630 635 640
Ser Leu Thr Glu Asn Leu Ile Asp His Thr Val Ala Pro Gln Val Ser
645 650 655
Ser Thr Ser Met Ile Thr Pro Arg Trp Ile Val Pro Gln Ser Gly Ala
660 665 670
Met Ser Asn Gly Leu Ala Gly Cys Glu Met Leu Leu Thr Gly Lys Glu
675 680 685
Gly His Gly Asn Lys Asp Gly Ile Ser Leu Ile Ser Pro Pro Ala Pro
690 695 700
Phe Leu Val Asp Ala Val Thr Ser Ser Gly Pro Ile Leu Ala Glu Glu
705 710 715 720
Ala Val Leu Lys Gln Lys Cys Leu Leu Thr Thr Glu Leu
725 730
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> EPB41L5 表位
<400> 2
Ile Thr Pro Ala Asp Ser
1 5
<210> 3
<211> 270
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人源 EPB41L5 抗体第 386~637氨基酸残基
<400> 3
Glu Arg Arg Pro Ser Lys Arg Tyr Ser Arg Arg Thr Leu Gln Met Lys
1 5 10 15
Ala Cys Ala Thr Lys Pro Glu Glu Leu Ser Val His Asn Asn Val Ser
20 25 30
Thr Gln Ser Asn Gly Ser Gln Gln Ala Trp Gly Met Arg Ser Ala Leu
35 40 45
Pro Val Ser Pro Ser Ile Ser Ser Ala Pro Val Pro Val Glu Ile Glu
50 55 60
Asn Leu Pro Gln Ser Pro Gly Thr Asp Gln His Asp Arg Lys Cys Ile
65 70 75 80
Pro Leu Asn Ile Asp Leu Leu Asn Ser Pro Asp Leu Leu Glu Ala Thr
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Ile Gly Asp Val Ile Gly Ala Ser Asp Thr Met Glu Thr Ser Gln Ala
100 105 110
Leu Asn Asp Val Asn Val Ala Thr Arg Leu Pro Gly Leu Gly Glu Pro
115 120 125
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Leu Glu Met Glu Asn Ser Pro Leu Leu Ser Pro Arg Ser Asn Ile Asp
145 150 155 160
Val Asn Ile Asn Ser Gln Glu Glu Val Val Lys Leu Thr Glu Lys Cys
165 170 175
Leu Asn Asn Val Ile Glu Ser Pro Gly Leu Asn Val Met Arg Val Pro
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Pro Asp Phe Lys Ser Asn Ile Leu Lys Ala Gln Val Glu Ala Val His
195 200 205
Lys Val Thr Lys Glu Asp Ser Leu Leu Ser His Lys Asn Ala Asn Val
210 215 220
Gln Asp Ala Ala Thr Asn Ser Ala Val Leu Asn Glu Asn Asn Val Pro
225 230 235 240
Leu Pro Lys Glu Ser Leu Glu Thr Leu Met Leu Ile Thr Pro Ala Asp
245 250 255
Ser Gly Ser Val Leu Lys Glu Ala Thr Asp Glu Leu Asp Ala
260 265 270
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPB41L5 siRNA (EPB41L5 siRNA#1)
<400> 4
gcaauuggca gcuuauaauu u 21
<210> 5
<211> 23
<212> RNA
<213> 人工序列
<220>
<223> EPB41L5 siRNA (EPB41L5 siRNA#2)
<400> 5
uucagauucg ugccuauuca guu 23
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 6
Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr Trp
1 5
<210> 7
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 7
Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp
1 5
<210> 8
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 8
Thr Arg Gly Gly Lys Leu Pro Phe Ala Met Asp Tyr
1 5 10
<210> 9
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 9
Gln Ser Leu Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr
1 5 10
<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 10
Lys Val Ser
1
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 11
Ser Gln Ser Thr His Val Pro Trp Thr
1 5
<210> 12
<211> 119
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链可变区
<400> 12
Gln Val Gln Leu Lys Glu Ser Gly Thr Val Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Trp Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Asn Ser Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Lys Leu Thr Ala Val Thr Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Ser Leu Thr Asp Glu Ala Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Thr Arg Gly Gly Lys Leu Pro Phe Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Ser Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 13
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链可变区
<400> 13
Asp Val Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Gln Ala Ser Met Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Val His Ser
20 25 30
Asn Gly Asn Thr Tyr Leu His Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Phe Cys Ser Gln Ser
85 90 95
Thr His Val Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105 110
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