具体实施方式

下面用实施例，对本发明的具体实施方式作进一步详细描述。以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：

贵州疣螈多肽TK-CATH编码基因克隆：

1)贵州疣螈皮肤总RNA提取：

①取200mg贵州疣螈背部皮肤组织，放入研钵中加入液氮研磨成粉末，转移到EP管中，加入1ml总RNA提取缓冲液(Trizol，美国Life公司产品)，充分混匀，而后于4℃，12000rpm离心10min。

②离心取上清，加入0.2ml氯仿溶液，剧烈混匀，室温放置10分钟，而后以4℃，12000rpm离心10分钟，弃除沉淀。

③上清加入等体积的异丙醇，室温放置10分钟，以4℃，12000rpm离心10分钟，收集沉淀用75％(V/V)乙醇洗一次，晾干，管底沉淀物即为贵州疣螈皮肤总RNA。

2)贵州疣螈皮肤cDNA二链合成：采用CLONTECH公司In-Fusion SMARTer^TMDirectional cDNA Library Construction Kit合成。

(1)cDNA第一链合成(mRNA反转录)：

①RNase-free的PCR管中加入1μl贵州疣螈皮肤总RNA、1μl 3’端一链合成引物(3’In-Fusion SMARTer CDS Primer)和2.5μlRNase-free水使总体积达到4.5μl，混匀后短暂离心(2000rpm，30s)，离心后于72℃保温3分钟；保温后再将离心管在42℃孵育2分钟。

②在上述离心管中加入以下试剂(均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer^TMDirectional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备)，2.0μl 5×第一链缓冲液、0.25μl 100mM DTT、1.0μl10mM dNTP Mix、1.0μl SMARTer V Oligonucleotide、0.25μl RNase Inhibitor和1.0μl SMARTScribe Reverse Transcriptase反转录酶，混合离心管中试剂并短暂离心(2000rpm，30s)，在42℃保温90min，然后68℃保温10min。保温处理后将离心管置于冰上中止第一链的合成。从离心管取2μl所合成的cDNA第一链备用。

(2)采用长末端聚合酶链式反应(LD-PCR)方法扩增第二链(所用试剂均为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer^TM Directional cDNA Library Construction Kit建库试剂盒中配备)

①将2μl cDNA第一链(mRNA反转录)、80μl去离子水、10μl10×Advantage 2PCR缓冲液、2μl 50×dNTP混合物、2μl 5’PCR引物、2μl CDS III/3’PCR引物以及2μl 50×Advantage 2Polymerase Mix在95℃预热的PCR管中进行混合。

②在PCR仪中按以下程序扩增：

95℃，1min；18个循环：95℃，15sec，65℃，30sec，68℃，6min。循环结束后，将离心管中合成的cDNA双链－80℃保存。

(3)贵州疣螈多肽TK-CATH编码基因克隆：

根据蝾螈科cathelicidins家族抗菌肽信号肽区的保守序列，人工设计合成正向引物:5’-TK-CATH:5’-ATGGAGGTCTGGCAGTGTGTGTTAT-3’，反向引物为CLONTECH公司In-Fusion SMARTer^TM Directional cDNA Library Construction Kit中的3’-PCR引物，其序列为5’-CGGGGTACGATGAGACACCAT-3’。PCR反应在如下条件下进行：95℃4min，95℃30sec，57℃30sec和72℃1min，30个循环。扩增完成后用胶回收试剂盒(天根生物)进行目的片段回收。将回收的目的片段连接到pMD19-T载体(Takara,大连)，转化DH5α感受态细胞。涂板并进行氨苄青霉素筛选，挑取单菌落用M13引物PCR检测插入片段大小。挑取阳性菌落，摇菌提取质粒，使用Applied Biosystems DNA sequencer,model ABI PRISM 377进行核苷酸测序。

测定结果：

编码贵州疣螈多肽TK-CATH前体的基因自5’端至3’端序列为：

贵州疣螈多肽TK-CATH前体的编码基因核苷酸序列表为：序列长度为1011个碱基，序列类型：核酸，链数：单链，拓扑学：直链状，序列种类：cDNA，来源：贵州疣螈皮肤。

实施例2

贵州疣螈多肽TK-CATH的制备：

(1)贵州疣螈多肽的化学合成方法：根据编码基因推导的氨基酸序列，用自动多肽合成仪(433A,Applied Biosystems)合成其全序列，通过HPLC反相柱层析脱盐纯化。

(2)分子量测定采用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱(MALDI-TOF)。

(3)纯化的抗菌肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

贵州疣螈多肽TK-CATH是基因编码的一种小分子多肽，由55个氨基酸残基组成，分子量6196.99Da，等电点4.65。贵州疣螈多肽全序列为：

Gly¹Gly²Gln³Asp⁴Thr⁵Gly⁶Lys⁷Glu⁸Gly⁹Glu¹⁰Thr¹¹Gly¹²Lys¹³Lys¹⁴Lys¹⁵Lys¹⁶Ser¹⁷Asp¹⁸

Asn¹⁹Trp²⁰Phe²¹Met²²Asn²³Leu²⁴Leu²⁵Asn²⁶Lys²⁷Phe²⁸Leu²⁹Glu³⁰Leu³¹Ile³²Gly³³Leu³⁴

Lys³⁵Glu³⁶Ala³⁷Gly³⁸Asp³⁹Asp⁴⁰Ser⁴¹Glu⁴²Pro⁴³Phe⁴⁴Cys⁴⁵Phe⁴⁶Thr⁴⁷Cys⁴⁸Ile⁴⁹Phe^{5 0}Asp⁵¹Met⁵²Phe⁵³Ser⁵⁴Gln⁵⁵，其中Cys⁴⁵和Cys⁴⁸之间形成一对分子内二硫键。

实施例3

贵州疣螈多肽TK-CATH细胞增殖活性检测：

细胞培养：HaCAT细胞从液氮中拿出，放入37℃的水浴锅中快速融化，加入适量培养基混匀后，1200rpm离心5min，弃去上清，用含有10％血清的无支原体的DMEM培养基重悬混匀后转至培养瓶中，放入37℃，5％CO₂培养箱培养，待细胞生长至对数生长期后传代用于后续实验。

细胞给药：用0.25％胰酶对上述细胞进行消化，将离心管放置1200rpm离心机中离心5min，弃去上清，用DMEM培养基将细胞团块轻轻的吹打混匀并用血球计数板计数，并稀释至1×10⁵个/ml。取96孔板，每孔加入100μl稀释好的细胞悬液，使得每孔中含有约10000个左右的HaCAT细胞，实验设定5个调零孔，调零孔加入100μlDMEM培养基，在37℃，5％CO₂培养箱中培养16-24h。培养好后在样品孔加入不同浓度的TK-CATH或Ot-WHP(已发表的促伤口愈合肽作为阳性对照)。空白孔加入同样体积的PBS。37℃，5％CO₂培养箱中培养过夜。

每孔加入20μl MTT溶液，继续放入37℃，5％CO₂培养箱培养4h后终止培养，每孔加入150μl DMSO(二甲基亚枫)置于摇床上，110rpm低速振荡10min，使得结晶充分溶解，于570nm处测吸光值。

结果由图1可见，实验结果表明，表明TK-CATH可促进HaCAT(人永生化角质细胞)的体外增殖。(阴性对照：PBS，阳性对照：Ot-WHP)

实施例4

贵州疣螈多肽TK-CATH细胞迁移活性测定：

按上述方法培养HaCAT细胞并并稀释至1×10⁶个/ml，取6孔板，每孔加入1ml细胞悬液，放入37℃，5％CO₂培养箱培养过夜。

待细胞长满孔后，弃去孔内液体，加入适当2％胎牛血清的DMEM培养基，饥饿培养24h，PBS轻轻洗涤一次后，用200μl黄枪头垂直于培养孔，自上而下均匀力度划线，使得刮痕边缘完整，用PBS洗去被枪尖刮下来的细胞团，加入适当浓度的TK-CATH或阳性对照Ot-WHP，显微镜下拍照观察后，放入37℃，5％CO₂培养箱培养，在培养过程中，取三个时间点进行拍照观察(0h、24h、48h)，使用Image-pro plus 6.0计算细胞刮痕的间距。细胞刮痕率＝(0h-24h)/0h×100。

实验结果如图2所示，TK-CATH在作用24，48h后，与阴性对照组(PBS)相比有明显的差别，甚至优于阳性对照组(Ot-WHP)，在TK-CATH作用24h和48h的划痕修复率分别达到55％和82％。说明TK-CATH具有促进角质细胞迁移的作用。

实施例5

贵州疣螈多肽TK-CATH促创口愈合功能

建立起小鼠全层皮肤伤口模型，实验分为三组，第一组在小鼠左边伤口滴加20μlPBS作为阴性对照，右侧滴加20μl TK-CATH(多肽浓度为200μg/ml)，第二组则在左边滴加20μl Ot-WHP作为阳性对照、右侧滴加20μl TK-CATH(多肽浓度为200μg/ml)，于0、2、4、6、8天拍摄创面并用Image-pro plus 6.0计算不同时间伤口面积的变化，伤口愈合率为(0day-2day)/0day×100。

结果如图3所示，TK-CATH的创口修复效果比Control组的好，且与阳性对照效果相当，进一步证明了TK-CATH有明显的促进伤口修复的作用，为进一步了解创口面积的收缩变化，使用Image pro plus软件计算创口面积，并求得创口修复率，计算公式为：(0d-2d)/0d*100。从图B中得知，当给药达到第八天时候，Control组对于小鼠创口的修复率达到61％，而TK-CATH组修复率达到了84％左右，差异比较明显，其愈合作用与阳性对照相接近。(空白对照：PBS、阳性对照：Ot-WHP促伤口愈合肽)

实施例6

贵州疣螈多肽TK-CATH抗炎活性测定：

将RAW264.7细胞培养至对数生长期，用0.25％胰酶对上述细胞进行消化，将离心管放置1200rpm离心机中离心5min，弃去上清，并用DMEM培养基将细胞团块轻轻的吹打混匀并用血球计数板计数，稀释至2×105/ml，孔加入稀释好的细胞悬液200μl，得每孔有40000个细胞，放入37℃，5％CO2培养箱中培养过夜。次日加不同浓度的TK-CATH多肽(终浓度为5、10、20μg/ml)以及大肠杆菌LPS(终浓度为100ng/ml)，放入37℃，5％CO2培养箱培养6h后取上清并用ELISA试剂盒检测炎症因子的表达。

结果如图4所示，TK-CATH能抑制LPS诱导的促炎因子的产生，且呈浓度依赖性。当多肽浓度达到20μg/ml时，TK-CATH对于TNF-α、IL-6的抑制率达到了33％、68％。

实施例7

贵州疣螈多肽TK-CATH溶血活性测定：

将采集的新鲜C57小鼠血与阿氏液混合抗凝，生理盐水洗涤2次并重悬成107-108cell/ml的悬浮液。上述稀释好的红细胞悬液与溶解于生理盐水的贵州疣螈多肽样品混合，37℃保温30min，再于1000rpm离心5min，上清液于540nm测吸收值。阴性对照使用生理盐水，阳性对照使用Triton X-100，溶血百分比按以下公式计算：溶血百分比H％＝A样品-A阴性对照/A阳性对照×100％。

结果表明浓度为200μg/ml时，溶血百分比为小于2％。说明TK-CATH对哺乳动物红细胞具有极低的溶血活性。

通过上述实施例可以看出，本发明中的贵州疣螈多肽TK-CATH可通过化学合成的方式获得，该多肽具有较强的促进皮肤创口修复活性和抗炎活性，其次该多肽具有分子量小、合成简单、溶血活性低的特点，可用作皮肤创口修复的药物、抗炎药物、术后医疗器械的消毒剂、保健品、化妆品等的生产原料或辅料。

将贵州疣螈多肽TK-CATH按照常规剂量与常规的辅料结合，通过现有的加工方法制备成对应的药物、抗炎药物、术后医疗器械的消毒剂、保健品、化妆品等产品。

序列表

<110> 贵州师范大学

<120> 一种贵州疣螈多肽TK-CATH及其编码基因和应用

<160> 4

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 55

<212> PRT

<213> 贵州疣螈(Tylototriton kweichowensis)

<400> 1

Gly Gly Gly Ala Thr Gly Leu Gly Gly Gly Thr Gly Leu Leu Leu Leu

1 5 10 15

Ser Ala Ala Thr Pro Met Ala Leu Leu Ala Leu Pro Leu Gly Leu Ile

20 25 30

Gly Leu Leu Gly Ala Gly Ala Ala Ser Gly Pro Pro Cys Pro Thr Cys

35 40 45

Ile Pro Ala Met Pro Ser Gly

50 55

<210> 2

<211> 1011

<212> DNA

<213> 贵州疣螈(Tylototriton kweichowensis)

<400> 2

atggagaatt ggtggaaagc cttgctgttc cttgcagtgt caactgcagc caatgcaatt 60

cctcttcagc gacagacagt ccaggatgaa gccatagcag tagctattga catctacaac 120

gagcaacaga gcacaagctc agtatacagg cgtgtcaaag atgatccatc gatggaccag 180

cccaccttct ctgctcagct gaggtttaga atcaaagaga ctgtgtgctc gaagtcggat 240

aagaagaaaa atcctgaaga atgtgacttc aaagaagacg ggattgtaaa agactgcacc 300

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gggttgaaag aagcaggaga tgacagcgag cctttttgtt tcacgtgcat ttttgatatg 540

ttctctcagt agatctgggt gcgtcatctc ttggtcgacc tgatccagca tggcgtcttc 600

aatcgaactt tcatcattaa cagagatacg gtatctgtca agagaccccg tatgcctatg 660

gctttggacc tgtggaagag aacataatta ctccactatc aaaaacaatc tattatggaa 720

tgattgaaag cacccacaac attacttagg aatggagagt tatcttttaa ctgcgccgtg 780

tttttacgtt taacgtttat actaattgta ttttttatat ttctgcaaag tataatgtcc 840

ctttacatga ctgtctttga acaccgaaac atcgagattc aattacagta tgacacctca 900

ttgaaagtgt ttatttattt acatgaaaat agtaccagtt acatcctcag actagaagtg 960

aaaataaaac agaacttaca gaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa a 1011

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 贵州疣螈(Tylototriton kweichowensis)

<400> 3

atggaggtct ggcagtgtgt gttat 25

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 贵州疣螈(Tylototriton kweichowensis)

<400> 4

cggggtacga tgagacacca t 21