具体实施方式

下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步地具体说明。

实施例1

滇鼠刺中分离的2-芳基苯并[b]呋喃类化合物，化合物结构式为：

制备方法：

1)取经干燥粉碎的药材粉末18Kg，以4倍量的95％乙醇常温浸泡提取，提取三次，每次7天。

2)提取完毕，合并提取液，减压浓缩(55℃；0.08Mpa)后得粗浸膏1.25Kg。

3)将总浸膏分散到12L水中，依次以石油醚(4×24L)、乙酸乙酯(4×24L)和正丁醇(4×24L)萃取，分别合并萃取液后，减压浓缩除去溶剂得石油醚部位110.4g，乙酸乙酯部位180.5g和正丁醇部位210.6g。

4)取乙酸乙酯部位，经硅胶柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱(50:1→1:1,v/v)，分成8个组分E1-E8。

5)组分E5(6.8g)进一步经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯(3:1)洗脱得10个亚组分E5A-E5J。

6)组分E5E(2.41g)经硅胶柱层析，以二氯甲烷/乙酸乙酯(50:1)洗脱后得组分E5E1(382mg)，后者经甲醇纯结晶后得化合物1(10mg)。

7)组分E5G(1.3g)经MCI柱层析，以70％MeOH/H₂O洗脱后得化合物2(5mg)。组分E5H(2.3g)经硅胶柱层析，以二氯甲烷/乙酸乙酯梯度洗脱后得8个组分E5H1-E5H8。亚组分E5H4(0.37g)进一步经硅胶柱层析，以DCM/MeOH(90:1)洗脱得1个组分。该组分进一步经甲醇纯结晶后得化合物4(78mg)。组分E6(2.77g)经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以DCM/MeOH(1:1)洗脱得7个组分E6A-E6G。组分E6C(73mg)经硅胶柱层析，以DCM/MeOH(30:1)洗脱得化合物3(7mg)。

实施例2

滇鼠刺中分离的2-芳基苯并[b]呋喃类化合物，化合物结构式为：

制备方法：

1)取经干燥粉碎的药材粉末15Kg，以乙醇常温浸泡提取，提取2次，每次10天；

2)提取完毕，合并提取液，减压浓缩(55℃；0.08Mpa)后得粗浸膏；

3)将总浸膏分散到12L水中，依次石油醚18L、萃取6次，乙酸乙酯18L,萃取6次和正丁醇18L、萃取6次；分别合并萃取液后，减压浓缩除去溶剂得石油醚部位，乙酸乙酯部位和正丁醇部位；

4)取乙酸乙酯部位，经硅胶柱层析分离，以比例为50:1→1:1,v/v石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，分成8个组分E1-E8；

5)组分E5进一步经硅胶柱层析，以比例为3:1石油醚/乙酸乙酯洗脱得10个亚组分E5A-E5J；

6)组分E5E经硅胶柱层析，以比例为50:1二氯甲烷/乙酸乙酯洗脱后得组分E5E1，后者经甲醇纯结晶后得化合物1；

7)组分E5G经MCI柱层析，以70％MeOH/H₂O洗脱后得化合物2；组分E5H经硅胶柱层析，以二氯甲烷/乙酸乙酯梯度洗脱后得8个组分E5H1-E5H8；亚组分E5H4进一步经硅胶柱层析，以比例为90:1DCM/MeOH洗脱得1个组分；该组分进一步经甲醇纯结晶后得化合物4；组分E6经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以比例为1:1的DCM/MeOH洗脱得7个组分E6A-E6G；组分E6C经硅胶柱层析，以比例为30:1的DCM/MeOH洗脱得化合物3。

实施例3

滇鼠刺中分离的2-芳基苯并[b]呋喃类化合物，化合物结构式为：

制备方法：

1)取经干燥粉碎的药材粉末21Kg，以乙醇常温浸泡提取，提取4次，每次4天；

2)提取完毕，合并提取液，减压浓缩(55℃；0.08Mpa)后得粗浸膏；

3)将总浸膏分散到12L水中，依次石油醚30L、萃取2次，乙酸乙酯30L,萃取2次和正丁醇30L、萃取2次；分别合并萃取液后，减压浓缩除去溶剂得石油醚部位，乙酸乙酯部位和正丁醇部位；

4)取乙酸乙酯部位，经硅胶柱层析分离，以比例为50:1→1:1,v/v石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱，分成8个组分E1-E8；

5)组分E5进一步经硅胶柱层析，以比例为3:1石油醚/乙酸乙酯洗脱得10个亚组分E5A-E5J；

6)组分E5E经硅胶柱层析，以比例为50:1二氯甲烷/乙酸乙酯洗脱后得组分E5E1，后者经甲醇纯结晶后得化合物1；

7)组分E5G经MCI柱层析，以70％MeOH/H₂O洗脱后得化合物2；组分E5H经硅胶柱层析，以二氯甲烷/乙酸乙酯梯度洗脱后得8个组分E5H1-E5H8；亚组分E5H4进一步经硅胶柱层析，以比例为90:1DCM/MeOH洗脱得1个组分；该组分进一步经甲醇纯结晶后得化合物4；组分E6经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以比例为1:1的DCM/MeOH洗脱得7个组分E6A-E6G；组分E6C经硅胶柱层析，以比例为30:1的DCM/MeOH洗脱得化合物3。

实施例4

以化合物1-4任一种为原料，加入可溶性淀粉(化合物与可溶性淀粉的比例为1：8)混合均匀，制粒，得颗粒剂。

实施例5

以化合物1-4任一种为原料，加入可溶性淀粉(化合物与可溶性淀粉的比例为1：11)混合均匀，装入胶囊，即得胶囊剂。

实施例6

以化合物1-4任一种为原料，加入可溶性淀粉(化合物与可溶性淀粉的比例为1：5)混合均匀，压片，即得片剂。

实施例7

以化合物1-4任一种为原料，加入可溶性淀粉(化合物与可溶性淀粉的比例为1：5)混合均匀，干燥，制成丸剂。

实施例8

以化合物1-4任一种为原料，加入25倍量的注射用水，混匀，过滤，灭菌，得注射剂。

为了进一步验证本发明的可行性及有效性，发明人进行了一系列的试验，具体如下：

实验例1:分离方法试验

一.分离涉及填料及厂家

硅胶：200-300目，青岛海洋化工有限公司

Sephadex LH20：瑞典GE Healthcare Bio-Sciences AB公司

MCI：日本三菱公司

溶剂：市售分析纯试剂。

二.分离过程

取经干燥粉碎的药材粉末18Kg，以4倍量的95％乙醇常温浸泡提取，提取三次，每次7天。提取完毕，合并提取液，减压浓缩后得粗浸膏1.25Kg。将总浸膏分散到12L水中，依次以石油醚(4×24L)、乙酸乙酯(4×24L)和正丁醇(4×24L)萃取，分别合并萃取液后，减压浓缩除去溶剂得石油醚部位110.4g，乙酸乙酯部位180.5g和正丁醇部位210.6g。

取乙酸乙酯部位，经硅胶柱层析分离，以石油醚/乙酸乙酯梯度洗脱(50:1→1:1,v/v)，分成8个组分E1-E8。组分E5(6.8g)进一步经硅胶柱层析，以石油醚/乙酸乙酯(3:1)洗脱得10个亚组分E5A-E5J。组分E5E(2.41g)经硅胶柱层析，以二氯甲烷/乙酸乙酯(50:1)洗脱后得组分E5E1(382mg)，后者经甲醇纯结晶后得化合物1(10mg)。组分E5G(1.3g)经MCI柱层析，以70％MeOH/H₂O洗脱后得化合物2(5mg)。组分E5H(2.3g)经硅胶柱层析，以二氯甲烷/乙酸乙酯梯度洗脱后得8个组分E5H1-E5H8。亚组分E5H4(0.37g)进一步经硅胶柱层析，以DCM/MeOH(90:1)洗脱得1个组分。该组分进一步经甲醇纯结晶后得化合物4(78mg)。组分E6(2.77g)经Sephadex LH-20凝胶柱层析，以DCM/MeOH(1:1)洗脱得7个组分E6A-E6G。组分E6C(73mg)经硅胶柱层析，以DCM/MeOH(30:1)洗脱得化合物3(7mg)。

从滇鼠刺Itea yunnanensis Franch.地上部分分离鉴定了2-芳基苯并[b]

呋喃类化合物(*代表新化合物)4个，其中1-3为新化合物。

实验例2:活性测定

一.活性测定所用试剂

胎牛血清：美国Gibco公司

DMEM培养基：美国Gibco公司

Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒：美国Biolegend公司

青霉素、链霉素、DMSO和结晶紫：美国Sigma公司

MTT试剂盒：美国MCE公司

TBST缓冲液：

RIPA裂解液：

BCA蛋白质测定试剂盒：美国Bio-Rad公司

硝酸纤维素膜：Millipore公司

脱脂奶粉：美国BD公司

抗体ERK、p-ERK、AKT、p-AKT、STAT3和p-STAT3：美国Cell Signaling Technology公司

增强型化学发光液：赛默飞公司

二、活性测定

A.细胞培养37℃下，以含有10％胎牛血清的DMEM培养基于5％CO₂培养箱中培养SK-Hep-1细胞。待细胞覆盖率高于90％时进行传代，选择生长状态良好的细胞进行实验。

B.细胞增殖实验取96孔培养板，于每孔中接种对数生长期的SK-Hep-1细胞(100μL，密度为2×104个/mL)。提取完毕，于含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养24h后，再加入不同浓度的待测样品，DMSO为阴性对照。37℃下于5％CO2培养箱中培养72h后，每孔加入20μL MTT溶液(5mg/mL)继续培养4h。提取完毕，小心吸弃上清液，每孔加入150μL DMSO，置微孔振荡器上振荡10min使紫色结晶溶解完全。采用酶标仪测定490nm波长处的吸收值，制作生长曲线，确定待测样品的IC50值。

C.克隆形成实验取6孔培养板，接种对数生长期的SK-Hep-1细胞(1000细胞/孔)。提取完毕，于含有10％胎牛血清和1％青霉素/链霉素的DMEM培养基中培养24h后，再加入待测样品(5μM)。37℃下于5％CO2培养箱中培养7天后，用0.5％的结晶紫染色20min。提取完毕，去除染色液，用高分辨扫描仪记录图像。随后，每孔加入2mL 33％的乙酸溶液悬浮细胞，置微孔振荡器上振荡，采用酶标仪测定570nm波长处的吸收值。

D.细胞凋亡实验取6孔培养板，每孔接种2×105个SK-Hep-1细胞。提取完毕，每孔加入待测样品(10μM)处理36h。随后，分别收集细胞，并用预冷的PBS洗涤一次。用AnnexinV-FITC-PI凋亡检测试剂盒检测活细胞、早期凋亡细胞和晚期凋亡/死细胞。具体参照说明书加入异硫氰酸荧光素(FITC)和碘化丙啶(PI)，避光条件下孵育15min。处理提取完毕，采用流式细胞仪分析所有细胞的凋亡情况。

E.免疫印迹实验将处理好的细胞经生理盐水洗涤2次，随后用含磷酸酶和蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液裂解。充分裂解后，4℃下将所得的全细胞蛋白裂解液离心10min(12000rpm)，取上清，弃去不溶物。通过BCA蛋白质测定试剂盒测定总蛋白浓度。将等量的总蛋白与SDS-PAGE上样缓冲液混合后进行SDS-PAGE电泳。提取完毕，恒压下转移蛋白至硝酸纤维素膜。转膜后，用含5％脱脂奶粉的TBST缓冲液封闭30min。随后，进行一抗(抗RAS、抗RAF-1、抗p-RAF-1、抗MEK1/2、抗p-MEK1/2、抗ERK、抗p-ERK、抗c-Jun、抗p-c-Jun、抗c-Fos、抗p-c-Fos、抗ELK-1、抗p-ELK-1、抗Caspase-3/-8/-9、抗PARP、抗GAPDH或抗β-actin抗体)标记，4℃孵育过夜。次日，TBST缓冲液洗涤三次后，于室温下进行辣根过氧化物酶缀合的二抗标记，孵育2h。提取完毕，TBST缓冲液洗涤三次后，用增强型化学发光液检测蛋白。

结果：

通过MTT法评价上述2-芳基苯并[b]呋喃类化合物的抗增殖能力，发现化合物1-4均能抑制人肝癌细胞SK-Hep-1的增殖，但1-2增殖能力较化合物3、4弱，化合物1、2在20μM的浓度下对人肝癌细胞SK-Hep-1的增殖抑制率分别是23％和15％(化合物1、2活性较低，无法测IC₅₀值，以增殖抑制率评价化合物)，化合物3、4对应的IC₅₀值分别是5.36μM和6.01μM。见图1。

进一步评价了化合物3和4对SK-Hep-1的克隆形成能力的影响。结果发现，三者在5μM的浓度下均能显著抑制SK-Hep-1细胞的克隆形成。这些结果表明，化合物3和4对肝癌细胞增殖表现出良好的抑制活性。见图1。

采用流式细胞术检测了化合物3对SK-Hep-1细胞凋亡的影响。结果发现，化合物3在10μM的浓度下可显著诱导SK-Hep-1细胞的早期凋亡，早期凋亡率为22.1％。见图2。

通过免疫印迹实验分析化合物3对SK-Hep-1细胞中ERK(RAS/ERK信号通路)、AKT(PI3K/AKT信号通路)、STAT3(JAK/STAT信号通路)的表达量及其磷酸化水平的影响。结果发现，化合物3(10μM)可显著降低ERK的磷酸化水平，而对其它指标无明显影响。表明化合物3可能通过抑制RAS/ERK信号转导通路诱导肝癌细胞凋亡。见图3。

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[5]潘婷婷，崔晓楠.晚期原发性肝癌的药物治疗[J].临床肝胆病杂志，2020，36(1)：194-197.

虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作出一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。