一种轮状病毒vp7重组蛋白及其应用
阅读说明：本技术 一种轮状病毒vp7重组蛋白及其应用 (Rotavirus VP7 recombinant protein and application thereof ) 是由 张莉莉 方荣祥 宋直钰 谢传淼 霍岩 张玉满 瞿维欢 刘超仁 于 2020-11-06 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种轮状病毒VP7重组蛋白及其应用,所述VP7重组蛋白为序列2所述的氨基酸序列的短截体,所述短截体不含序列2中第284-322位的序列。使用所述VP7重组蛋白(△VP7*)免疫兔获得的△VP7*抗体,检测其保护细胞抵抗轮状病毒RF毒株(G6P[1]型)侵染的中和抗体保护效价为1:21.97。本发明的VP7重组蛋白为通过该抗原设计重组亚单位疫苗,预防现阶段HRV流行株的感染提供了分子基础。(The invention discloses a rotavirus VP7 recombinant protein and application thereof, wherein the VP7 recombinant protein is a truncation of an amino acid sequence described in a sequence 2, and the truncation does not contain a sequence at the 284-322 th site in the sequence 2. The antibody Δ VP7 obtained by immunizing rabbits with the VP7 recombinant protein (Δ VP7) was tested for a protective titer of neutralizing antibody against infection of rotavirus RF strain (G6P [1 ]) of 1: 21.97. The VP7 recombinant protein provides a molecular basis for designing a recombinant subunit vaccine through the antigen and preventing the infection of HRV epidemic strains at the present stage.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，涉及一种轮状病毒△VP7无细胞毒性重组蛋白及其应用。
背景技术
轮状病毒(Rotavirus，RV)是引起婴幼儿严重腹泻的主要病因，每年造成约几十万病例婴幼儿死亡，接种疫苗是唯一有效的防控手段。目前上市的RV疫苗均为口服减毒活疫苗，因其潜在的肠套叠风险，被WHO列为“工艺需要改进的疫苗”。亚单位疫苗是以病毒的保护性抗原为核心辅以佐剂制成的疫苗，这种疫苗具有很好的安全性，且能刺激机体产生足够的免疫力。同时亚单位疫苗能实现对流行毒株的精准免疫，应对RV的快速变异。
RV主要的中和抗原为VP7(G蛋白)和VP4(P蛋白)，目前至少已鉴定出27个G基因型。国内人轮状病毒RV(HRV)的分子流行具有阶段性，2000年以前G1是主要的流行G型(74.3％)，而2000-2012年则以G3型(45.2％)为主，其次是G1型(21.3％)。自2012年起，G9型RV被证实为目前国内主要的流行株。值得注意的是，按照VP7基因的进化树分支特征(G9-I～G9-VI型)，目前的流行株为G9-VI(占96.5％)，与国内九十年代初的G9-I型和国外广泛流行的G9-III型均不相同。这些流行株是否改变了对人类的致病力，是否现有疫苗能产生良好的保护性尚需进一步调查。按照流行株的VP7序列设计亚单位疫苗是实现精准免疫的策略之一，但VP7基因全长表达时引起的细胞毒性限制了其开发进程。
发明内容
本发明的目的是以现阶段北京的HRV流行株BJ-Q794为目标毒株，在大肠杆菌获得无毒的△VP7序列，为HRV防控提供潜在的候选疫苗。
本发明提供一种蛋白质，所述的蛋白质为A1)或A2)：
A1)VP7重组蛋白，所述VP7重组蛋白为序列2所述的氨基酸序列的短截体，所述短截体不含序列2中第284-322位的序列；
A2)在A1)的N端或/和C端连接标签得到的融合蛋白质。
所述VP7重组蛋白的氨基酸序列为序列2中第51-283位所示的序列。
本发明还提供一种与所述VP7重组蛋白相关的生物材料为如下B1)-B5)中任一所示：
B1)编码所述蛋白质的核酸分子；
B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；
B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；
B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；
B5)含有B1)所述核酸分子的转基因动物细胞系、或含有B2)所述表达盒的转基因动物细胞系。
所述B1)为序列表中序列1中第151-849位所示的DNA分子。
本发明所述蛋白质在如下P1-P3中任一所示的应用也应在本发明的保护范围之内：
P1.所述蛋白质在制备抗轮状病毒血清中的应用；
P2.所述蛋白质在制备轮状病毒抗体中的应用；
P3.所述蛋白质在制备抗轮状病毒疫苗中的应用。
本发明中与上述蛋白质相关的生物材料在如下Q1-Q3中任一所示的应用也应在本发明的保护范围之内：
Q1.所述生物材料在制备抗轮状病毒血清中的应用；
Q2.所述生物材料在制备轮状病毒抗体中的应用；
Q3.所述生物材料在制备抗轮状病毒疫苗中的应用。
本发明提供一种抗轮状病毒血清的制备方法，包括使用所述的蛋白质免疫动物，获得抗轮状病毒血清的步骤。
所述的抗轮状病毒血清的制备方法在如下R1-R3中任一所示的应用也应在本发明的保护范围之内：
R1.所述的制备方法在制备抗轮状病毒血清中的应用；
R2.所述的制备方法在制备轮状病毒抗体中的应用；
R3.所述的制备方法在制备抗轮状病毒疫苗中的应用。
本发明的有益效果在于：提供了一种HRV流行株的主要抗原的截短体VP7重组蛋白，所述VP7重组蛋白无细胞毒性，使用所述VP7重组蛋白(△VP7*)免疫兔获得的△VP7*抗体，检测其保护细胞抵抗轮状病毒RF毒株(G6P[1]型)侵染的中和抗体保护效价为1:21.97。本发明的VP7重组蛋白为通过该抗原设计重组亚单位疫苗，预防现阶段HRV流行株的感染提供了分子基础。
附图说明
图1.GST(谷胱甘肽巯基转移酶)诱导表达的Western结果。
图2.Transetta(DE3)-△VP7-1诱导表达的Western结果。
图3.Transetta(DE3)-△VP7-9诱导表达的Western结果。
图4.Transetta(DE3)-△VP7-10，Transetta(DE3)-△VP7-11诱导表达的Western结果。
图5.Transetta(DE3)-△VP7-12诱导表达的Western结果。
图6.Transetta(DE3)-△VP7-15和Transetta(DE3)-△VP7-16诱导表达的Western结果。
图7.△VP7示意图，灰色表示无毒重组蛋白，黑色表示有毒重组蛋白，其中有毒区为284-322氨基酸片段.
图8.重组蛋白△VP7*诱导表达的Western结果。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1.VP7和△VP7的构建
合成BJ-Q794的VP7的全基因序列(委托上海捷瑞生物工程有限公司进行序列合成)，所述VP7的氨基酸序列如序列表中的序列2所示，编码VP7的全基因(核苷酸)序列如序列表中的序列1所示。将VP7的全基因序列插入到pGH载体(上海捷瑞生物工程有限公司)的SmaI与SalI位点之间，并保持pGH载体的其他序列不变，获得重组质粒pGH-J1-VP7。HRV流行株BJ-Q794(基因型G9P[8]，GenBank序列号：KF673438)为目标毒株(参考文献：董慧瑾等，北京腹泻儿童中G9-VI轮状病毒再次出现并呈优势流行，病毒学报，2016,32(4)：DOI:10.13242/j.cnki.bingduxuebao.002983)。
按照VP7蛋白的结构分析，设计一系列截短体，分别为△VP7-1、△VP7-2、△VP7-3、△VP7-4、△VP7-5、△VP7-6、△VP7-7、△VP7-8、△VP7-9、△VP7-10、△VP7-11、△VP7-12、△VP7-13、△VP7-14、△VP7-15、△VP7-16、△VP7-17和△VP7*，其中，△VP7-1的氨基酸序列为序列1的第55-326位，△VP7-2的氨基酸序列为序列1的第51-326位，△VP7-3的氨基酸序列为序列1的第58-326位，△VP7-4的氨基酸序列为序列1的第63-326位，△VP7-5的氨基酸序列为序列1的第79-327位，△VP7-6的氨基酸序列为序列1的第109-326位，△VP7-7的氨基酸序列为序列1的第51-322位，△VP7-8的氨基酸序列为序列1的第109-215位，△VP7-9的氨基酸序列为序列1的第216-322位，△VP7-10的氨基酸序列为序列1的第216-265位，△VP7-11的氨基酸序列为序列1的第266-322位，△VP7-12的氨基酸序列为序列1的第266-322位，△VP7-13的氨基酸序列为序列1的第293-322位，△VP7-14的氨基酸序列为序列1的第284-322位，△VP7-15的氨基酸序列为序列1的第284-304位，△VP7-16的氨基酸序列为序列1的第284-312位，△VP7-17的氨基酸序列为序列1的第51-265位，△VP7*的氨基酸序列为序列1的第51-283位，并对应上述短截体设计引物如表1所示。以重组质粒pGH-J1-VP7为模板，分别以表1中的引物对为引物进行扩增，得到扩增产物VP7、△VP7-1、△VP7-2、△VP7-3、△VP7-4、△VP7-5、△VP7-6、△VP7-7、△VP7-8、△VP7-9、△VP7-10、△VP7-11、△VP7-12、△VP7-13、△VP7-14、△VP7-15、△VP7-16、△VP7-17和△VP7*。分别用得到的扩增产物替换pGEX-3X载体(GE公司)中XmaI和EcoRI识别位点之间的序列，并保持pGEX-3X载体的其他序列不变，得到重组载体pGEX-3X-VP7、pGEX-3X-△VP7-1、pGEX-3X-△VP7-2、pGEX-3X-△VP7-3、pGEX-3X-△VP7-4、pGEX-3X-△VP7-5、pGEX-3X-△VP7-6、pGEX-3X-△VP7-7、pGEX-3X-△VP7-8、pGEX-3X-△VP7-9、pGEX-3X-△VP7-10、pGEX-3X-△VP7-11、pGEX-3X-△VP7-12、pGEX-3X-△VP7-13、pGEX-3X-△VP7-14、pGEX-3X-△VP7-15、pGEX-3X-△VP7-16、pGEX-3X-△VP7-17和pGEX-3X-△VP7*，各重组载体能表达VP7蛋白或相应VP7蛋白截短体N端融合GST标签所形成的融合蛋白；分别将重组载体pGEX-3X-VP7、pGEX-3X-△VP7-1、pGEX-3X-△VP7-2、pGEX-3X-△VP7-3、pGEX-3X-△VP7-4、pGEX-3X-△VP7-5、pGEX-3X-△VP7-6、pGEX-3X-△VP7-7、pGEX-3X-△VP7-8、pGEX-3X-△VP7-9、pGEX-3X-△VP7-10、pGEX-3X-△VP7-11、pGEX-3X-△VP7-12、pGEX-3X-△VP7-13、pGEX-3X-△VP7-14、pGEX-3X-△VP7-15、pGEX-3X-△VP7-16、pGEX-3X-△VP7-17和pGEX-3X-△VP7*转化大肠杆菌Trans10(北京全式金生物技术有限公司)，获得一系列携带正确△VP7序列的重组质粒，各重组质粒转化大肠杆菌Transetta(DE3)(北京全式金生物技术有限公司)，分别为大肠杆菌Transetta(DE3)-VP7、Transetta(DE3)-△VP7-1、Transetta(DE3)-△VP7-2、Transetta(DE3)-△VP7-3、Transetta(DE3)-△VP7-4、Transetta(DE3)-△VP7-5、Transetta(DE3)-△VP7-6、Transetta(DE3)-△VP7-7、Transetta(DE3)-△VP7-8、Transetta(DE3)-△VP7-9、Transetta(DE3)-△VP7-10、Transetta(DE3)-△VP7-11、Transetta(DE3)-△VP7-12、Transetta(DE3)-△VP7-13、Transetta(DE3)-△VP7-14、Transetta(DE3)-△VP7-15、Transetta(DE3)-△VP7-16、Transetta(DE3)-△VP7-17和Transetta(DE3)-△VP7*，以上述大肠杆菌为宿主菌进行融合蛋白的诱导表达。
表1表达VP7和ΔVP7的PCR引物
实施例2.VP7和△VP7融合蛋白的诱导表达
1.将实施例1中制备的大肠杆菌Transetta(DE3)-VP7以LB液体培养基进行培养，转速220rpm，37℃培养过夜(16小时)。按照1:1000的比例转接至500ml新鲜的培养基中，继续培养至OD600约0.35-0.5之间，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。融合蛋白诱导表达的方法为：37℃，220rpm，诱导培养4小时，于4℃离心收集沉淀的菌体，准备用于融合蛋白的提取。
2.将步骤1中的融合蛋白诱导表达的方法替换为：16℃，180rpm，培养过夜(16小时)，4℃离心收集沉淀的菌体，准备用于融合蛋白的提取。其他步骤不变。
3.将步骤1或2所得菌体，加PBS缓冲液充分悬浮，加入4×SDS-PAGE的上样缓冲液(Bio-rad，货号：1610747)，水浴煮沸5min裂解菌体，离心收集含有融合蛋白的上清液，通过SDS-PAGE对蛋白进行凝胶分离，Western blots检测蛋白表达情况。Western blots的一抗为Rabbit polyclonal to GST(Abcam，货号：ab19256)，1:1000稀释。二抗为Anti-RabbitIgG(H+L),HRP Conjugate(Promega，货号：W4011)，1:1000稀释。使用化学发光底物(ThermoFisher,SuperSignal West Dura，货号：A38555)进行显影。
将步骤1-3中的大肠杆菌Transetta(DE3)-VP7依次替换为大肠杆菌Transetta(DE3)-△VP7-1、Transetta(DE3)-△VP7-2、Transetta(DE3)-△VP7-3、Transetta(DE3)-△VP7-4、Transetta(DE3)-△VP7-5、Transetta(DE3)-△VP7-6、Transetta(DE3)-△VP7-7、Transetta(DE3)-△VP7-8、Transetta(DE3)-△VP7-9、Transetta(DE3)-△VP7-10、Transetta(DE3)-△VP7-11、Transetta(DE3)-△VP7-12、Transetta(DE3)-△VP7-13、Transetta(DE3)-△VP7-14、Transetta(DE3)-△VP7-15、Transetta(DE3)-△VP7-16、Transetta(DE3)-△VP7-17或Transetta(DE3)-△VP7*。其他步骤不变。
结果如图1-6所示，图1为GST(谷胱甘肽巯基转移酶)诱导表达的Western blot结果。其中菌体(Transetta(DE3)-VP7)在37℃进行诱导，一抗为GST的抗体。箭头所示为GST蛋白，大小为26.6kDa。泳道1、2分别为：未诱导菌体全蛋白、诱导菌体全蛋白。图2.Transetta(DE3)-△VP7-1诱导表达的Western blot结果。其中A和B图中菌体分别在37℃(A)和16℃(B)进行诱导，一抗为GST的抗体。箭头所示为融合GST标签的△VP7-1融合蛋白，大小为57.5kDa。泳道1-6分别为：未诱导菌体可溶蛋白、未诱导菌体不可溶蛋白、未诱导菌体全蛋白、诱导菌体可溶蛋白、诱导菌体不可溶蛋白、诱导菌体全蛋白。图3为Transetta(DE3)-△VP7-9诱导表达的Western blot结果。其中菌体分别在37℃和16℃进行诱导，一抗为GST的抗体。箭头所示为融合GST标签的△VP7-9融合蛋白，大小为38.8kDa。泳道1-4分别为：37℃未诱导菌体全蛋白、37℃诱导菌体全蛋白、16℃未诱导菌体全蛋白、16℃诱导菌体全蛋白。图4为Transetta(DE3)-△VP7-10和Transetta(DE3)-△VP7-11诱导表达的Western blot结果。其中菌体分别在37℃和16℃进行诱导，一抗为GST的抗体。1-4泳道箭头所示为融合GST标签的△VP7-10融合蛋白，大小为32.0kDa。5-8泳道箭头所示为融合GST标签的△VP7-11融合蛋白，大小为32.0kDa。泳道1-4，5-8分别为：37℃未诱导菌体全蛋白、37℃诱导菌体全蛋白、16℃未诱导菌体全蛋白、16℃诱导菌体全蛋白。图5为Transetta(DE3)-△VP7-12诱导表达的Western blot结果。其中菌体分别在37℃和16℃进行诱导，一抗为GST的抗体。箭头所示为融合GST标签的△VP7-12融合蛋白，大小为29.8kDa。泳道1-3分别为：37℃未诱导菌体全蛋白、37℃诱导菌体全蛋白、16℃诱导菌体全蛋白。图6为Transetta(DE3)-△VP7-15和Transetta(DE3)-△VP7-16诱导表达的Western blot结果。其中菌体分别在37℃和16℃进行诱导，一抗为GST的抗体。1-3泳道箭头所示为融合GST标签的△VP7-15融合蛋白，大小为29.4kDa。4-6泳道箭头所示为融合GST标签的△VP7-16融合蛋白，大小为30.3kDa。泳道1-3，4-6分别为：37℃未诱导菌体全蛋白、37℃诱导菌体全蛋白、16℃诱导菌体全蛋白。泳道7为37℃诱导GST菌体全蛋白
通过VP7和各△VP7融合蛋白诱导表达后，宿主菌的生长对细胞毒性进行判断。VP7和各△VP7融合蛋白诱导表达前后宿主菌的OD600测定如表2：
表2各种ΔG9P[8]VP7蛋白诱导后OD600
根据表2中的结果可以看出，只有△VP7-8(109-215)、△VP7-10(216-265)、△VP7-12(266-292)和△VP7*(51-283)在加入IPTG进行诱导培养后，宿主细胞能够继续繁殖(OD600值显著增长)，表明短截体△VP7-8(109-215)、△VP7-10(216-265)、△VP7-12(266-292)和△VP7*(51-283)没有细胞毒性，其他短截体均具有细胞毒性，如图7所示。图7表示各△VP7截取序列，其中，灰色表示无毒重组蛋白，黑色表示有毒重组蛋白，其中有毒区为284-322氨基酸片段。
实施例3.△VP7*融合蛋白的纯化、抗体制备及抗体滴度检测
1、将实施例1中制备的大肠杆菌Transetta(DE3)-△VP7*以LB液体培养基进行培养，转速220rpm，37℃培养过夜(16小时)。按照1:1000的比例转接至新鲜的培养基中，继续培养至OD600约0.35-0.5之间，加入终浓度为0.1mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)进行诱导。诱导表达的方法为：16℃，180rpm，培养过夜(16小时)，4℃离心收集沉淀的菌体，准备用于融合蛋白△VP7*的提取。
2、离心收集菌体(500ml)，用含有蛋白酶抑制剂的PBS重悬，离心去除上清液，再次用20ml含有蛋白酶抑制剂的PBS重悬并置于冰上。
3、通过低温超高压连续流细胞破碎仪破碎菌体。
4、离心收集可溶蛋白。
5、通过GST标签进行蛋白纯化，用Glutathione Sepharose 4 Fast Flow(GEHealthcare，17-5132-01)凝胶柱纯化蛋白，用含20mM reduced glutathione的50mM Tris-HCl pH＝8.0洗脱目的蛋白，超滤浓缩目的蛋白，并将蛋白的保存溶液换成PBS溶液，即得到GST-△VP7*溶液。蛋白纯度为85％，通过bradford方式进行定量。
在大肠杆菌中表达的△VP7*融合蛋白(记为GST-△VP7*)，由序列2的第51-283位所示的△VP7*(大小为26kDa)与N端的GST标签融合而成，大小为26.88kDa，GST-△VP7*大小为52.58kDa。GST-△VP7*纯度85％，见图8。500ml大肠杆菌菌液中纯化得到0.75mg GST-△VP7*融合蛋白。
6、将纯化的GST-△VP7*免疫兔(北京维通利华实验动物技术有限公司)制备抗体(免疫实验在中国科学院遗传与发育生物学研究所动物中心中进行)，免疫分四次进行，第一次免疫用弗氏完全佐剂(sigma公司)按1:1体积与步骤5所得GST-△VP7*溶液混合所得混合液，GST-△VP7*用量为0.5mg，第二次免疫用弗氏不完全佐剂(sigma公司)按1:1体积与步骤5所得GST-△VP7*溶液混合所得混合液，GST-△VP7*用量为0.25mg，第三次免疫用弗氏不完全佐剂(sigma公司)按1:1体积与步骤5所得GST-△VP7*溶液混合所得混合液，GST-△VP7*用量为0.25mg，第四次免疫用弗氏不完全佐剂(sigma公司)按1:1体积与步骤5所得GST-△VP7*溶液混合所得混合液，GST-△VP7*用量为0.5mg，每次免疫间隔时间为14天，最后一次免疫结束后3周，麻醉后颈动脉插管取血，得到血清。
7、检测所得血清的中和抗体效价：
1)将MA104细胞(猴胎肾细胞)传代至96孔板中，培养16-20小时。
2)取供试血清，60℃水浴30min以灭活补体，然后采用含2μg/ml胰酶的MEM培养基进行4倍梯度稀释，得到各个血清稀释液。
3)取轮状病毒RF毒株(G6P[1]型)(记载于文献James E Richards,UlrichDesselberger*,Andrew M Lever*.Experimental pathways towards developing arotavirus reverse genetics system:synthetic full length rotavirus ssRNAs areneither infectious nor translated in permissive cells.PLoS One.8(9):e74328,2013.中)，加入无EDTA胰酶并使其浓度为10μg/ml，然后37℃孵育1小时，然后用含2μg/ml胰酶的MEM培养基稀释至200TCID50。
4)将步骤2)得到的血清稀释液和步骤3)得到的病毒液等体积混合，37℃孵育1小时。
5)完成步骤1)后，用MEM培养基清洗细胞3遍，然后每孔加入20μl步骤4)得到的混合液，37℃孵育1h。
6)完成步骤5)后，吸弃上清，加入含2μg/ml胰酶的MEM培养基，37℃培养3天。
7)完成步骤6)后，观察细胞病变情况，计算血清中和抗体效价。
lg(TCID50)＝高于50％血清稀释度的对数-距离比×稀释系数的对数＝n
TCID50＝10n,20μl
10n＝1:m，即1:m的血清可保护细胞不病变，即为该份血清的中和抗体效价。
免疫兔获得的△VP7*抗体，检测其保护细胞抵抗轮状病毒RF毒株(G6P[1]型)侵染的中和抗体保护效价为1:21.97。
以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。
序列表
<110> 植链（上海）生物科技有限公司
<120> 一种轮状病毒VP7重组蛋白及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 981
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgtatggta ttgaatatac cacagttcta acctttctga tatcaatagt tttattgaac 60
tacatattaa aatcactaac tagtgcgatg gactttatac tttatagatt tcttttactt 120
attgttattt tgtcgccatt tgtcaaaaca caaaattatg ggataaattt accaattact 180
ggctccatgg acacagtata tgcaaattcg tcacagcaag aaacattttt aacttcaacg 240
ctatgtttat attatcctac tgaagcatca actcaaattg gagatactga atggaagaat 300
actctatctc aattattctt gactaagggg tggccaactg gatcagtcta ttttaaagaa 360
tatacagata tcgcttcatt ctcaattgat ccacaacttt attgtgatta taatgttgtg 420
ctaatgaagc atgattcaac gttagagcta gatatgtcag aattggctga tttgattcta 480
aatgaatggt tatgcaatcc aatggatata acattatatt attatcagca aacagatgaa 540
tcgaataaat ggatatcgat gggacaatct tgtaccataa aagtgtgccc attaaataca 600
caaactttag gaataggttg tactactaca aatacagcga catttgaaga agtagctact 660
agtgagaaat tagtgataac tgatgttgtt gatggcgtga atcataagct tgatgtaact 720
acaaatacct gtacaattag aaattgtaag aagttaggac cgagagaaaa tgtagcaatt 780
atacaagtcg gtggctcaga agtgttagat attacagcgg atccaactac cacaccacaa 840
actgagcgta tgatgcgagt aaattggaag aaatggtggc aagttttcta tacagtagta 900
gattacatta atcagattgt gcaatttatg tccaaaagat cacggtcatt aaattcagca 960
gctttttatt atagagtctg a 981
<210> 2
<211> 326
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Met Tyr Gly Ile Glu Tyr Thr Thr Val Leu Thr Phe Leu Ile Ser Ile
1 5 10 15
Val Leu Leu Asn Tyr Ile Leu Lys Ser Leu Thr Ser Ala Met Asp Phe
20 25 30
Ile Leu Tyr Arg Phe Leu Leu Leu Ile Val Ile Leu Ser Pro Phe Val
35 40 45
Lys Thr Gln Asn Tyr Gly Ile Asn Leu Pro Ile Thr Gly Ser Met Asp
50 55 60
Thr Val Tyr Ala Asn Ser Ser Gln Gln Glu Thr Phe Leu Thr Ser Thr
65 70 75 80
Leu Cys Leu Tyr Tyr Pro Thr Glu Ala Ser Thr Gln Ile Gly Asp Thr
85 90 95
Glu Trp Lys Asn Thr Leu Ser Gln Leu Phe Leu Thr Lys Gly Trp Pro
100 105 110
Thr Gly Ser Val Tyr Phe Lys Glu Tyr Thr Asp Ile Ala Ser Phe Ser
115 120 125
Ile Asp Pro Gln Leu Tyr Cys Asp Tyr Asn Val Val Leu Met Lys His
130 135 140
Asp Ser Thr Leu Glu Leu Asp Met Ser Glu Leu Ala Asp Leu Ile Leu
145 150 155 160
Asn Glu Trp Leu Cys Asn Pro Met Asp Ile Thr Leu Tyr Tyr Tyr Gln
165 170 175
Gln Thr Asp Glu Ser Asn Lys Trp Ile Ser Met Gly Gln Ser Cys Thr
180 185 190
Ile Lys Val Cys Pro Leu Asn Thr Gln Thr Leu Gly Ile Gly Cys Thr
195 200 205
Thr Thr Asn Thr Ala Thr Phe Glu Glu Val Ala Thr Ser Glu Lys Leu
210 215 220
Val Ile Thr Asp Val Val Asp Gly Val Asn His Lys Leu Asp Val Thr
225 230 235 240
Thr Asn Thr Cys Thr Ile Arg Asn Cys Lys Lys Leu Gly Pro Arg Glu
245 250 255
Asn Val Ala Ile Ile Gln Val Gly Gly Ser Glu Val Leu Asp Ile Thr
260 265 270
Ala Asp Pro Thr Thr Thr Pro Gln Thr Glu Arg Met Met Arg Val Asn
275 280 285
Trp Lys Lys Trp Trp Gln Val Phe Tyr Thr Val Val Asp Tyr Ile Asn
290 295 300
Gln Ile Val Gln Phe Met Ser Lys Arg Ser Arg Ser Leu Asn Ser Ala
305 310 315 320
Ala Phe Tyr Tyr Arg Val
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