阅读说明：本技术 新酯酶及其用途 (Novel esterases and their use ) 是由 S·迪奎斯内 V·图尼尔 A·马蒂 于 2019-07-26 设计创作，主要内容包括：本发明涉及新酯酶,更特别地涉及与SEQ ID N°1的酯酶相比具有改进的活性和/或改进的热稳定性的酯酶变体及其在降解含聚酯材料如塑料制品中的用途。本发明的酯酶特别适合于降解聚对苯二甲酸乙二醇酯和含聚对苯二甲酸乙二醇酯的材料。(The present invention relates to novel esterases, more particularly to esterase variants having improved activity and/or improved thermostability compared to the esterase of SEQ ID N ° 1 and their use for degrading polyester-containing materials, such as plastic articles. The esterases of the invention are particularly suitable for degrading polyethylene terephthalate and materials containing polyethylene terephthalate.)

具体实施方式

实施例1-酯酶的构建、表达和纯化

-构建

使用质粒构建pET26b-LCC-His产生根据本发明的酯酶。该质粒在于克隆在NdeI和XhoI限制性位点之间的编码SEQ ID N°1的酯酶的基因，该基因被优化用于大肠杆菌表达。根据供应商的建议使用了两个定点诱变试剂盒，以产生酯酶变体：来自Agilent的QuikChange II定点诱变试剂盒和QuikChange Lightning多定点诱变试剂盒(SantaClara、California、USA)。

-酯酶的表达和纯化

在50mL LB-Miller培养基或ZYM自诱导培养基(Studier等、2005-Prot.Exp.Pur.41、207-234)中连续使用菌株Stellar^TM(Clontech、California、USA)和大肠杆菌OneBL21 DE3(Life technologies、Carlsbad、California、USA)进行克隆和重组表达。在16℃下使用0.5mM异丙基β-D-1-硫代半乳糖吡喃糖苷(IPTG，Euromedex，Souffelweyersheim，France)进行LB-Miller培养基中的诱导。通过在Avanti J-26XP离心机(Beckman Coulter，Brea，USA)中离心(8000rpm，10℃下20分钟)终止培养。将细胞悬浮于20mL Talon缓冲液(Tris-HCl 20mM，NaCl 300mM，pH 8)中。然后通过FB 705超声波仪(Fisherbrand，Illkirch，France)在2分钟内对细胞悬浮液进行超声处理，其中振幅为30％(2秒ON和1秒OFF循环)。然后进行离心步骤：在Eppendorf离心机中在11000rpm，10℃下30分钟。收集可溶性级分并进行亲和层析。该纯化步骤用Metal Affinity Resin(Clontech、CA、USA)完成。用补充有咪唑的Talon缓冲液步骤进行蛋白质洗脱。将纯化的蛋白质用Talon缓冲液透析，然后根据制造商的指示(Lifescience Bio-Rad，France)使用Bio-Rad蛋白质测定法定量，并在+4℃下储存。

实施例2-评估酯酶的降解活性

测定酯酶的降解活性，并与SEQ ID N°1的酯酶的降解活性比较。

已经使用了多种方法来评估比活性：

(1)基于PET水解的比活性；

(2)基于固态下聚酯降解的活性；

(3)基于大于100mL反应器中PET水解的活性。

2.1基于PET水解的比活性

称取100mg无定形PET(以粉末形式并根据WO 2017/198786制备以使其结晶度低于20％)并将其引入100mL玻璃瓶中。将在Talon缓冲液(Tris-HCl 20mM，NaCl 0.3M，pH8)中制备的0.02或0.03mg/mL的1mL包含SEQ ID N°1的酯酶制剂(作为参照对照)或本发明的酯酶引入玻璃瓶中。最终，添加49mL 0.1M磷酸钾缓冲液(pH8)。

通过在Max Q 4450孵育箱(Thermo Fisher Scientific，Inc.Waltham，MA，USA)中以60℃、65℃或70℃和150rpm孵育每个玻璃瓶开始解聚。

通过在最初24小时期间的不同时间进行的取样，并通过超高效液相色谱(UHPLC)分析测定解聚反应的初始速率，以mg产生的当量TA/小时计。如有必要，将样品稀释于pH8的0.1M磷酸钾缓冲液中。然后，将150μL甲醇和6.5μL HCl 6N添加到150μL样品或稀释液中。在0.45μm注射器过滤器上混合并过滤后，将样品加载到UHPLC上以监测对苯二甲酸(TA)、MHET和BHET的释放。使用的色谱系统是Ultimate 3000UHPLC系统(Thermo Fisher Scientific，Inc.Waltham，MA，USA)，其包括泵模块、自动进样器、25℃恒温的柱温箱和240nm的UV检测器。使用的柱是HSC18 HPLC柱(150×4.6mm，5μm，配备有预柱，Supelco，Bellefonte，USA)。使用1mM H2SO4中的梯度MeOH(30％-90％)以1mL/min分离TA、MHET和BHET。注射量为20μL样品。根据商业化TA和BHET和内部合成的MHET制备的标准曲线以与样品相同的条件测量TA、MHET和BHET。在反应的水解曲线的线性部分中测定PET水解的比活性(mg当量TA/小时/mg酶)，这种曲线通过在最初24小时内的不同时间进行采样来建立。当量TA对应于测量的TA和测量的MHET和BHET中包含的TA的总和。

2.2基于降解固态形式的聚酯的活性

诱导的细胞、半纯化的蛋白质提取物或纯化的蛋白质可用作包含本发明的酯酶的组合物，以评估这种酯酶的活性。

诱导的细胞对应于在ZYM自动诱导培养基培养之后或在LB-Miller培养基中通过IPTG诱导后获得的细胞培养样品(如实施例1所述)。

在以下方案下，从ZYM自动诱导培养基培养后或在LB-Miller培养基中通过IPTG诱导后获得半纯化的蛋白质提取物(如实施例1所述)。通过在Avanti J-26XP离心机(BeckmanCoulter、Brea、USA)中离心(8000rpm，10℃下20分钟)来停止培养。将细胞沉淀物悬浮于裂解缓冲液(20mM Tris-HCl、pH 8、300mM NaCl)中。在-80℃的2h冷冻/解冻循环中破坏细胞，然后添加1μL lysonase生物处理试剂(Merck Millipore、Darmstadt、Germany)，并在28℃孵育1h，包括每15分钟涡旋均质化。通过离心(2250×g，15min，4℃)使裂解物澄清。为了产生半纯化的级分，将裂解物在70℃处理1h，并通过离心(2250×g，15分钟，4℃)澄清。根据生产商的说明(Lifescience Bio-Rad、France)使用Bio-Rad蛋白测定法定量该级分的蛋白质浓度。

如实施例1所述获得纯化的蛋白质。

将组合物样品置于在包含如下制备的PET或另一种固态聚酯化合物(例如PBAT或类似物)的琼脂多用途盘(agar omnitray)中产生的表面上或孔中。通过将500mg PET溶于六氟-2-丙醇(HFIP)中来制备含PET的琼脂平板，并将该培养基倒入250mL水溶液中。在52℃和140mbar下蒸发HFIP后，将溶液与包含3％琼脂的0.2M磷酸钾缓冲液(pH8)以v/v混合。使用约30mL的混合物制备每种多用途盘并在4℃下储存。

2-24小时后，在60℃、65℃或70℃下测量并比较通过野生型酯酶和本发明变体降解聚酯而形成的晕圈的表面积或直径。

2.3基于反应器中PET水解的活性

将在80mL的100mM磷酸钾缓冲液(pH8)中制备的0.69μmol-2.07μmol的纯化酯酶与20g无定形PET(根据WO 2017/198786制备以使其结晶度低于20％)在500mL Minibio生物反应器(Applikon Biotechnology、Delft、The Netherlands)中混合。通过水浴浸泡在60℃进行温度调节，并使用单个船用叶轮在250rpm下保持恒定搅拌。通过6N NaOH将PET解聚测定的pH值调节为8，并通过my-Control生物控制器系统(Applikon Biotechnology、Delft、TheNetherlands)确认。在测定期间记录碱消耗，并且该碱消耗可用于PET解聚测定的表征。

通过测定残留的PET重量或通过测定产生的当量TA和EG或通过碱消耗来测定PET解聚测定的最终收率。在反应结束时，通过将反应体积通过12-15μm的11级无灰纸过滤器(Dutscher SAS、Brumath、France)过滤并在称重之前干燥此类保留物来评估残留PET的重量。使用2.1中所述的UHPLC法测定产生的当量TA和EG，并基于给定时间的摩尔浓度比(TA+MHET+BHET)与初始样品中所含TA总量的比率来计算水解百分比。PET解聚产生酸性单体，该酸性单体将用碱中和以能够保持反应器中的pH。使用相应摩尔的碱消耗量来计算所产生的当量TA，并基于给定时间的当量TA的摩尔浓度与初始样品中所含TA总量的比率来计算水解百分比。

下表1显示本发明的酯酶(变体)的比降解活性。将SEQ ID N°1的酯酶的比降解活性用作参考并视为100％的比降解活性。如实施例2.1中所述测量比降解活性。

表1：本发明变体的比降解活性

除了分别在表1中列出的取代的组合之外，变体V1-V83具有如SEQ ID N°1所示的确切氨基酸序列。

在根据实施例2.3的反应器中测量本发明的酯酶(变体)的比较降解活性。评估变体在24小时后的PET解聚率和达到90％的PET解聚率的时间，并将其与SEQ ID N°1的酯酶比较。SEQ ID N°1的酯酶在24小时后达到66％的PET解聚，并且在这种条件下需要43.5小时达到90％的PET解聚率。结果显示在下表2中。

表2：本发明的变体在24小时后的PET解聚率和达到90％的PET解聚率的时间

实施例3-评估本发明酯酶的热稳定性

测定本发明酯酶的热稳定性，并与SEQ ID N°1的酯酶的热稳定性进行比较。

使用不同的方法来估计热稳定性：

(1)溶液中蛋白质的圆二色性；

(2)在给定的温度、时间和缓冲液条件下孵育蛋白质后残余酯酶的活性；

(3)在给定的温度、时间和缓冲条件下孵育蛋白质后残余聚酯的解聚活性；

(4)在给定的温度、时间和缓冲液条件下孵育蛋白质后，降解分散在琼脂平板中的固体聚酯化合物(如PET或PBAT或类似物)的能力；

(5)在给定的温度、缓冲液、蛋白质浓度和聚酯浓度条件下进行多轮聚酯的解聚测定的能力；

(6)差示扫描荧光法(DSF)；

下文给出了这些方法的方案的细节。

3.1圆二色性

用Jasco 815装置(Easton，USA)进行圆二色性(CD)以比较SEQ ID N°1的酯酶的熔化温度(T_m)(Tm＝84.7℃)和本发明的酯酶的Tm。

技术上，在Talon缓冲液中以0.5mg/mL制备400μL蛋白质样品并用于CD。实现从280nm到190nm的第一次扫描以测定对应于蛋白质正确折叠的CD的两个最大强度。然后，以对应于这种最大强度的长波进行从25℃到110℃的第二次扫描，并提供特定曲线(sigmoid3参数y＝a/(1+e^((x-x0)/b)))，其通过Sigmaplot版本11.0软件分析，当x＝x0时测定T_m。获得的T_m反映了给定蛋白质的热稳定性。T_m越高，变体在高温下越稳定。

3.2残余酯酶的活性

将1mL的SEQ ID N°1的酯酶或本发明酯酶的40mg/L(在Talon缓冲液中)的溶液在不同温度(65、70、75、80和90℃)下孵育10天。定期取样，在pH8.0的0.1M磷酸钾缓冲液中稀释1至500倍，进行对硝基苯酚-丁酸盐(pNP-B)测定。将20μL样品与pH8.0的175μL0.1M磷酸钾缓冲液和5μL pNP-B在2-甲基-2-丁醇(40mM)中的溶液混合。在30℃、搅拌下进行酶促反应15分钟，并通过微孔板分光光度计(Versamax，Molecular Devices，Sunnyvale，CA，USA)获得405nm处的吸光度。使用水解曲线的线性部分中释放的对硝基苯酚的标准曲线测定pNP-B水解的活性(初始速度表示为μmol pNPB/min)。

3.3残余聚酯的解聚活性

将10mL的SEQ ID N°1的酯酶和本发明酯酶的40mg/L(在Talon缓冲液中)的溶液分别在不同温度(65、70、75、80和90℃)下孵育1到30天。定期取1mL样品，并转移到包含100mg微粉化为250-500μm的无定形PET(根据WO 2017/198786制备以使其结晶度低于20％)和49mL pH8.0的0.1M磷酸钾缓冲液的瓶中，并在65℃下孵育。定期取样150μL缓冲液。需要时，将样品稀释于pH8的0.1M磷酸钾缓冲液中。然后，将150μL甲醇和6.5μL HCl 6N添加到150μL样品或稀释液中。在0.45μm注射器过滤器上混合并过滤后，将样品加载到UHPLC上以监测对苯二甲酸(TA)、MHET和BHET的释放。使用的色谱系统是Ultimate 3000UHPLC系统(ThermoFisher Scientific，Inc.Waltham，MA，USA)，其包括泵模块、自动进样器、25℃恒温的柱温箱和240nm的UV检测器。使用的柱是HSC18HPLC柱(150×4.6mm，5μm，配备有预柱，Supelco，Bellefonte，USA)。使用1mM H₂SO₄中的梯度MeOH(30％-90％)以1mL/min分离TA、MHET和BHET。注射量为20μL样品。根据商业化TA和BHET和内部合成的MHET在与样品相同的条件下测量TA、MHET和BHET。在水解曲线的线性部分中测定PET水解的活性(μmol水解的PET/min或mg产生的当量TA/小时)，这种曲线通过在最初24小时内的不同时间进行采样来建立。当量TA对应于测量的TA和测量的MHET和BHET中包含的TA的总和。3.4固态形式聚酯的降解

分别将1mL的SEQ ID N°1的酯酶和本发明酯酶的40mg/L(在Talon缓冲液中)的溶液在不同温度(65、70、75、80和90℃)下孵育1到30天。定期将20μL酶制剂置于包含PET的琼脂平板产生的孔中。通过将500mg PET溶于六氟-2-丙醇(HFIP)中来制备包含PET的琼脂平板，并将该培养基倒入250mL水溶液中。在52℃和140mbar下蒸发HFIP后，将溶液与包含3％琼脂的0.2M磷酸钾缓冲液(pH8)以v/v混合。使用约30mL的混合物制备每种多用途盘并在4℃下储存。

2-24小时后，在60℃、65℃或70℃下测量并比较通过野生型酯酶和本发明变体降解聚酯而形成的晕圈的直径或表面积。给定温度下酶的半衰期对应于晕圈直径或表面积减少2倍所需的时间。

3.5多轮聚酯的解聚

在酶反应器中评估酯酶进行连续几轮聚酯解聚测定的能力。用3g无定形PET(根据WO 2017/198786制备以使其结晶度低于20％)和100mL含有3mg LC-酯酶的10mM磷酸钾缓冲液(pH8)启动Minibio500生物反应器(Applikon Biotechnology B.V.，Delft，TheNetherlands)。使用船用叶轮将搅拌设定为250rpm。通过浸入外部水浴将生物反应器恒温为60℃、65℃或70℃。通过添加3M KOH将pH调节至8。通过BioXpert软件V2.95监测不同参数(pH、温度、搅拌、添加碱)。每20小时添加1.8g无定形PET。定期取样500μL反应介质。

如实施例2.3中所述，通过HPLC测定TA、MHET和BHET的含量。使用65℃恒温的Aminex HPX-87K柱(Bio-Rad Laboratories，Inc，Hercules，California，United States)测定EG的含量。洗脱液为以0.6mL.min^-1的K₂HPO₄ 5mM。注射量为20μL。使用折射计监测乙二醇。

基于给定时间的摩尔浓度(TA+MHET+BHET)与初始样品中包含的TA总量的比率，或基于给定时间的摩尔浓度(EG+MHET+2x BHET)与初始样品中包含的EG总量的比率来计算水解百分比。降解速率计算为每小时的mg总释放TA或每小时的mg总EG。

将酶的半衰期评估为获得50％降解速率损失所需的孵育时间。

3.6差示扫描荧光法(DSF)

DSF用于通过测定其熔化温度(Tm，即一半蛋白质群体展开的温度)来评估野生型蛋白质(SEQ ID N°1)及其变体的热稳定性。制备浓度为14μM(0.4mg/mL)的蛋白质样品，并储存在由20mM Tris HCl(pH 8.0)、300mM NaCl组成的缓冲液A中。首先将DMSO中的SYPROorange染料5000x储备溶液在水中稀释至250x。将蛋白质样品加载到白色透明96孔PCR板(Bio-Rad cat#HSP9601)上，其中每个孔包含25μl的终体积。每孔中蛋白质和SYPRO Orange染料的最终浓度分别为5μM(0.14mg/ml)和10X。每孔加载的体积如下：15μL缓冲液A、9μL0.4mg/mL蛋白质溶液和1μL 250x Sypro Orange稀释溶液。然后，用光学质量密封带密封PCR板，并在室温下以2000rpm旋转1分钟。然后，使用CFX96实时PCR系统进行DSF实验，所述系统设置为使用450/490激发和560/580发射滤光片。将样品以0.3℃/秒的速率从25℃加热至100℃。每0.03秒进行单次荧光测量。使用Bio-Rad CFX Manager软件从熔化曲线一阶导数的峰测定熔化温度。

然后，基于它们的Tm值比较SEQ ID N°1的酯酶和本发明酯酶。由于来自不同生产的相同蛋白质的实验之间的高重现性，0.8℃的ΔTm被认为对于比较变体是显著的。Tm值对应于至少3次测量的平均值。在84.7℃下评估SEQ ID N°1的酯酶的Tm。

本发明的酯酶变体的热稳定性显示于下表3中，以Tm值表示并根据实施例2.6评估。括号中显示与SEQ ID N°1的酯酶相比Tm的增加。

表3：与SEQ ID N°1相比，本发明酯酶的Tm

除了分别在表3中列出的取代的组合之外，变体V1-V83具有如SEQ ID N°1所示的确切氨基酸序列。