一种抗cd105特异性单克隆抗体及其应用
阅读说明：本技术 一种抗cd105特异性单克隆抗体及其应用 (anti-CD 105 specific monoclonal antibody and application thereof ) 是由 彭劲武 李尚彧 闵豆 程育苗 于 2021-01-21 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种抗CD105特异性单克隆抗体,其重链可变区具有如SEQ ID No：6所示的氨基酸序列,其轻链可变区具有如SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。该抗CD105特异性单克隆抗体,编码所述抗CD105特异性单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示,编码所述抗CD105特异性单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。本发明的CD105抗体与人CD105蛋白的结合具有特异性强、检测灵敏度高的特点。本发明抗CD105特异性单克隆抗体适合用于各种恶性肿瘤的诊断检测中,可提高检测的准确度。(The invention relates to an anti-CD 105 specific monoclonal antibody, wherein a heavy chain variable region of the monoclonal antibody has a sequence shown in SEQ ID No: 6, and the light chain variable region has the amino acid sequence shown as SEQ ID No: 7. The nucleotide sequence of the heavy chain variable region of the anti-CD 105 specific monoclonal antibody is shown as SEQ ID No: 4, the nucleotide sequence of the light chain variable region of the monoclonal antibody for encoding the anti-CD 105 specificity is shown as SEQ ID No: 5, respectively. The combination of the CD105 antibody and the human CD105 protein has the characteristics of strong specificity and high detection sensitivity. The anti-CD 105 specific monoclonal antibody is suitable for diagnosis and detection of various malignant tumors, and can improve the detection accuracy.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其是一种抗CD105特异性单克隆抗体及其应用。
背景技术
CD105又名Endoglin，是一种存在于细胞表面的同源二聚体跨膜糖蛋白，能特异性结合转化生长因子β(TGF-β)，TGF-β是促血管生成作用的多肽细胞因子，可通过调节血管生成、免疫反应和EMT促进肿瘤发生。肿瘤新生血管的生成，在肿瘤增殖与转移中具有重要的作用，CD105作为血管内皮细胞增殖的标志之一，可直接参与血管生成，在肿瘤血管生长过程中发挥重要作用。
经研究发现，CD105与肺腺癌、肾细胞癌、结直肠癌、乳腺癌、宫颈癌等肿瘤组织都具有密切的关系，CD105在不同来源的恶性肿瘤组织及其周围的血管内皮细胞上强表达，且主要表达于未成熟的血管，而在正常组织血管上不表达。因此，可用于各种恶性肿瘤组织中血管生成的研究，也可作为各种恶性肿瘤的生长、转移及预后的检测指标。
基于CD105的检测指标在各种恶性肿瘤、转移及预后等方面的重要应用，所以，获得一株具有高灵敏度、强特异性的抗CD105抗体具有重要意义。
发明内容
(一)要解决的技术问题
鉴于现有技术问题，本发明提供一种抗CD105特异性单克隆抗体，该抗体能广泛应用于各种恶性肿瘤的诊断，且具有极高的特异性和灵敏度。
本发明提供的抗CD105特异性单克隆抗体是由小鼠杂交瘤细胞株产生，经过多种不同肿瘤组织的免疫组织化学检测发现，该抗体可以很好的鉴别恶性肿瘤的发生与转移情况，可用于恶性肿瘤的免疫学诊断。
(二)技术方案
为了达到上述目的，本发明采用的主要技术方案包括：
第一方面，本发明提供一种抗CD105特异性单克隆抗体，其重链可变区具有如SEQID No：6所示的氨基酸序列，其轻链可变区具有如SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。
第二方面，本发明提供一种抗CD105特异性单克隆抗体，编码所述抗CD105特异性单克隆抗体的重链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No：4所示，编码所述抗CD105特异性单克隆抗体的轻链可变区的核苷酸序列如SEQ ID No：5所示。
其中，用ELISA技术测定该抗CD105单克隆抗体的亚类为小鼠IgG1型单克隆抗体，亲和常数为8×10-7(mol/L)。免疫组织化学实验显示，该抗体能特异识别CD105蛋白，包括但不限于重组CD105抗原蛋白和淋巴造血系统中的CD105分子等。
第三方面，本发明提供一种抗CD105单克隆抗体的制备方法，包括：
S1:免疫：分别用SEQ ID No：1-3所示的氨基酸序列的合成多肽作为免疫原，经由KLH或OVA偶联后，免疫不同的Balb/c小鼠，免疫后取血测定血清抗体效价，选取与各所述合成多肽一一对应的抗体效价最高的小鼠分别进行细胞融合；
S2:细胞融合：骨髓瘤细胞采用鼠来源的sp2/0鼠骨髓瘤样细胞；取小鼠脾淋巴细胞与sp2/0鼠骨髓瘤样细胞进行细胞融合，于HAT培养基中培养，得到杂交瘤细胞；
S3:筛选：融合7-10天内挑选细胞克隆，使用CD105抗原进行ELISA测试，使用CD105阳性组织进行免疫组织化学检测，对阳性细胞进行有限稀释并进行ELISA测试及IHC检测，挑取全部稀释样品均为阳性且阳性值高的为单克隆稳定株，即阳性杂交瘤细胞株813A5D5；
S4:抗体制备：用阳性杂交瘤细胞株813A5D5的细胞系进行小鼠腹水的制备，收集腹水，使用Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得抗CD105特异性单克隆抗体；或者，
将阳性杂交瘤细胞株813A5D5用血清的DMEM培养基培养扩倍，低速离心，弃上清并将细胞转移到无血清培养基继续培养1-2周后，收取细胞悬液，离心后取上清，利用亲和层析法进行纯化，获得抗CD105特异性单克隆抗体。
所述抗CD105单克隆抗体由小鼠杂交瘤细胞813A5D5的细胞系分泌。
上述制备方法还包括单克隆抗体亚型鉴定及亲和常数测定：获得的抗CD105特异性单克隆抗体亚型经ELISA技术测定为IgG1型单克隆抗体，亲和常数为8×10-7(mol/L)。
经免疫组织化学实验检测，结果表明该抗体具有特异性识别恶性肿瘤组织中CD105蛋白分子的功能。
优选地，S1中作为免疫原的合成多肽为SEQ ID NO:1-3所示的氨基酸序列，SEQ IDNO:1序列为DRGTLPLAVAL LLA；SEQ ID NO:2序列为IFPEKNIRGFKLPDTP；SEQ ID NO:3序列为NHSIGSTQSTPCSTS。
第四方面，本发明提供一种抗CD105特异性单克隆抗体的制备方法，根据抗CD105特异性单克隆抗体的重链可变区的氨基酸序列SEQ ID No：6，轻链可变区的氨基酸序列SEQID No：7，在体外构建CD105抗体的表达载体，该表达载体经大肠杆菌扩增抽提并去内毒素，转染Expi-293F细胞，转染后继续培养，收集细胞上清，采用亲和层析法纯化，获得抗CD105特异性单克隆抗体。
第五方面，本发明提供一种检测CD105蛋白的试剂盒或抗体芯片，其包含上述任一实施例记载的抗CD105特异性单克隆抗体。
所述抗CD105单克隆抗体用于检测恶性肿瘤组织和正常组织细胞中CD105的表达情况，检测方法包括以下一种或几种：免疫组织化学法、免疫印迹法和酶联吸附测定法。
优选的，所述抗CD105单克隆抗体应用在免疫组化病理诊断剂中。
(三)有益效果
本发明获得的抗CD105单克隆抗体是由杂交瘤813A5D5细胞系所分泌产生，为一种IgG1类抗体。本发明获得的抗CD105单克隆抗体与CD105蛋白的结合有强特异性和高灵敏度，能精准识别恶性肿瘤中CD105的表达。该抗体可应用于免疫组织化学(IHC)、酶联吸附(ELISA)、免疫印记(Western blotting)、抗体芯片等检测过程中。
附图说明
图1表示单克隆抗体在CD105阳性组织即H.ovary(人卵巢癌细胞系)和人胎盘组织H.placenta裂解液中的Western Blot检测结果图(均识别到特异性条带)，其中一抗为实施例中制备的抗CD105单克隆抗体813A5D5，使用浓度为2μg/mL。
图2为本发明实施例制备的CD105单克隆抗体813A5D5和市售CD105(目前最常用的商品化CD105抗体)单克隆抗体在肺腺癌组织样本上的免疫组化检测代表性结果(染色阳性信号)比对图，一抗使用浓度为1μg/mL。
图3为本发明实施例制备的CD105单克隆抗体813A5D5和市售CD105(目前最常用的商品化CD105抗体)单克隆抗体在乳腺癌组织样本上的免疫组化检测结果(染色阳性信号)比对图，一抗使用浓度为1μg/mL。
具体实施方式
为了更好的解释本发明，以便于理解，下面结合附图，通过具体实施方式，对本发明作详细描述。
本发明对CD105蛋白分子，按照公布的序列进行分析，依据在细胞膜上的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择SEQ ID No：1-3所示的合成多肽序列作为免疫原，免疫Balb/c小鼠。经与鼠骨髓瘤样细胞细胞融合、筛选克隆，获得高效分泌单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞系813A5D5。利用该杂交瘤细胞系进行小鼠腹水的制备，Protein A/G柱亲和层析纯化腹水，获得抗CD105单克隆抗体(或采用血清的DMEM培养基培养扩倍，然后转入无血清培养基培养，离心取上清，亲和层析法进行纯化，进而制备抗CD105单克隆抗体)。用ELISA技术测定该单克隆抗体的亚类为IgG1型单克隆抗体，亲和常数为8×10-7(mol/L)。免疫组织化学实验显示该抗体能特异识别CD105蛋白，包括但不限于重组CD105抗原蛋白和淋巴造血系统中的CD105分子等。
以下结合具体实施例对本发明的方案进行解释说明。
实施例1
分泌抗CD105特异性单克隆抗体的杂交瘤细胞株813A5D5的制备：
(1)化学合成得到如下氨基酸序列的合成多肽：
SEQ ID NO 1：DRGTLPLAVAL LLA；
SEQ ID NO 2：IFPEKNIRGFKLPDTP；
SEQ ID NO 3：NHSIGSTQST PCSTS。
(2)小鼠免疫：用上述SEQ ID NO 1-3所示序列的多肽分别与弗氏完全佐剂1:1混合并乳化，分别采用皮下注射方法免疫不同BALB/c小鼠，间隔两周后，以前述多肽与弗氏不完全佐剂1:1混合，进行第二次免疫。免疫两次后取血以ELISA法梯度稀释测定血清效价；根据结果确定是否加强免疫。检测小鼠血清效价达到1:100000后用前述多肽(不含佐剂)腹腔加强免疫(30μg)，3天后断尾采血，检测血清效价，选取与SEQ ID No:1-3抗原免疫一一对应的抗体效价最高的小鼠，准备进行细胞融合。
(3)杂交瘤细胞融合：骨髓瘤细胞采用鼠来源的sp2/0鼠骨髓瘤样细胞株，融合时处于对数生长期。取已免疫鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液。取免疫小鼠的脾细胞与SP2/0小鼠骨髓瘤样细胞大约按4:1比例混合在50mL离心管，滴加50％PEG1500，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基(HAT(H-Hypoxanthine次黄嘌呤，A-Aminopterin氨基蝶呤，T-Thymidine胸腺嘧啶核苷)选择性培养基)悬浮混匀，MC定容到50mL，分装到96孔板中，置于37℃、5％CO2恒温培养箱中进行培养。
(4)筛选和克隆：融合8天挑选细胞克隆，使用CD105抗原进行ELISA测试。标记细胞株号。对ELISA阳性的细胞株上清进行免疫组织化学检测(IHC检测)。对ELISA及IHC的阳性孔细胞进行有限稀释，稀释后在96孔板中培养。每孔100μL，置培养箱中培养。鉴定细胞上清，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。选出孔板全部为阳性且阳性值高的单克隆稳定株，得到分泌特异单克隆抗体的杂交瘤细胞1株，为813A5D5。
实施例2
单抗制备和纯化，采用以下两种方式：
方式一：将细胞株813A5D5用含15％血清的DMEM培养基于10cm培养皿中培养，扩倍至约4×107个时，1200rpm离心6分钟，弃上清并将细胞转移到2L转瓶中，加入无血清培养基。继续培养2周后，收取细胞悬液，离心后取上清，亲和层析法进行上清纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，单抗813A5D5亚型为IgG1，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装(100μL/管，浓度为1mg/mL)、于4-8℃冰箱中保存。
方式二:将液体石蜡注射入选取好的小鼠腹腔，刺激小鼠的免疫反应；一周后将细胞株813A5D5接种到小鼠腹腔中，一周后抽取腹水，将抽好的腹水放在离心管里，在天平上平衡，然后放进高速冷冻离心机中离心；离心结束后，弃除上层油脂及底部带血丝沉积物，将剩余液体用纱布过滤后加入饱和硫酸铵过夜，取沉淀，用PBS复溶，再利用亲和层析法进行纯化，根据抗体亚型选择相应柱料，单抗813A5D5亚型为IgG1，采用protein G进行纯化。纯化后的单抗浓度测定、分装(100μL/管，浓度为1mg/mL)、保存在4-8℃。
为了便于描述(与现有抗CD105单克隆抗体区分)，以下对杂交瘤细胞分泌的抗CD105特异性单克隆抗体简称为813A5D5抗CD105单克隆抗体或813A5D5抗CD105单抗。
现对上述两种方式制备的813A5D5抗CD105单克隆抗体进行测序：
依据试剂TriZol说明书，从杂交瘤细胞中分离出总RNA，依据TIANScript第一链cDNA合成试剂盒说明书，将总RNA逆转录成cDNA，根据特异性引物扩增VH、VL、CH和CL的抗体片段，将扩增的抗体片段分别克隆到标准克隆载体中、测序。
测序结果为：813A5D5抗CD105单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列由SEQ ID No：4所示的DNA序列所编码，抗CD105单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列由SEQ ID No：5所示的DNA序列所编码。对应地，抗CD105单克隆抗体的重链可变区氨基酸序列为SEQ ID No：6所示的氨基酸序列，CD105单克隆抗体的轻链可变区氨基酸序列为SEQ ID No：7所示的氨基酸序列。
实施例3
通过ELISA方法检测813A5D5抗体的亚型。结果显示813A5D5抗体的亚型为IgG1。
实施例4
制备H.ovary人卵巢癌细胞和人胎盘组织H.placenta的细胞裂解液，加入实施例2(方式一)制备的813A5D5抗CD105单克隆抗体，进行Western Blot检测。结果如图1所示，由图1结果可见，在H.ovary和H.placenta的细胞裂解液中，均能检测到明显的CD105蛋白的条带。
实施例5
对肺腺癌组织样本，使用813A5D5抗CD105单克隆抗体作为一抗的免疫组化检测。其步骤如下：
(1)样本准备：将福尔马林固定石蜡包埋切片于60℃恒温箱中烤片1-2小时，室温保存备用。
(2)脱蜡与水化：先将石蜡切片置于新鲜二甲苯中浸泡2次进行脱蜡，每次10min。再依次经过无水乙醇(2次，每次3min)，95％乙醇(3min)，85％乙醇(3min)，70％乙醇浸泡5min进行水化，后纯化水冲洗2次，每次3min。
(3)抗原修复：使用高温热修复法修复3min(如果使用自动修复仪可设置98℃高温修复20min)，待切片自然冷却至室温后用免疫组化笔将待测组织(本实施例中为肺腺癌组织)圈起来，纯化水冲洗2次，每次3min。
(4)内源性过氧化物酶灭活：滴适量内源性过氧化物酶阻断剂完全覆盖组织，室温孵育10min，纯化水冲洗2次，每次3min，PBST冲洗1次。
(5)一抗及空白对照抗体孵育：加入2滴相等浓度的813A5D5抗CD105单克隆抗体和对照市售CD105单抗完全覆盖组织，置于37℃恒温箱中孵育1h，PBST(含吐温-20的磷酸盐缓冲液)冲洗3次,每次5min。
(6)二抗孵育：依照所用二抗染色系统DAB染色液试剂盒的说明书进行二抗孵育，孵育完毕后PBST冲洗片3次，每次5min，纯化水冲洗1次。
(7)DAB显色：依照所用DAB染色液试剂盒说明书进行配制DAB显色液，滴适量配制好的DAB显色液至完全覆盖组织，待颜色无加深终止染色，纯化水冲洗3次。
(8)苏木素衬染：依照苏木素厂家说明书操作步骤及建议对切片进行复染，PBST或自来水冲洗返蓝。
(9)脱水透明：依次浸泡70％，85％，95％，100％，100％梯度酒精，每次3min；2次二甲苯透明，每次5min。
(10)封片：用中性树胶对样品进行封片。
对上述制作的封片使用荧光显微镜观察，结果如图2所示，CD105蛋白在肺腺癌组织中呈特异性细胞膜表达，并且813A5D5克隆的抗CD105单克隆抗体的检测信号显著强于市售CD105组。同等抗体浓度下，813A5D5抗CD105单克隆抗体的染色阳性信号较市售CD105组染色阳性信号显著增强，说明本抗体灵敏度更高，在产品设计中可以使用更低的抗体浓度，降低生产成本，同时在保证灵敏度的情况下降低背景。使病理医生根据CD105检测结果和经验进行评判时更加方便，对于检测区分免疫组织或免疫相关疾病更准确。
实施例6
使用813A5D5抗CD105单克隆抗体作为一抗的免疫组化检测。实验过程参照实施例5，只是肺腺癌组织改为“乳腺癌组织”。
对制作的封片使用荧光显微镜观察，结果如图3所示，CD105蛋白在乳腺癌组织中呈特异性细胞膜表达，并且813A5D5的CD105信号均显著强于市售CD105组。市售CD105组染色阳性信号较弱，在一些恶性程度较低或者早期癌症组织中会存在检测灵敏度低的问题，而本发明813A5D5抗CD105抗体由于其特异性好，阳性信号强等特点，在IHC染色中评分更容易，对于检测区分癌症更准确。
实施例7
813A5D5抗CD105单克隆抗体的亲和力测定，方法如下：
(1)从4℃中取出如序列SEQ ID NO:1-3的CD105的多肽抗原。恢复至室温。配置不同多肽摩尔浓度，取100μL/孔加到96孔板上。
(2)将813A5D5抗体稀释成初始质量浓度0.125μg/mL，抗体分子量为150kD，摩尔浓度约为0.83nmol/L。
(3)将稀释好的813A5D5抗CD105单克隆抗体按照100μL/孔添加至有多肽的96孔酶标板上，盖上封板膜，37℃恒温孵育1h，使反应达到平衡。
(4)将酶标板从37℃孵育室取出，弃掉液体，纯化水冲洗5次，拍干水分。
(5)按照二抗使用说明书，将稀释HRP标记羊抗鼠IgG，以100μL/孔加入酶标板中，37℃恒温孵育1h，使反应达到平衡。
(6)将酶标板从37℃孵育室取出，倒空液体，冲洗5次，拍干水分。
(7)每孔100μL加入TMB显色液，室温反应6分钟。
(8)每孔50μL 2M H2SO4终止显色。
(9)在酶标仪上于450nm读取OD值，整理数据，分析结果。
结果显示，在多肽摩尔浓度0.41μmol/L时，813A5D5抗CD105单克隆抗体亲和力常数为：8×10-7(mol/L)。
实施例8
利用本发明公开的813A5D5抗CD105单克隆抗体的氨基酸序列及DNA序列见SEQ IDNO：4-7，体外构建CD105抗体的表达载体。该表达载体经大肠杆菌扩增抽提并去内毒素，转染Expi-293F细胞，转染后继续培养，收集细胞上清，采用亲和层析法纯化，获得抗CD105特异性单克隆抗体。
具体方法如下：
(1)表达载体构建：将抗CD105特异性单克隆抗体的轻链可变区(VL)序列(SEQ IDNO：7)构建至鼠抗体轻链的κ链恒定区(SEQ ID NO:8)，将抗CD105特异性单克隆抗体的重链可变区(VH)的序列(SEQ ID NO：6)构建至鼠抗体重链的恒定区，优选为鼠IgG1(SEQ ID NO:9)。重组抗体重链/轻链氨基酸的N端加入优化信号肽进行分泌表达，将重组抗体的氨基酸进行密码子优化，核苷酸的5’端加入Kozak序列GCCGCCACC，核苷酸两端加入pcDNA3.4的酶切位点EcoRI/HindIII，合成的基因经酶切后连接到pcDNA3.4载体，得到表达载体。
(2)转染：表达载体经大肠杆菌扩增抽提并去内毒素，按照质粒：培养基＝1μg/ml转染Expi-293F细胞。所用转染试剂为ExpiFectamine293Transfection Kit(Theromfisher，Lot#：A14524)，转染时细胞密度为25*105cells/ml，转染后18h添加表达增强剂Enhancer1及Enhancer2，转染后5天收集细胞上清。
(3)Protein A纯化：在4℃条件下以10000rpm/min，离心30min上清液去除细胞碎片，Protein A柱子用平衡液(0.02MPB、0.15M NaCl、pH7.0)平衡10个柱体积后，以2ml/min的速度使上清液流过柱子，上样完成后，使用平衡液对结合后的柱子清洗5个柱体积，加入洗脱液(0.02M PB、0.15M NaCl、pH3.0)洗脱，洗脱液滴入到加入中和液(1M Tris，pH9.0)收集管中。收集到蛋白洗脱液，使用超滤管(Millipore UFC903096)4000G超滤浓缩并置换buffer成PBS(HyClone SH30256.01)，SDS-PAGE电泳检测后放到-20℃保存。去内毒素，过滤除菌，SDS-PAGE电泳检测纯度。
使用上述方法制备的抗CD105特异性单克隆抗体，加入到人胎盘组织H.placenta的细胞裂解液中，进行Western Blot检测，能够检测到明显的CD105蛋白的条带，与图1所示情况相同。
除上述制备方法外，在进行大规模生产本发明的813A5D5抗CD105单克隆抗体时，还可以根据本发明公开的抗体编码序列，构建质粒载体，转到细胞中得到稳定表达细胞株，用发酵罐发酵培养，获取稳转株细胞上清液或裂解液，采用亲和层析法纯化，生产制备813A5D5抗CD105单克隆抗体。
最后应说明的是：本领域技术人员，在基于本申请公开的813A5D5抗CD105单克隆抗体的氨基酸序列及编码该氨基酸序列的DNA序列上，采用任何现有方法或将来可能的方法生产制备813A5D5抗CD105单克隆抗体，也均应当被涵盖在本申请要求专利保护的范围内。同样地，对本发明813A5D5抗CD105单克隆抗体的任何形式的商业化应用，包括但不限于试剂盒、抗体芯片等相应产品，也均应当被涵盖在本申请要求专利保护的范围内。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 苏州百道医疗科技有限公司
<120> 一种抗CD105特异性单克隆抗体及其应用
<130> EJS201441I
<141> 2021-01-18
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
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Asp Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser Ser Ser Ile Ser Tyr Ile
20 25 30
His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Thr Ser Pro Lys Arg Trp Ile Tyr
35 40 45
Leu Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser
50 55 60
Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Ser Met Glu Ala Glu
65 70 75 80
Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Val Gln Arg Ser Phe Tyr Asp Trp Thr
85 90 95
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 8
<211> 107
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 8
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1 5 10 15
Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu Asn Asn Phe
20 25 30
Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Ser Glu Arg
35 40 45
Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
50 55 60
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp Glu Tyr Glu
65 70 75 80
Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr Ser Thr Ser
85 90 95
Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys
100 105
<210> 9
<211> 324
<212> PRT
<213> Artificial Sequence
<400> 9
Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala
1 5 10 15
Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr
20 25 30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser
35 40 45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu
50 55 60
Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val
65 70 75 80
Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys
85 90 95
Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro
100 105 110
Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu
115 120 125
Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser
130 135 140
Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu
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Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr
165 170 175
Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn
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Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro
195 200 205
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210 215 220
Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val
225 230 235 240
Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val
245 250 255
Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln
260 265 270
Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn
275 280 285
Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val
290 295 300
Leu His Glu Gly Leu His Asn His His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His
305 310 315 320
Ser Pro Gly Lys
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