一种抗菌肽及其应用
阅读说明：本技术 一种抗菌肽及其应用 (Antibacterial peptide and application thereof ) 是由 谭臣 鲁浩 鲁文嘉 王晨晨 李晓丹 王高岩 于 2021-06-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗菌肽及其应用,属于微生物传染病及医药领域。本发明抗菌肽的氨基酸序列为RLLRKFFRKL,其具有广谱抗菌活性、低毒性、无溶血毒性、中和外毒素LPS的特点。本发明的抗菌肽可用于制备抗菌剂、制备预防或治疗细菌感染的药物,其对耐药菌(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌等)的抗菌效果优于临床常用药物。本发明的抗菌肽L-1的氨基酸序列大大缩短,大幅降低了生产成本,其有望成为新型抗生素的候选药物,在临床抗菌药物中具有良好的应用前景。(The invention discloses an antibacterial peptide and application thereof, belonging to the fields of microbial infectious diseases and medicines. The amino acid sequence of the antibacterial peptide is RLLRKFFRKL, and the antibacterial peptide has the characteristics of broad-spectrum antibacterial activity, low toxicity, no hemolytic toxicity and exotoxin LPS neutralization. The antibacterial peptide can be used for preparing antibacterial agents and medicines for preventing or treating bacterial infection, and has an antibacterial effect on drug-resistant bacteria (escherichia coli, klebsiella pneumoniae and the like) superior to that of clinical common medicines. The amino acid sequence of the antibacterial peptide L-1 is greatly shortened, the production cost is greatly reduced, and the antibacterial peptide L-1 is expected to become a candidate drug of a novel antibiotic and has a good application prospect in clinical antibacterial drugs.)
技术领域
本发明涉及微生物传染病及医药领域，具体涉及一种抗菌肽及其应用。
背景技术
细菌对抗生素的耐药性日益普遍，这是一个严重的公共卫生问题。由耐抗生素细菌引起的感染与世界范围内的显著发病率和死亡率有关。以前对抗多药耐药(MDR)细菌的许多努力都集中在耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)上。近年来，MRSA出现了几种新的治疗选择(David.etl，2017)。因此目前，耐抗生素细菌的主要威胁来自耐多药革兰氏阴性生物，特别是那些对碳青霉烯产生耐药性的生物。连同耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌(CRAB)和耐碳青霉烯类铜绿假单胞菌(CRPA)、耐碳青霉烯肠杆菌科(CRE)是WHO对人类健康构成最大威胁的抗生素耐药性“优先病原体”清单的顶级之一。天然抗菌肽由于代谢不稳定、生产成本高、容易引起溶血副作用等缺点限制了它们进一步的临床应用。氨基酸替换修饰多肽序列是改善抗菌活性和细胞毒性最简单最常用的一种方法。
发明内容
本发明的目的在于提供一种具有广谱抗菌活性、低毒性，且无诱导耐药新型抗菌肽。
本发明的目的通过下述技术方案实现：
本发明提供的具有广谱抗菌活性、低毒性且无诱导耐药性的抗菌肽，是以带状金环蛇毒素为模板(GenBank登录号EU753183)，选取其中具有α螺旋特性的一段，再添加高度α螺旋的短序列构造而成，记为L-1，其氨基酸序列为RLLRKFFRKL。抗菌肽L-1的螺旋轮投影如图1所示。体外抗菌实验、细胞毒性实验、溶血活性实验和内毒素LPS中和实验表明，抗菌肽L-1具有广谱抗菌活性，对耐碳青霉烯和粘菌素的革兰氏阴性菌具有很好的抑制效果；此外抗菌肽L-1还有低毒性、无溶血毒性、中和内毒素LPS的特点。动物实验表明，抗菌肽L-1对耐碳青霉烯的大肠杆菌有很好的体内保护效果，优于临床常用药物。
本发明提供抗菌肽L-1的如下应用：抗菌肽L-1在抗菌中的应用，该应用为非疾病治疗的目的；抗菌肽L-1在制备抗菌剂中的应用；抗菌肽L-1在制备预防或治疗细菌感染的药物中的应用。
一种抗菌剂，包含所述的抗菌肽L-1。
一种预防或治疗细菌感染的药物，包含所述的抗菌肽L-1。
所述的菌包括革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，所述的革兰氏阳性菌包括金黄色葡萄球菌、猪链球菌，所述的革兰氏阴性菌包括大肠杆菌、肺炎克雷伯菌。
所述的菌为耐药菌，包括耐药的金黄色葡萄球菌、猪链球菌、大肠杆菌、肺炎克雷伯菌。
本发明具有如下优点和有益效果：
(1)本发明的抗菌肽L-1具有广谱抗菌活性、低毒性且无诱导耐药性的优点。
(2)本发明的抗菌肽L-1的氨基酸序列大大缩短，大幅降低了生产成本。
(3)本发明的抗菌肽L-1与常用抗生素无交叉耐药性。
(4)本发明的抗菌肽L-1有望成为新型抗生素的候选药物，在临床抗菌药物中具有良好的应用前景。
附图说明
图1是抗菌肽L-1的螺旋轮投影图，显示其具有良好两亲性。
图2是实施例2使用WST-1法检测L-1对vero细胞毒性的结果图。
图3是实施例3红细胞溶血实验结果图。
图4是实施例4通过ITC测定的LPS与抗菌肽L-1相互作用的结果图。
图5是实施例5小鼠存活率结果图。
图6是实施例6小鼠的血液炎症细胞因子检测结果图，***：P<0.001。
具体实施方式
以下实施例用于进一步说明本发明，但不应理解为对本发明的限制。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段。
下述实施例中所使用的抗菌肽L-1委托金斯瑞公司采用Fmoc固相合成方案进行合成，其C端做了酰胺化修饰。
实施例1
根据NCCLS抗菌药物敏感性试验操作标准，采用经典的微量连续二倍稀释法测定抗菌肽L-1对多耐药革兰氏阳性菌(金黄色葡萄球菌、猪链球菌)及革兰氏阴性菌(大肠杆菌、肺炎克雷伯菌)的最小抑菌浓度，实验平行重复3次，结果见表1。
表1抗菌肽L-1对常见多耐药菌株的最低抑菌浓度
缩写：AMP，氨苄西林；TET，四环素；LEV，左氧氟沙星；MER，美罗培南；COL，粘菌素。
实施例2
采用猴源vero细胞使用WST-1法检测抗菌肽L-1对细胞的毒性。
vero细胞在含有10％胎牛血清的DMEM培养基中于37℃、5％CO2条件下培养。将vero细胞以70-80％汇合在96孔板中以100μL/孔培养基的体积培养。将系列稀释的抗菌肽与细胞在37℃、5％CO2中孵育24h，同时设置不加药物的纯细胞对照孔。孵育20h时各孔分别加入10μL WST-1溶液，4h后通过酶标仪使用490nm处的吸光度检测WST-1还原。计算药物孔相对于未加药物处理孔的荧光百分比，即药物孔OD490/对照孔OD490，得出细胞存活率。结果见图2，L-1在MIC值的浓度范围内对细胞生长无明显抑制。
实施例3
在96孔板中，将50μL悬浮在PBS中的2％绵羊红细胞添加到50μL在PBS中连续稀释的抗菌肽L-1中，于37℃下孵育1小时，其中，L-1浓度分别为1、2、4、8、16、32、64、128μg/mL，2.5％TritonX-100作为阳性对照。然后将板以500g离心5分钟，并将来自测定板每个孔的50μL上清液转移至新鲜的96孔板中。通过目视观察和测量543nm处的吸光度来确认溶血。结果见图3，L-1在128μg/mL的最大测试浓度下都没有引起红细胞溶血，表明L-1不会对哺乳动物细胞膜造成物理性破坏。
实施例4
采用等温量热滴定(ITC)在体外测定大肠杆菌LPS与抗菌肽L-1的相互作用。将提纯的LPS、和L-1分别溶于pH 7.4的PBS中使其终浓度为0.05mmol/L、0.5mmol/L。将L-1(总体积为50μL)注射到装有300μL纯化的LPS的样品池中，每次注射2μL，注射重复25次，注射间隔为200s，实验在25℃下进行。通过NanoAnalyzer软件计算平衡离解常数(Kd)、化学计量学(n)、焓(ΔH)和熵(ΔS)。结果如图4所示，Kd＝1.119×10-6mol/L，n＝0.589，ΔH＝214.7，ΔS＝833.4J/mol/K，表明L-1与LPS有很强的结合力。
实施例5
将40只6周龄BALB/c小鼠，随机分成L-1治疗组、MER治疗组、未治疗组、空白对照组，每组10只小鼠。L-1治疗组、MER治疗组、未治疗组三组小鼠以5×108CFU的耐碳青霉烯的大肠杆菌腹腔注射进行攻毒，空白对照组注射同样体积的PBS；给药组以5mg/kg的剂量于攻毒后1h分别注射L-1或者MRE一次，此后每12h通过腹腔注射给药一次(剂量5mg/kg)，未治疗组、空白对照组给予同样体积的PBS。连续给药3天后，观察小鼠7天，统计存活率。结果见图5，未治疗组10只小鼠均死亡，L-1治疗组存活率为70％、MER治疗组存活率为30％，空白对照组无死亡，表明L-1对耐碳青霉烯的大肠杆菌有良好的体内保护效果。
实施例6
将20只6周龄BALB/c小鼠，随机分成L-1治疗组、MER治疗组、未治疗组、空白对照组，每组5只小鼠。L-1治疗组、MER治疗组、未治疗组三组小鼠以1×108CFU的耐碳青霉烯的大肠杆菌E2腹腔注射进行攻毒，空白对照组注射同样体积的PBS；给药组以5mg/kg的剂量于攻毒后1h分别注射L-1或者MRE，未治疗组、空白对照组给予同样体积的PBS。在治疗12小时后，处死小鼠并收集血液。使用电化学发光平台(Quickplex,Meso-MSD)检测炎症细胞因子。结果如图6所示，相对于临床常用药物MER，L-1可以明显抑制感染小鼠IL-6和TNF-α的产生、降低炎症反应。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
序列表
<110> 华中农业大学
<120> 一种抗菌肽及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Arg Leu Leu Arg Lys Phe Phe Arg Lys Leu
1 5 10