用于治疗乙肝感染及相关疾病的抗体
阅读说明：本技术 用于治疗乙肝感染及相关疾病的抗体 (Antibodies for the treatment of hepatitis B infections and related diseases ) 是由 罗文新 王一文 康赐明 袁权 张天英 夏宁邵 于 2018-04-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及抗乙肝表面抗原(HBsAg)的抗体(特别是人源化抗体),编码它们的核酸分子,制备它们的方法,以及包含它们的药物组合物。此外,本发明还涉及所述抗体和药物组合物的用途。本发明的抗体和药物组合物可用于预防和/或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝),用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力,或用于在受试者体内降低HBVDNA和/或HBsAg的血清水平。(The present invention relates to antibodies, in particular humanized antibodies, against hepatitis b surface antigen (HBsAg), nucleic acid molecules encoding them, methods for preparing them, and pharmaceutical compositions comprising them. Furthermore, the invention relates to the use of said antibodies and pharmaceutical compositions. The antibodies and pharmaceutical compositions of the invention are useful for preventing and/or treating HBV infection or a disease associated with HBV infection (e.g., hepatitis b), for neutralizing the virulence of HBV in a subject (e.g., a human), or for reducing the serum level of HBV dna and/or HBsAg in a subject.)
具体实施方式
中，标签通过不同长度的间隔臂连接至抗体，以降低潜在的位阻。
此外，本发明的抗体或其抗原结合片段还可以用化学基团进行衍生，例如聚乙二醇(PEG)，甲基或乙基，或者糖基。这些基团可用于改善抗体的生物学特性，例如增加血清半衰期。
核酸分子、载体和宿主细胞
在另一个方面，本发明提供了一种分离的核酸分子，其包含编码本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区的核苷酸序列。在某些优选的实施方案中，本发明的分离的核酸分子编码根据本发明的抗体或其抗原结合片段，或其重链可变区和/或轻链可变区。
在另一个方面，本发明提供了一种载体(例如克隆载体或表达载体)，其包含根据本发明的分离的核酸分子。在某些优选的实施方案中，本发明的载体是例如质粒，粘粒，噬菌体等。在某些优选的实施方案中，所述载体能够在受试者(例如哺乳动物，例如人)体内表达本发明的抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，本发明提供了一种宿主细胞，其包含根据本发明的分离的核酸分子或根据本发明的载体。此类宿主细胞包括但不限于，原核细胞例如大肠杆菌细胞，以及真核细胞例如酵母细胞，昆虫细胞，植物细胞和动物细胞(如哺乳动物细胞，例如小鼠细胞、人细胞等)。本发明的细胞还可以是细胞系，例如293T细胞。
在另一个方面，提供了制备根据本发明的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养根据本发明的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
诊断方法和试剂盒
本发明的抗体或其抗原结合片段能够特异性结合HBsAg，从而可用于检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平，可用于诊断受试者是否感染了HBV。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种试剂盒，其包括本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在一个优选的实施方案中，所述试剂盒还包括第二抗体，其特异性识别本发明的抗体或其抗原结合片段。优选地，所述第二抗体还包括可检测的标记。
可按照上文详细描述的方法来对本发明的抗体或其抗原结合片段或者第二抗体进行标记。例如，可以将本发明的抗体或其抗原结合片段连接至可检测的标记。此类可检测的标记是本领域技术人员熟知的，包括但不限于，放射性同位素，荧光物质，发光物质，有色物质和酶(例如辣根过氧化物酶)等。此外，此类可检测的标记还包括例如，放射性同位素，例如125碘；荧光物质例如荧光素、异硫氯酸荧光素、罗丹明、5-二甲氨基-1-蔡磺酰氯、藻红蛋白、镧磷光剂等等；能够产生可识别的信号或反应产物的酶，例如辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、萤光素酶、碱性磷酸酶、葡萄糖氧化酶等等；能够被第二个报告分子识别的标签，例如生物素、抗生物素蛋白、亮氨酸拉链互补序列、金属结合结构域、附加表位等等。在某些具体实施方式中，可通过不同长度的接头将检测试剂(例如标签)连接至抗体，以降低潜在的位阻。
在另一个方面，本发明提供了检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平的方法，其包括使用本发明的抗体或其抗原结合片段。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。所述方法可以用于诊断目的，或者非诊断目的(例如，所述样品是细胞样品，而非来自患者的样品)。
在另一个方面，本发明提供了诊断受试者是否感染了HBV的方法，其包括：使用本发明的抗体或其抗原结合片段检测HBsAg蛋白在来自所述受试者的样品中的存在。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段还包括可检测的标记。在另一个优选的实施方案中，所述方法还包括，使用携带可检测的标记的第二抗体来检测本发明的抗体或其抗原结合片段。
在另一个方面，提供了本发明的抗体或其抗原结合片段在制备试剂盒中的用途，所述试剂盒用于检测HBsAg蛋白在样品中的存在或其水平，或用于诊断受试者是否感染了HBV。
治疗方法和药物组合物
本发明的抗体或其抗原结合片段可用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，以及用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
因此，在另一个方面，本发明提供了一种药物组合物，其含有根据本发明的抗体或其抗原结合片段，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。在一个优选的实施方案中，本发明的药物组合物还可包含另外的药学活性剂。在一个优选的实施方案中，所述另外的药学活性剂是用于预防或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的药物，例如其它抗病毒试剂，例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素。
在另一个方面，提供了根据本发明的抗体或其抗原结合片段或根据本发明的药物组合物在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗受试者(例如人)的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于体外或在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，和/或用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平。
在另一个方面，本发明提供了一种用于预防或治疗受试者的HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)，用于在受试者(例如人)体内中和HBV的毒力，和/或用于在受试者(例如人)体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平的方法，所述方法包括，给有此需要的受试者施用有效量的本发明的抗体或其抗原结合片段，或者本发明的药物组合物。
本发明的抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物的施用方式可以是传统的施用途径，包括但不限于，口服、口腔、舌下、眼球、局部、肠胃外、直肠、叶鞘内、内胞浆网槽内、腹股沟、膀胱内、局部(如，粉剂、药膏或滴剂)，或鼻腔途径。本发明的抗体或其抗原结合片段可通过本领域已知的多种方法给药。但是，对于许多治疗用途而言，优选的给药途径/方式是胃肠外给药(例如静脉注射，皮下注射，腹膜内注射，肌内注射)。技术人员应理解，给药途径和/或方式将根据预期目的而发生变化。在一个优选的实施方案中，本发明的抗体或其抗原结合片段通过静脉输注或注射给予。
本发明的抗体或其抗原结合片段或者本发明的药物组合物可以配制成多种剂型，例如液体、半固体和固体剂型，例如溶液剂(例如注射剂)、分散剂或悬浮剂、片剂、粉剂、颗粒剂、乳剂、丸剂、糖浆剂、粉剂、脂质体、胶囊剂和栓剂。优选剂型取决于预期的给药方式和治疗用途。
例如，一种优选的剂型是注射剂。此类注射剂可以是无菌注射溶液。例如，可通过下述方法来制备无菌注射溶液：在适当的溶剂中掺入必需剂量的本发明的抗体或其抗原结合片段，以及任选地，同时掺入其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)，随后过滤除菌。此外，可以将无菌注射溶液制备为无菌冻干粉剂(例如，通过真空干燥或冷冻干燥)以便于储存和使用。此类无菌冻干粉剂可在使用前分散于合适的载体中，例如无菌无热原水。
另一种优选的剂型是分散剂。可通过下述方法来制备分散剂：将本发明的抗体或其抗原结合片段掺入无菌载体中，其含有一种基础分散介质以及任选的其他期望的成分(包括但不限于，pH调节剂，表面活性剂，佐剂，离子强度增强剂，等渗剂、防腐剂、稀释剂，或其任何组合)。此外，还可以在分散剂中掺入可延迟吸收的试剂，例如单硬脂酸盐和明胶，以获得期望的药代动力学特征。
另一种优选的剂型是口服固相剂型，包括胶囊、片剂、粉剂、颗粒剂等。此类固相剂型通常含有下述中的至少一种：(a)惰性药物赋形剂(或载体)，如柠檬酸钠、磷酸钙；(b)填充剂，如淀粉、乳糖、蔗糖、甘露糖和硅酸；(c)粘合剂，如羧甲基纤维素、藻酸盐、明胶、聚乙烯吡咯烷酮、蔗糖和阿拉伯树胶；(d)湿润剂，如甘油；(e)碎裂剂，如琼脂，碳酸钙，马铃薯粉或木薯粉；(f)缓凝剂，如石蜡；(g)促吸收剂，如四氨基混合物；(h)保湿剂，如十六烷基醇和单硬脂酸甘油酯；(i)吸附剂，如高岭土和斑脱土；(j)润滑剂，如滑石，硬脂酸钙，硬脂酸镁，固体聚乙二醇，硫酸十二烷醇钠，或其任何组合。在片剂和胶囊剂型的情况下，还可以含有缓冲剂。
此外，还可以在口服固相剂型中添加释放速率改造剂(即，能改变药物释放速率的试剂)，以获得改良释放或脉冲释放剂型。此类释放速率改造剂包括但不限于，羧丙基甲基纤维素，甲基纤维素，碳甲基纤维素钠，纤维素乙烷，醋酸纤维素，聚乙烯氧化物，黄原胶糖，异丙烯酸氨共聚物，氢化调味油，巴西棕榈蜡，石蜡，邻苯二酸醋酸纤维素，邻苯二甲酸羧丙基甲基纤维素，甲基丙烯酸共聚物，或其任何组合。改良释放和脉冲释放剂型可含有一种或一组释放速率改造剂。
另一种优选的剂型是口服的液体剂型，包括例如乳剂、溶液剂、悬浮剂、糖浆剂等。除了活性成分之外，此类口服的液体剂型还可含有本领域常用的一些惰性溶液，例如水或其它溶剂，如乙烷基醇，异丙基醇，丙烯乙二醇，1,3-丁烯乙二醇，油(例如棉籽油，落花生油，玉米油，橄榄油，调味油和芝麻油)，甘油，聚乙二醇和脂肪酸山梨醇酯，以及其任何组合。除了这些惰性溶液之外，此类口服的液体剂型还可包括保湿剂、乳化剂、悬浮剂、糖化剂、调味剂和香味剂等。
此外，本发明的抗体或其抗原结合片段可以以单位剂量形式存在于药物组合物中，以便于施用。本发明的药物组合物应当是无菌的并在生产和储存条件下稳定。
本发明所提供的药物和药物组合物可以单独使用或联合使用，也可以与另外的药学活性剂(例如其它抗病毒试剂，例如干扰素类药物，如干扰素或聚乙二醇干扰素)联合使用。在某些优选的实施方案中，将本发明的抗体或其抗原结合片段与其它抗病毒试剂联合使用，以预防和或治疗乙型肝炎病毒感染相关疾病。本发明的抗体或其抗原结合片段可以和此类抗病毒试剂同时、分开或连续给药。此类抗病毒试剂包括但不限于，干扰素类药物、利巴韦林、金刚烷、羧基脲、IL-2、L-12和五羧链胞酸等。
本发明的药物组合物可包括“治疗有效量”或“预防有效量”的本发明抗体或抗原结合片段。“预防有效量”是指，足以预防，阻止，或延迟疾病(例如HBV感染或与HBV感染相关的疾病)的发生的量。“治疗有效量”是指，足以治愈或至少部分阻止已患有疾病的患者的疾病和其并发症的量。本发明抗体或抗原结合片段的治疗有效量可根据如下因素发生变化：待治疗的疾病的严重度、患者自己的免疫系统的总体状态、患者的一般情况例如年龄，体重和性别，药物的施用方式，以及同时施用的其他治疗等等。
可调整给药方案以获得最佳目的反应(例如治疗或预防反应)。例如，可以单次给药，可以在一段时间内多次给药，或者可以随治疗情况的紧急程度按比例减少或增加剂量。
本发明抗体或抗原结合片段的治疗或预防有效量的典型非极限范围是0.025到50mg/kg，更优选0.1到50mg/kg，更优选0.1-25mg/kg，O.1-10mg/kg。应注意的是，剂量可随需要治疗的症状的类型和严重性不同而发生变化。此外，本领域技术人员理解，对于任一特定患者，特定的给药方案应根据患者需要和医生的专业评价而随时间调整；此处给出的剂量范围只用于举例说明目的，而不限定本发明药物组合物的使用或范围。
发明的有益效果
与现有技术相比，本发明的技术方案具有以下有益效果：
(1)本发明的抗体不仅能够特异性识别/结合HBsAg，能够中和HBV的毒力，而且能够在受试者体内降低HBV DNA和/或HBsAg的血清水平，能够有效清除体内的HBV和被HBV感染的细胞。因此，本发明的抗体具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力。
(2)本发明的抗体(特别是人源化抗体)不仅保留了亲本猴源抗体的功能和性质，从而具有用于预防和治疗HBV感染以及与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力；而且具有极高的人源化程度(人源化程度可高达98％)，从而可安全地施用给人受试者，而不引发免疫原性反应。因此，本发明的抗体(特别是人源化抗体)具有重大的临床价值。
具体实施方式
现参照下列意在举例说明本发明(而非限定本发明)的实施例来描述本发明。
除非特别指明，本发明中所使用的分子生物学实验方法和免疫检测法，基本上参照J.Sambrook等人，分子克隆：实验室手册，第2版，冷泉港实验室出版社，1989，以及F.M.Ausubel等人，精编分子生物学实验指南，第3版，John Wiley&Sons,Inc.，1995中所述的方法进行；限制性内切酶的使用依照产品制造商推荐的条件。本领域技术人员知晓，实施例以举例方式描述本发明，且不意欲限制本发明所要求保护的范围。
实施例1：特异性结合HBsAg的人-食蟹猴嵌合单克隆抗体的制备
1.1食蟹猴免疫
使用实验室前期研发的重组HBV疫苗(该重组疫苗详细描述于中国专利申请201710085194.3)对大于6个月，体重为4±1kg的食蟹猴进行肌肉注射免疫，注射剂量为20μg/monkey/time。免疫时间点分别在第0、2、6、10、14、18、22、26周。在免疫第4针(10周)食蟹猴血清滴度达到平台期后，我们分别在第13、17、25、29周(即每次免疫后的第三周，产生大量记忆B细胞)，采集食蟹猴外周血10ml/monkey/time。
1.2食蟹猴外周血单核细胞分离
食蟹猴外周血单核细胞的分离参照SepMateTM使用说明书进行。SepMateTM试管用于通过密度梯度离心从人外周全血和脐带血样本中分离单个核细胞(MNCs)。分离前应确保样本、含2％胎牛血清(FBS)的PBS缓冲液(PBS+2％FBS)、密度梯度离心液以及离心机均处于室温(15-25℃)。
具体步骤如下：
1)使用移液器将密度梯度离心液通过SepMateTM插件中央小孔小心加入SepMateTM试管中。密度梯度离心液上端应淹没过插件。注意：密度梯度离心液在使用移液器后可能会产生小气泡，这不会对使用效果产生影响。
2)使用等体积的PBS+2％FBS稀释样本。轻柔混匀。
3)保持SepMateTM试管垂直，用移液器沿试管壁加入稀释后的样本。样本将会在插件上面和密度梯度离心液混合。注意：样本可以沿管壁直接倒入。注意不要讲稀释的样本直接倒在中央小孔上。
4)在室温下1200×g离心10分钟，无需关闭离心机刹车。注意：对于存放超过24小时的样本，推荐离心时间为20分钟。
5)倒出上层液体至一个新的试管，该层含富集的MNCs。请勿将SepMateTM试管在倒置状态下超过2秒。注意：离心后可能会有部分红细胞(RBCs)出现在SepMateTM插件的表层，但不会对使用效果产生影响。
6)使用PBS+2％FBS清洗MNCs。重复清洗一次。注意：清洗细胞时建议在室温下1200×g离心8分钟，无需关闭离心机刹车。
1.3记忆B细胞分离
因市面上无专门的食蟹记忆B细胞分选试剂，我们采用EasySepTM HUMAN PAN-BCELL ENRICHMENT KIT进行。
1)按照上述1.2的方法分离出的PBMC细胞以300g，离心10分钟，然后用10mL无血清的1640培养基洗涤细胞一次。
2)用10mL过滤后的MACS buffer重复洗涤一次。
3)将细胞用1mL MACS buffer重悬，然后转移至5mL聚苯乙烯圆底试管中。
4)按50μL/mL细胞加入EasySepTM Human Pan-B Cell Enrichment Cocktail。
5)室温孵育10min，按75μL/mL细胞加入EasySepTM D Magnetic Particles。
6)补加MACS buffer至2.5mL，轻轻上下混匀。
7)将试管放入磁铁分离器上5分钟，之后将需要的阳性细胞转移至新的试管中，而不需要的阴性细胞保留在原始试管中。
1.4体外刺激培养
1.4.1HEK293-CD154辐照
辐照剂量为40Gy，具体操作步骤参见《RS 2000型生物学X-ray辐照仪使用说明书》。
1.4.2细胞铺板
RPMI 1640培养基重悬好的细胞按5个/孔与配制好的50ng/mL的IL21和辐射过后的HEK293-CD154按104个/孔混匀后，共同孵育铺入96孔板中，每孔250μL。静置放于37℃的CO2培养箱中，刺激培养14天。
1.4.3细胞培养阳性孔检测
取商业化的HBsAg板(购于北京万泰)，每孔加入100μL待测上清，并在37℃温育1h。随后，用PBST洗涤ELISA板5次，然后添加以1∶5000稀释的GAH-HRP 100μL，并在37℃温育30min。随后，用PBST洗涤ELISA板5次，并添加底物TMB溶液。显色15min后，用H2SO4终止显色反应，并于OD450/620测定读值。以RPMI 1640培养基为阴性对照。
1.5B细胞抗体可变区基因的钓取
1.5.1细胞处理
将含有阳性B细胞培养孔的培养板先在300×g条件下离心5min，将细胞上清吸出。加入150μL的Lysis Buffer(购自北京GenMagBio)裂解液，用枪头反复吹吸几次后移入无RNA酶的1.5mL Eppendorf管中，放置于-80℃冰箱中，可以保存一年。
1.5.2RNA提取
RNA提取方法参照病毒DNA/RNA共提取试剂盒说明书(GenMagBio)。
1)在1.5mL无核酸酶Eppendorf管中加入10μL Proteinase K、4μL AcrylCarrier、300μL Lysis Buffer、20μL磁珠(使用前颠倒或使用移液器吹吸混匀磁珠)，加入200μL样品，震荡混匀各离心管，室温上下颠倒混匀10min，使磁珠和核酸充分结合。
2)将离心管置于磁力架上1min，使管内磁珠被吸附，用移液器移走管内液体，取下离心管。
3)加入500μL的Wash BufferⅠ，使磁珠重新悬浮，利用磁力架吸附磁铁，1min后移走管内液体，取下离心管。
4)加入500μL的Wash BufferⅡ，使磁珠重新悬浮，利用磁力架吸附磁珠，1min后移走管内液体，同时保持离心管置于磁力架上，使磁珠继续被吸附。
5)加入550μL的Wash BufferⅢ，尽量不要冲起磁珠，1min后移走管内液体，取下离心管。
6)加入50μL的Elution Buffer，使磁珠重新悬浮，55℃水浴5min，期间轻轻晃动两次使核酸充分洗脱。
7)将离心管置于磁力架1min，使磁珠被吸附，将液体转移至新的1.5mL无核酸酶的离心管中。
1.5.3B细胞抗体可变区RT-PCR
反转录使用的引物(参见Meng W,Li L,Xiong W,et al.Efficient generationof monoclonal antibodies from single rhesus macaque antibody secreting cells[C]//mAbs.Taylor&Francis,2015,7(4):707-718.)如表2所示。
表2:食蟹猴抗体可变区基因反转录引物
具体步骤如下：
(1)首先按下列配方配置Ⅰ液：
Buffers
Volume
DEPC水
6.8μL
引物/条
0.6μL
RNAsin
0.1μL
Mrna
5μL
(2)75℃温浴5min。
(3)迅速放入冰浴中5min。
(4)之后按下列配方配置Ⅱ液：
Buffers
Volume
5×AMV buffer
4μL
10mmol dNTP
1μL
AMV反转录酶
0.2μL
(5)混匀，加5.2μL到各管中。
(6)混匀，42℃水浴反转录40min。
(7)分装保存，短期内使用置于-20℃，短期内不使用置于-80℃。
1.5.4抗体可变区基因扩增
B细胞抗体H链、κ轻链及λ轻链可变区基因采用巢式PCR扩增，扩增引物参考(MengW,Li L,Xiong W,et al.Efficient generation of monoclonal antibodies fromsingle rhesus macaque antibody secreting cells[C]//mAbs.Taylor&Francis,2015,7(4):707-718).并将巢式第二轮引物上与载体的同源序列替换成本实验室已有的真核表达载体(参见实施例1.5.5.1)上的一段作为同源序列。按照表3配制PCR反应体系，每个体系为25μL。巢式第一轮反应以反转录的cDNA为模板，反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；55℃，60s；72℃，90s；72℃，7min；扩增循环数为35个；巢式第二轮反应以第一轮扩增产物为模板，反应条件为：95℃，5min；95℃，30s；58℃，60s；72℃，90s；72℃，7min；扩增循环数为35个。随后通过琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物，并用DNA纯化回收试剂盒(TianGen，DP214-03)回收扩增产物。
表3:巢式PCR反应体系
1.5.5抗体基因的表达与纯化
1.5.5.1用于真核表达的重组载体的构建
本发明中，需要进行大量的抗体重组，因此需要构建一套可以高效重组抗体的轻重链载体。本发明对实验室现有的真核表达载体pTT5进行了特殊改造，构建一套供双质粒共转染用轻重链重组载体。轻重链信号肽采用MGWSCIILFLVATATGVHS。信号肽下游分别接入编码人抗体轻重链恒定区的序列，构建成一套方便抗体重组的pTT5-CH,pTT5-Cκ和pTT5-Cλ真核表达载体。利用实验室自制的Gibson装配液将上述构建好的真核表达载体与1.5.4中回收到的抗体可变区基因PCR产物连接(引物带有与载体同源序列),得到重组载体VH+pTT5-CH,VH+pTT5-Cκ和VH+pTT5-Cλ。将重组载体转化入到大肠杆菌DH5α菌株，涂布LB平板，并在37℃培养箱培养过夜。从平板上挑取单克隆菌落，并进行测序，测序结果使用IgBlast对序列进行比对，以确认其基因正确性，排除假基因。
1.5.5.2抗体基因的小量及大量表达
将构建好的重组载体VH+pTT5-CH和VH+pTT5-Cκ和VH+pTT5-Cλ共转染HEK293-细胞，小量表达双质粒共转染至每孔500μL的24孔板中，如小量表达的细胞上清具有抗原活性，将转染体系放大到100mL(根据抗体用量决定)的CHO-S悬浮细胞(细胞密度为约2×106cells/ml)。转染后的细胞在32℃，5％CO2培养箱摇瓶培养，表达7天后收上清。
1.5.5.3抗体纯化
收集细胞表达上清，根据制造商的说明书,用Protein A层析柱进行纯化。具体步骤如下：收获的细胞培养上清，8000rpm，离心10min，保留上清，利用干粉Na2HPO4调节其PH值为8.4，然后用0.22μm孔径滤膜过滤。取偶联上Protein A的Sepharose 4B介质10mL装柱，连接至AKTA Explorer100系统，将A泵接入0.2M磷酸氢二钠溶液，B泵接入0.2M柠檬酸溶液。选取检测波长UV 280nm，流速5mL/min，调节A/B泵进样比例，先取100％B(pH 2.3)冲洗柱子出去杂蛋白，取10％B(pH 8.0)平衡pH，待检测波长稳定后归零，上样，待穿透峰过后取10％B继续平衡至检测波长降至零点并稳定后，用70％B(pH 4.0)洗脱，收取洗脱峰。将洗脱峰样品透析至PBS缓冲液中，并测定浓度及SDS-PAGE分析，以确定IgG抗体的纯度。
实施例2：特异性结合HBsAg的食蟹猴-人嵌合单克隆抗体的性质分析
按照实施例1的方法，共制备获得了3株特异性结合HBsAg的食蟹猴-人嵌合单克隆抗体，分别命名为M1-23，M3-23，M3-13。三株抗体的VH和VL氨基酸序列如下表所示(SEQ IDNO：1-5)。另外，还利用IMGT确定了三株抗体的CDR序列,其重链可变区和轻链可变区的CDR的氨基酸序列如表5(SEQ ID NO:6-20)所示。
表4:M1-23/M3-23/M3-13轻重链可变区氨基酸序列
表5:M1-23/M3-23/M3-13轻重链CDR的序列
发明人对纯化后的3株单克隆抗体进行了一系列的性质分析。首先通过ELISA法分别检测了M1-23，M3-23及M3-13与HBsAg的结合能力，按首孔浓度为10μg/mL，进行3倍浓度梯度稀释，共稀释12个浓度梯度。随后，将稀释好的抗体加入商业化的HBsAg板中(购于北京万泰)，并在37℃孵育1h,用PBST洗板5次，甩干。随后，加入GAH-HRP酶标二抗，孵育30min，用PBST洗板5次，甩干。并添加底物TMB溶液。显色15min后，用H2SO4终止显色反应，并于OD450/630测定读值。结果如图1所示，M1-23，M3-23及M3-13均具有良好的抗原结合活性。
通过竞争ELISA法考察识别HBsAg SA类型表位(HBsAg aa113-135)的鼠源单抗6D11(详细描述于中国专利申请201610879693.5)阻断M1-23，M3-23及M3-13与HBsAg的结合的情况。竞争ELISA法的具体步骤参见实施例4.2。如图2所示，结果显示鼠源单抗6D11可显著阻断M1-23，M3-23，M3-13分别与HBsAg的结合，这表明M1-23，M3-23，M3-13与鼠源单抗6D11识别的均为相同HBsAg SA线性表位。
通过HBV转基因小鼠来评价食蟹猴-人嵌合抗体在动物体内的病毒清除能力。将食蟹猴-人嵌合抗体按10mg/kg的剂量单剂尾静脉注射的方式施用给HBV转基因小鼠，每组6只HBV转基因小鼠。随后，通过眼眶后静脉丛取血采集小鼠的血液，并检测小鼠血清中的HBsAg水平和HBV DNA水平的变化。小鼠血清中的HBsAg水平和HBV DNA水平的检测方法参见实施例5.1及5.2。结果表明，M1-23，M3-23及M3-13(M1-23、M3-23结果示于图3A-3B；M3-13对HBsAg的清除结果示于图7A-7B)具有用于治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)的潜力。
实施例3：抗体M1-23与M3-23的人源化
为了减少异源抗体施用给人受试者时引起的免疫原性，发明人对M1-23，M3-23这两株抗体进行了人源化。由于食蟹猴与人类的免疫球蛋白之间氨基酸序列具有高度一致性，因此对与M1-23，M3-23这两株抗体而言，为使其适用于人类治疗仅需额外地将可变区FR少数氨基酸替换为人可变区FR序列中相应位置的氨基酸。然而，虽然抗体主要通过CDR来接触和识别抗原，但是抗体FR区中的部分残基可能也参与抗原-抗体的相互作用，影响CDR的空间构型，例如在将鼠源抗体的FR区替换为人抗体的FR区后，鼠源抗体的CDR的空间构型往往发生改变，导致人源化抗体识别/结合抗原的亲和力显著下降，甚至导致人源化抗体丧失与抗原结合的能力(葛彦，人源化抗体研制策略分析及应用研究[J].国外医学，免疫学分册,2004,27(5):271)。因此，在对M1-23，M3-23进行人源化的过程中，可变区FR序列中点突变位置及替换后的氨基酸的选择是十分重要的。
通过使用IMGT信息系统(http://-www.imgt.org),并结合实验经验，在大量的分析和实验的基础上，发明人出人意料地发现，选择人胚系基因序列IGHV4-4*08(SEQ ID NO：40)与IGKV1-39*01(SEQ ID NO：41)作为M1-23人源化的模板，IGHV4-4*02(SEQ ID NO：42)与IGKV4-1*01(SEQ ID NO：43)作为M3-23人源化的模板是特别有利的，所涉及的胚系基因序列列于下表6。
表6:人胚系基因氨基酸序列
根据胚系基因序列，同时考虑到改变靠近CDR的FR区氨基酸可能会影响人源化抗体识别/结合抗原的亲和力，我们在保留CDR区附近的氨基酸基础上，设计了如下单点突变对两株抗体的FR区进行改造。分别将人源化后的M1-23、M3-23命名为M1D、M3D。
表7：抗体M1-23的FR区氨基酸残基的单点突变
※：上表中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
表8：抗体M3-23的FR区氨基酸残基的单点突变
※：其中上表中提及的氨基酸位置是根据Kabat编号系统的位置。
表9：M1-23，M3-23 FR区人源化改造引物
根据表7，表8中列出的单点突变，设计了相关引物(见表9)，并通过PCR的方法，分别以M1-23-H，M1-23-L,M3-23-H和M3-23-L为模板，将对应位置的原始氨基酸全部进行突变。以M1-23重链可变区(M1-23-H)的人源化为例，设计寡核苷酸引物PTT5-1-23H-F，1-23H-F1，1-23H-F2，1-23H-R1，1-23H-F3及PTT5-1-23H-R(其序列示于上表)。PCR的具体方案如下：以M1-23-H的编码基因为模板，分别用引物对1-23H-F1/1-23H-R1和1-23H-F3/PTT5-1-23H-R扩增出片段1和片段2；以片段1为模板，用引物对1-23H-F2/1-23H-R1扩增出片段3；以片段3为模板，用引物对PTT5-1-23H-F/1-23H-R1扩增出片段4；通过重叠延伸PCR将片段4和片段2连接到一起，再以PTT5-1-23H-F/PTT5-1-23H-R为上下游引物进行扩增，获得人源化后的基因片段M1D-H。
按照上述方法，获得M1-23-L的人源化基因片段M1D-L,M3-23-H的人源化基因片段M3D-H,M3-23-L的人源化基因片段M3D-L。
用实验室自制的Cibson装配液将获得的人源化基因片段M1D-H、M3D-H分别与真核表达载体pTT5-CH连接，M1D-L、M3D-L分别与真核表达载体pTT5-Cκ连接，得到重组载体。将重组载体转化入到大肠杆菌DH5α菌株，涂布LB平板，并在37℃培养箱培养过夜。从平板上挑取单克隆菌落，并进行测序，挑选测序正确的质粒，按照实施例1中方法，进行抗体的表达与纯化。
人源化抗体M1D、M3D氨基酸序列示于表11。另外，还通过下式计算了M1D、M3D的人源化程度。如下表10所示，这两株抗体经过上述人源化后，人源化程度由90％左右提高到了98％左右。
表10：人源化抗体的序列分析
人源化程度＝(FR区氨基酸个数-FR区保留的猴源氨基酸个数)/FR区氨基酸个数×100％
表11：抗体M1D,M3D轻重链可变区氨基酸序列
实施例4：人源化抗体M1D,M3D的体外结合活性评估
4.1抗体的抗原结合活性的测定
通过ELISA方法(酶联免疫吸附法)检测了人源化抗体M1D,M3D与抗原HBsAg的结合活性。按首孔浓度为10μg/mL，进行3倍浓度梯度稀释，共稀释12个浓度梯度，以人源化抗体162(其详细描述于中国专利申请CN201610879693.5中)作为参比抗体。随后，将稀释好的抗体加入商业化的HBsAg板中(购于北京万泰)，并在37℃孵育1h,用PBST洗板5次，甩干。随后，加入GAH-HRP酶标二抗，孵育30min，用PBST洗板5次，甩干。并添加底物TMB溶液。显色15min后，用H2SO4终止显色反应，并于OD450/630测定读值。结果如图4所示，人源化抗体M1D,M3D均具有很好的抗原结合活性，且其对抗原HBsAg的亲和力都优于参比抗体162。上述结果表明，经过人源化改造的这两株抗体不仅具有极高的人源化程度(97％以上)，而且基本上保留了亲本抗体的抗原结合活性，甚至表现出比亲本抗体更好的抗原结合活性。
4.2抗体的初步表位鉴定
发明人还对抗体的表位进行了初步鉴定，以判断所筛选得到的人猴嵌合抗体及人源化抗体是否识别HBsAg上的SA表位。使用识别SA类型表位的高浓度的6D11交叉阻断待测抗体与HBsAg的结合情况，若有明显阻断(竞争)效果，则说明待测抗体与6D11识别同一表位，具体步骤如下：
(1)测定抗体浓度，按照10μg/孔的用量加入商业化的HBsAg ELISA板中，然后用20％NBS补足体积至50μL,37℃孵育30min。
(2)6D11-HRP用ED-11以1:20000稀释后,按照50μL/孔加入ELISA板，37℃孵育30min。
(3)用PBST洗板5次，甩干。
(4)并添加底物TMB溶液，显色15min后，用H2SO4终止显色反应。
(5)于OD450/630测定读值。
结果如图5所示，其中162在本实验中作阳性对照。M1D,M3D与HBsAg的结合均可被鼠源抗体6D11竞争，且竞争效果跟阳性对照162以及亲本抗体M1-23，M3-23相当。上述结果说明人源化抗体M1D,M3D同样识别SA表位。
4.3抗体的中和活性的测定
发明人利用实验室自制的细胞模型HepaG2-NTCP，来评估抗体中和HBV感染(100MOI HBV感染滴度)的能力。将一定量的HBV与梯度稀释的抗体共孵育于HepaG2细胞中，HBV能够侵入分化后的HepaG2细胞并在细胞中进行复制，随着不同抗体的加入及加入抗体量的变化，HBV的侵入和复制将会被不同程度的减弱或抑制，从而细胞上清中将呈现不同水平的HBV抗原(HBeAg)。因此，通过测定HBV抗原(HBeAg)的水平，即可判断不同人源化抗体中和HBV的能力。
对人源化抗体进行两倍浓度梯度稀释，并以162抗体作为阳性对照，从10μg/mL开始，共稀释18个梯度。将病毒感染体系分别与抗体混合，预孵育1h。然后加入预先铺好HepaG2的细胞板中，37℃培养24h，每隔两天对细胞进行换液。感染后第7天，取细胞培养上清，检测其中的HBeAg水平。
检测方法如下：
(1)反应板的制备：将anti-HBeAg单克隆抗体用20mM PB缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，pH 7.4)稀释到2μg/mL。向96孔化学反光板中加入稀释的anti-HBeAg单克隆抗体(100μL/孔)，37℃孵育2h后4℃过夜。所使用的原料均购自北京万泰生物药业股份有限公司。用PBST洗涤96孔化学反光板一次，甩干。向96孔化学反光板中加入封闭液，每孔200μL，37℃封闭2h。随后，弃去封闭液，将平板放入干燥间干燥，于2-8℃保存备用。
(2)孵育：向上述制备好的反应板中加入100μL/孔的待检样品，并在37℃温育60min。
(3)洗涤：用PBST洗涤96孔化学反光板5次，甩干。
(4)孵育：加入辣根过氧化物酶标记的anti-HBeAg抗体(100μl/孔)，并在37℃温育30min。原料购自北京万泰生物药业股份有限公司。
(5)洗涤：用PBST洗涤96孔化学反光板5次，甩干。
(6)显色：加入鲁米诺化学发光试剂(100μl/孔)。
(7)读板：利用化学发光酶标仪读取数值。
实验结果如图6A-6B所示，M1D对HBV的中和活性与参比抗体162相当。
实施例5：人源化抗体M1D,M3D的动物治疗效果的测定
将上述5株抗体按10mg/kg的剂量单剂尾静脉注射的方式施用给HBV转基因小鼠，每组6只HBV转基因小鼠。随后，通过眼眶后静脉丛取血采集小鼠的血液，并检测小鼠血清中的HBsAg水平和HBV DNA水平的变化。
5.1HBsAg的定量检测
(1)反应板的制备：将小鼠单克隆抗体HBs-45E9用20mM PB缓冲液(Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液，pH 7.4)稀释到2μg/mL，在化学发光板中每孔添加100μL的包被液，并在2-8℃下包被16-24h，随后再37℃包被2h，用PBST洗涤液洗涤平板一次，甩干。洗涤后，在各孔中加入200μL的封闭液，并在37℃封闭2h。随后，弃去封闭液，将平板放入干燥间干燥，于2-8℃保存备用。
(2)样品稀释：将采集的小鼠血清用含20％NBS(新生牛血清)的PBS溶液，稀释成1:30和1:150两个梯度，用于后续的定量检测。
(3)样品变性处理：取15μL经上述稀释的血清样品与7.5μL变性缓冲液(15％SDS，溶于20mM PB7.4)充分混匀，并在37℃反应1h。随后，加入90μL的中和缓冲液(4％CHAPS，溶于20mM PB7.4)，充分混匀。
(4)样品反应：在反应板中加入100μL经上述变性处理的血清样品，37℃反应1h。随后用PBST洗涤反应板5次，甩干。
(5)酶标记物反应：向化学发光板中按100μL/孔加入HBs-A6A7-HRP反应液,并在37℃反应1h。随后用PBST洗涤平板5次，甩干。
(6)发光反应和测量：向化学发光板中加入发光液(100μL/孔)，并进行光强检测。
(7)小鼠血清样品中的HBsAg浓度的计算：使用标准品进行平行实验，根据标准品的测定结果绘制标准曲线。然后，将小鼠血清样品的光强测量值代入标准曲线，计算出待检血清样品中的HBsAg浓度。
5.2HBV DNA的定量检测
HBV DNA的定量检测按照HBV DNA实时荧光定量检测试剂盒说明书进行(试剂盒购于上海科华生物工程股份有限公司)。
在本实施例中，测定了人源化抗体M1D、M3D、食蟹猴-人嵌合抗体M3-13以及参比抗体162在动物体内的病毒清除能力。实验结果如图7A-7B所示，结果显示人源化抗体M1D、M3D以及猴-人嵌合抗体M3-13均具有良好的病毒清除能力，其清除动物体内的HBsAg及HBV DNA的能力优于参比抗体162。
上述结果表明，本发明的人源化抗体不仅具有极高的人源化程度(最高可达98％)，能够减少免疫排斥反应的可能性，而且展示出与猴-人嵌合抗体相当且优于参比抗体162的病毒清除能力。这样的技术效果是显著的和出人意料的。
实施例6：人源化抗体M1D,M3D的非关键CDR区确定
在抗体可变区结构域中，与抗原直接结合的部位主要是CDR区，但很多研究表明，在抗体的6个CDR中并不都是抗原-抗体结合的关键区域，非关键CDR区可以通过CDR替换的方法来确定。本发明依据最适匹配原则选择CDR替换序列，通过IMGT信息系统，将人源化抗体M1D，M3D的VH和VL氨基酸序列分别输入查找框中，然后将系统搜索出的胚系基因对应的抗体轻重链氨基酸序列，按照FR区同源性最高，CDR区序列差异性最大的原则选择人源化抗体CDR替换序列，除重链CDR3以外的每个CDR区最终选择两条相对应的替换序列。替换序列见下表：
表12：人源化抗体M1D,M3D CDR替换序列
根据上表所述CDR替换序列，设计相关引物，并通过PCR的方法，替换M1D，M3D抗体中相对应的CDR区，引物设计见下表。以M1D重链可变区CDR1(M1D-HCDR1)的第一种替换(M1D-H-CDR1-A)为例，设计寡核苷酸引物M1D-H-CDR1-A R及M1D-H-CDR1-A F(其序列示于下表),并将该替换CDR后的抗体命名为M1D HCDR1-1，其他替换后抗体的命名方式以此类推。PCR的具体方案如下：以M1D-H的编码基因为模板，用引物对pTT5-M1D-H-F/M1D-H-CDR1-A R和M1D-H-CDR1-A F/pTT5-M1D-H-R分别扩增出上、下游片段；通过重叠延伸PCR将片段连接到一起，再以pTT5-M1D-H-F/pTT5-M1D-H-R为上下游引物进行扩增，获得在M1D-HCDR1发生CDR替换的基因片段。
表13：CDR替换引物序列
按照上述方法，将获得的重链CDR替换的基因片段分别与真核表达载体pTT5-CH连接，并与相对应的没有进行CDR替换的轻链表达载体小量转染HEK293-细胞，并检测小量表达的细胞上清是否具有抗原活性；同样，将获得的轻链CDR替换的基因片段分别与真核表达载体pTT5-Cκ连接，并与相对应的没有进行CDR替换的重链表达载体进行小量转染并检测转染上清的抗原结合活性。
如果人源化抗体的某个CDR区被替换后，对应的细胞转染上清没有抗原结合活性或者结合活性显著下降，则说明被替换的CDR区是抗体抗原结合的关键CDR区。如果替换后，对应的细胞转染上清抗原结合活性基本不变，则说明被替换的CDR区不是抗体抗原结合的关键区域。
M1D替换结果如图8A-8E所示，M1D重链CDR1(M1D-H-CDR1)和轻链CDR2(M1D-L-CDR2)替换后，与HBsAg抗原结合活性基本没变；而重链CDR2和轻链CDR1替换后，抗原结合活性显著下降；而轻链CDR3替换后，完全失去抗原结合活性。上述结果表明，抗体M1D的HCDR1和LCDR2不是与抗原HBsAg结合的关键CDR区，对其替换并不会影响抗体与抗原的结合活性。
M3D替换结果如图9A-9E所示，M3D重链CDR2(HCDR2)和轻链CDR2(LCDR2)替换后，抗原结合活性基本没变；而轻链CDR1替换后，一种替换(M3D-LCDR1-1)抗原结合活性明显下降，另一种替换(M3D-LCDR1-2)，基本没有抗原结合活性；重链CDR1(HCDR1)和轻链CDR3(LCDR3)替换后，基本没有抗原结合活性。上述结果表明，抗体M3D的HCDR2和LCDR2不是与抗原结合的关键CDR区，对其替换并不会影响抗体与抗原的结合活性。
实施例7：人源化抗体M1D,M3D与抗原结合关键氨基酸确定
为了确定抗体抗原相互作用的关键氨基酸位点，我们对M1D的4个CDR区HCDR2、HCDR3、LCDR1、LCDR3和M3D的4个CDR区HCDR1、HCDR3、LCDR1、LCDR3进行丙氨酸扫描。关键氨基酸往往具有一定的保守性，比如维持抗体构象的氨基酸残基和被包埋的氨基酸残基，这些氨基酸突变成丙氨酸以后会导致抗体失去活性。突变后的抗体通过Elisa的方法检测同HBsAg的结合活性并计算突变后抗体的rEC50(WT/Mutation，原始抗体EC50相对值为1，完全失去结合活性的用0标示)，将突变后rEC50＜0.2即活性下降5倍的用蓝色标示出来，包括D、E、R、H、L、W、Y等氨基酸残基。结果如表14所示，其中，酸性氨基酸D、E，碱性氨基酸R、H在抗体抗原结合时可以形成盐桥，从而在抗体抗原的结合反应中起重要作用，把这些氨基酸突变成丙氨酸后会破坏离子键的形成从而使抗体结合活性大大降低；脂肪族氨基酸L，属于疏水性氨基酸；W、Y属于芳香族氨基酸，在维持抗体构象中起重要作用。其中，M1D的H56Y、H97D、H100cD、H100dL、94L、L96L突变成丙氨酸后活性显著下降，为不可变点；M3D的H33Y、H34D、H35W、H94R、H95D、H101E、L27dY、L32Y、L91H突变成丙氨酸后活性显著下降，为不可变点。
表14：M1D、M3D关键氨基酸位点确定
实施例8：M1D、M3D识别的核心表位鉴定
M1D、M3D识别SA线性表位，为了进一步确定两株抗体识别的核心表位，我们将HBsAg的aa113-135(SEQ ID NO:168)进行单点突变共合成下列表格中的14条多肽。多肽用CB稀释，100ng/mL包板，抗体用20％NBS溶液释到1000ng/mL，之后按照3倍稀释12个梯度，并用Elisa的方法检测抗体与不同单点突变多肽的结合活性，用PRISM软件绘制结合曲线。若突变后结合活性丧失，说明该突变位点为SA线性表位上的关键氨基酸。
表15：SEQ13-B点突变肽序列
M1D、M3D及参比抗体162与上述单点突变多肽结合的EC50值汇总到下列表16(完全失去结合活性的用>500表示)，由结果可知，162结合的核心表位为CKTC(aa121-124)，而M1D结合的核心表位TGPCKTCT(aa118-124)，比参比抗体162更长，且在aa113-135位置靠前；M3D结合的核心表位为CKTCT(aa121-125)，核心表位位置比162靠后。
表16：M1D、M3D与HBsAg(aa113-135)单点突变多肽结合的EC50值
为了进一步验证抗体在抗原上结合的关键位置，我们将上述实验在HBsAg抗原蛋白进行验证。设计相关引物(表17)，并通过PCR的方法扩增14条带点突变HBsAg基因片段，扩增出的片段分别用Gibson连接入经过EcoRI和BamHI双酶切的PTT5空载中，测序正确即载体构建完成。将构建好的质粒小量转染HEK293T细胞，转染两天后，收集细胞，做western blot进行验证，具体步骤如下：
(1)收集细胞，用5mL PBS洗涤细胞两次，细胞计数后1000rpm离心5分钟；
(2)按照每1×10^6个细胞加入30μL DDM裂解细胞(也可用BCA法定量细胞蛋白量)，4℃裂解2h，期间用振荡器振荡几次；
(3)13300rpm离心10分钟，吸取上清制样，并取30μL进行还原SDS-PAGE凝胶电泳；
(4)用电转仪转膜300mA恒流电转90min，商业化封闭液37℃封闭1h；
(5)1mg/mL抗体M1D、M3D和162分别用ED-11稀释1000倍并在37℃条件下孵育1h；
(6)PBST每间隔5分钟洗涤1次，共3次；
(7)加入酶标二抗GAH-HRP(1:5000)，37℃孵育30min；
(8)PBST每间隔5分钟洗涤1次，共3次；
(9)显色拍照；(10)以β-actin作内参，将步骤(4)中PVDF膜β-actin对应位置裁下，直接37℃孵育HRP偶联的mouse anti-β-actin抗体(1:5000)30min，其他步骤同上。结果如图10所示，可以看出，在HBsAg抗原蛋白验证的三个抗体的核心表位与在线性多肽上完全一致。
表17：C-HBsAg单点突变引物
实施例9：M1D、M3D广谱活性鉴定
为了进一步确认M1D、M3D的广谱活性，我们将不同亚型A-G(其中F型包括F1、F2)对应的HBsAg片段(aa113-135)包板(序列见表18)，多肽用CB稀释，100ng/mL包板，抗体用20％NBS溶液释到1000ng/mL，之后按照3倍稀释12个梯度，并用Elisa的方法检测M1D、M3D与不同亚型的HBsAg(aa113-135)的结合活性，用PRISM软件绘制结合曲线。结果如图11A-11B所示，M1D、M3D均可以与大部分HBV亚型结合。
表18：不同亚型的HBsAg-aa113-135氨基酸序列
实施例10：M1D、M3D的亲和力测定
以5μg/mL的HBsAg溶解于醋酸钠(pH 4.5)在Biacore 3000设备上运行包被芯片程序，将HBsAg包被至CM5芯片上，HBsAg的包被量为2400RU。将分析物从100nM，2倍梯度稀释，制备7个浓度的样品。在Biacore 3000设备上运行亲和力测定程序，设置流速为50μl/min，结合时间为90s，解离时间为600s，样品室的温度设置为10℃，再生液为50mM NaOH，再生流速为50μL/min，再生时间为60s。表19展示了M1D分子和M3D分子与抗原HBsAg的亲和力，分别为1.06nM和1.12nM。
表19：M1D、M3D与抗原的亲和力
实施例11：给食蟹猴单次静脉注射抗体M1D、M3D后的药代动力学及初步毒性的评估
将6只未曾经历过大分子实验(>2000Dalton)的雄性食蟹猴分成2组，3只/组。其中，通过静脉推注给第1组和第2组的食蟹猴施用剂量为20mg/kg的抗体M1D和M3D溶液。评估给食蟹猴单次静脉注射抗体M1D和M3D后的药代动力学特征及初步毒性反应。具体的实验设计如表20。
表20：评估M1D、M3D分子药代动力学特征及初步毒性反应的实验设计
在给药前(0小时)，每天两次(上午9:30和下午4:00)笼边观察实验动物的健康及外观的状态。在实验开展前对实验动物进行体检，以确认动物的健康状态。在给药当天，在每个采血点前后分别观察实验动物的状态，包括实验动物的一般状态、行为、活动量、排泄、呼吸及其它异常症状。结果显示，所有动物在给药期间及给药后均未表现出任何异常反应。此外，还在给药后，跟踪实验动物的体重和体温。结果示于表21-24中。
表21：M1D给药后的实验动物的体重
表22：M1D给药后的实验动物的体温
表23：M3D给药后的实验动物的体重
表24：M3D给药后的实验动物的体温
上述实验结果表明，抗体M1D和M3D在施用给实验动物后，不会引起实验动物的不良副作用，从而初步证实了两株抗体良好的安全性。
此外，还分别于给药前(0小时)，给药后0.25h(15分钟)、0.5h(30分钟)、1h、2h、4h、10h、24h(Day 1)、48h(Day 2)、72h(Day 3)、96h(Day 4)、144h(Day 6)、192h(Day 8)、240h(Day 10)、336h(Day 14)、408h(Day 17)、504h(Day 21)及672h(Day 28)，从实验动物的头静脉采集约1.0mL全血。对收集的血清和全血进行下述分析。
采用化学发光免疫分析法(CLIA)，检测食蟹猴血清中抗体M1D和M3D的浓度。血清中人源化抗体M1D和M3D的定量下限(LLOQ)为0.063ng/mL，定量上限(ULOQ)为4.0ng/mL。检测结果示于图12A-12B中。
图12A显示了单次静脉注射20mg/kg的人源化抗体M1D后，每一只食蟹猴血清(第1组)中人源化抗体M1D的血药浓度随时间变化的曲线图。
图12B显示了单次静脉注射20mg/kg的人源化抗体M3D后，每一只食蟹猴血清(第2组)中人源化抗体M3D的血药浓度随时间变化的曲线图。
使用药动学软件WinNonlinTM Version 6.2.1(Pharsight，Mountain View，CA)，以静脉注射非房室模型(IV bolus input)对人源化抗体M1D、M3D的实验数据进行处理。
使用对数线性梯形法计算下列参数：起始血清药物浓度(C0)、最后一个可检测点的时间(Tlast)，消除半衰期(T1/2)，表观分布容积(Vdss)，总体清除率(CL)，从零时间点到最后一个可检测到浓度的时间点的平均滞留时间(MRT0-last)，从零时间点到无穷大的平均滞留时间(MRT0-inf)，从零时间点到最后一个可检测到浓度的时间点的血清浓度-时间曲线下面积(AUC0-last)，及从零时间点到无穷大的血清浓度-时间曲线下面积(AUC0-inf)。
结果显示：单次静脉注射20mg/kg的人源化抗体M1D后，雄性食蟹猴对人源化抗体M1D的CL为0.00962±0.00335mL/min/kg。人源化抗体M1D的平均消除半衰期(t1/2)为81.3±78.7小时。食蟹猴血清中人源化抗体M1D的Vdss和AUC0-inf值分别为0.05±0.0209L/kg和38053±14915μg.h/mL。
单次静脉注射20mg/kg的人源化抗体M3D后，雄性食蟹猴对人源化抗体M3D的CL为0.0049±0.0025mL/min/kg。人源化抗体M3D的平均消除半衰期(t1/2)为134±94.6小时。食蟹猴血清中人源化抗体M3D的Vdss和AUC0-inf值分别为0.0497±0.0143L/kg和79419±33500μg.h/mL。
上述实验结果还概述于表25和表26中。
表25：第1组雄性食蟹猴的血清中人源化抗体M1D的主要药动学参数
表26：第2组雄性食蟹猴的血清中人源化抗体M3D的主要药动学参数
另外，还对食蟹猴的血清进行血常规化学分析。食蟹猴血清中的各项指标(包括胆红素，丙氨酸转氨酶，天冬氨酸转氨酶，总蛋白，白蛋白，碱性磷酸酶，γ-谷氨酰转移酶，葡萄糖，尿素，肌酸酐，钙离子，磷，总胆固醇，甘油三酯，钠离子，钾离子，氯离子和球蛋白等的水平)均未见明显异常。这些实验结果表明，在指定的剂量条件下人源化抗体M1D或M3D的单次静脉注射是安全的。因此，本发明的人源化抗体M1D或M3D可施用给受试者(例如人)，以预防和/或治疗HBV感染或与HBV感染相关的疾病(例如乙肝)。
实施例12：M1D及M3D的成药性评估
1.人源化抗体M1D及M3D的等电点测定
利用毛细管等电聚焦电泳法(cIEF)对人源化抗体M1D和M3D的等电点进行测定。实验结果如表27所示。结果显示，人源化抗体M1D的pI值为8.8，M3D的pI为9.0。
表27：M1D、M3D的等电点
2.人源化抗体M1D、M3D的稳定性测定
通常使用Tm值来描述抗体分子的稳定性。Tm值越高，抗体分子的热稳定性越好。将人源化抗体M1D和M3D分别溶解于三种缓冲液中，并稀释至1mg/ml，并通过差式扫描量热法(DSC)进行测试。开始扫描温度设置为10℃，结束扫描温度设置为110℃，扫描速度为200℃/hr，冷却速度设置为Exp，最终仪器保持温度设置为25℃，数据采集频率设置为10sec，进样前毛细管温度设置为30℃。实验结果示于图13A-13B、表28-29中。结果显示，人源化抗体M1D的Tm onset为61.7℃以上，而M3D的Tmonset值均大于61.6℃，说明M1D和M3D具有很好的热稳定性。
表28：M1D的Tm值
Buffer
Tm onset(℃)
Tm1(℃)
Tm2(℃)
Acetate pH5.0
61.7
68.9
95.6
Histidine pH6.0
63.8
71.0
96.1
PBS 7.2
65.6
72.9
92.4
表29：M3D的Tm值
Buffer
TM onset(℃)
TM1(℃)
TM2(℃)
Acetate 5.0
61.6
68.8
82.2
Histidine 6.0
62.8
71.1
82.3
PBS7.2
65.7
78.5
/
此外，将人源化抗体M1D和M3D，以60mg/ml的浓度溶解于pH6.0的组氨酸缓冲液，以2mg/ml的浓度溶解于pH7.2的磷酸缓冲液，然后分别储存于40℃的条件下。分别于第0周(T0)、第1周(T1W)和第2周(T2W)，对样品的理化性质(包括外观、pH值、蛋白浓度等)进行监测。结果描述于表30和表31中。
表30：M1D稳定性测试
表31：M3D稳定性测试
外观的监测
将样品瓶擦拭干净，并使用澄明度检测仪(黑背景和白背景)来观察样品的颜色和澄清度。上述表30-31的结果显示，两种缓冲液及40℃储存条件下的人源化抗体M1D和M3D样品均未出现明显变化。
pH值和蛋白浓度的监测
检测样品在A280处的吸光值，利用比尔-朗伯定律(Beer–Lambert law)，计算样品中的蛋白浓度。另外，使用pH计测定样品的pH值，重复测定2次，取平均值为最终结果。实验结果示于上述表30-31中。结果显示，人源化抗体M1D和M3D在不同缓冲液，40℃下储存2周后，pH值和蛋白浓度未发生显著改变。
SEC-HPLC检测
采用Agilent 1260infinity，TSK G3000SWXL凝胶柱(5μm,7.8mm×300mm)，通过SEC-HPLC对经历不同储存条件的人源化抗体M1D和M3D样品进行分析，其中，流动相组成为50mM PB+300mM NaCl，pH7.0±0.2；流速为1.0mL/min；检测波长为280nm；样品浓度为10mg/mL，进样量为10μL。实验结果示于上述表30-31中。结果显示，在不同储存条件(不同缓冲液，不同储存时间)下，含有人源化抗体M1D和M3D的样品的主峰均大于95％。这说明，人源化抗体M1D和M3D是稳定的。
cIEF检测
利用毛细管电泳对样品进行测试分析，结果显示M1D分子在组氨酸缓冲液中40℃储存2周后cIEF主峰下降6.0％，而在PBS缓冲液中储存2周后，主峰下降24.9％。对于M3D而言，在组氨酸缓冲液中40℃储存2周后cIEF主峰下降13.7％，而在PBS缓冲液中储存2周后，主峰下降30.6％。
3.人源化抗体M1D及M3D变体的可溶性分析
将人源化抗体M1D和M3D分别以60mg/mL的浓度溶解在含有5％蔗糖和0.02％PS80的25mM组氨酸溶液(pH 6.0)中，并进行离心超滤浓缩(离心温度为5℃，转速为4850rpm)，直至样品溶液的液面随着离心时间的增加而不再有明显下降。用移液器小心回收样品，观察此时样品的性状。结果显示，溶液样品呈黄色。
然后，移取1000μL的溶液样品至1.5mL EP管中，以10000rpm离心20分钟。离心结果显示，样品无分层，液体澄清，且无沉淀出现。用移液器分别小心吸取离心后样品的上层和下层，并通过UV280测定蛋白浓度。结果显示，M1D的溶解度为171mg/ml；M3D的溶解度170mg/ml。进一步，对溶解在含有5％蔗糖和0.02％PS80的25mM组氨酸溶液(pH 6.0)中的人源化抗体M1D和M3D变体的粘度进行测定。在该缓冲体系中，人源化抗体M1D在171mg/mL浓度下的粘度为13.2cp(1cP＝1mPa.s)，而M3D在170mg/mL浓度下的粘度为19.8cp，在100mg/ml下粘度为11.5cp。
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 厦门大学
养生堂有限公司
<120> 用于治疗乙肝感染及相关疾病的抗体
<130> IDC210074
<150> CN 201710223992.8
<151> 2017-04-07
<160> 220
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 重链可变区
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Ile Leu Ser Val Thr Cys Ser Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn
20 25 30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Arg Ser Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Leu Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Leu Arg Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 轻链可变区
<400> 2
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Asn Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Thr Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 重链可变区
<400> 3
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro
20 25 30
Tyr Asp Trp Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Arg Ile His Gly Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Ile Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Glu Thr Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 4
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23/M3-13 轻链可变区
<400> 4
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Ala Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Arg Gly Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 5
<211> 116
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 重链可变区
<400> 5
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Ser Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Pro Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Ala Ser Asn Ser Ser Asn
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Arg Ile Tyr Gly Asn Ser Gly Ser Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Thr Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Phe Cys
85 90 95
Ala Arg Gly Ser Val Tyr Thr Tyr Ser Trp Gly Gln Gly Val Leu Val
100 105 110
Thr Val Ser Ser
115
<210> 6
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 HCDR1
<400> 6
Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn Phe
1 5
<210> 7
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 HCDR2
<400> 7
Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr
1 5
<210> 8
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 HCDR3
<400> 8
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe
1 5 10 15
<210> 9
<211> 6
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 LCDR1
<400> 9
Gln Asp Ile Ser Ser Ser
1 5
<210> 10
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 LCDR2
<400> 10
Tyr Ala Asn
1
<210> 11
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 LCDR3
<400> 11
Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 12
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 HCDR1
<400> 12
Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro Tyr Asp Trp
1 5 10
<210> 13
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 HCDR2
<400> 13
Ile His Gly Asn Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 14
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 HCDR3
<400> 14
Val Arg Asp Glu Thr
1 5
<210> 15
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23/M3-13 LCDR1
<400> 15
Gln Ser Leu Leu Tyr Ser Ser Asn Asn Lys Asn Tyr
1 5 10
<210> 16
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23/M3-13 LCDR2
<400> 16
Trp Ala Ser
1
<210> 17
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23/M3-13 LCDR3
<400> 17
Gln Gln His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr
1 5
<210> 18
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 HCDR1
<400> 18
Gly Ala Ser Asn Ser Ser Asn Tyr
1 5
<210> 19
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 HCDR2
<400> 19
Ile Tyr Gly Asn Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 20
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 HCDR3
<400> 20
Ala Arg Gly Ser Val Tyr Thr Tyr Ser
1 5
<210> 21
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 HFR1
<400> 21
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Ile Leu Ser Val Thr Cys Ser Val Ser
20 25
<210> 22
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23/M1D HFR2
<400> 22
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Tyr
<210> 23
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 HFR3
<400> 23
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Arg Ser Arg Val Thr Leu Ser Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Leu Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 24
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 HFR4
<400> 24
Trp Gly Gln Gly Leu Arg Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 25
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 LFR1
<400> 25
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr
20 25
<210> 26
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 LFR2
<400> 26
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Gln Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 27
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23 LFR3
<400> 27
Arg Leu Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Thr
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 28
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1-23/M1D LFR4
<400> 28
Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 29
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 HFR1
<400> 29
Gln Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser
20 25
<210> 30
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 HFR2
<400> 30
Thr Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg
1 5 10 15
<210> 31
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 HFR3
<400> 31
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Asn Arg Val Thr Ile Ser Lys Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Ile Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23/M3-13 HFR4
<400> 32
Trp Gly Gln Gly Val Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 33
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 LFR1
<400> 33
Asp Ile Gln Met Ser Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
20 25
<210> 34
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 LFR2
<400> 34
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Lys Leu Leu Phe
1 5 10 15
Tyr
<210> 35
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23 LFR3
<400> 35
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Arg Gly Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 36
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-23/M3D LFR4
<400> 36
Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
1 5 10
<210> 37
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 HFR1
<400> 37
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Arg Leu Val Lys Ser Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Pro Leu Thr Cys Ala Val Ser
20 25
<210> 38
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 HFR2
<400> 38
Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly
1 5 10 15
Arg
<210> 39
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3-13 HFR3
<400> 39
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Ser Ile Ser Thr Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Phe Cys
35
<210> 40
<211> 97
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGHV4-4*08
<400> 40
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Arg
<210> 41
<211> 95
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGKV1-39*01
<400> 41
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Tyr Ser Thr Pro
85 90 95
<210> 42
<211> 98
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGHV4-4*02
<400> 42
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Asn Trp Trp Ser Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Glu Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg
<210> 43
<211> 101
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> IGKV4-1*01
<400> 43
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Ser Thr Pro
100
<210> 44
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D HFR1
<400> 44
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser
20 25
<210> 45
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D HFR3
<400> 45
Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 46
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D HFR4
<400> 46
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 47
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D LFR1
<400> 47
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr
20 25
<210> 48
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D LFR2
<400> 48
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
1 5 10 15
Tyr
<210> 49
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D LFR3
<400> 49
Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala
20 25 30
Thr Tyr Tyr Cys
35
<210> 50
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D HFR1
<400> 50
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser
20 25
<210> 51
<211> 16
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D HFR2
<400> 51
Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile Gly Arg
1 5 10 15
<210> 52
<211> 38
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D HFR3
<400> 52
Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys
1 5 10 15
Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp
20 25 30
Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 53
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D HFR4
<400> 53
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
1 5 10
<210> 54
<211> 26
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D LFR1
<400> 54
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser
20 25
<210> 55
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D LFR2
<400> 55
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro Pro Lys Leu Leu Phe
1 5 10 15
Tyr
<210> 56
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D LFR3
<400> 56
Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
1 5 10 15
Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala
20 25 30
Val Tyr Tyr Cys
35
<210> 57
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D 重链可变区
<400> 57
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn
20 25 30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 58
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D 轻链可变区
<400> 58
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Tyr Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 59
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D 重链可变区
<400> 59
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro
20 25 30
Tyr Asp Trp Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Arg Ile His Gly Asn Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Glu Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 60
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D 轻链可变区
<400> 60
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 61
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 61
ggacagcckg gaaggtgtgc 20
<210> 62
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 62
gaggcagttc cagatttcaa 20
<210> 63
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 63
ccgcgtactt gttgttgctc tgt 23
<210> 64
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 64
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtcag gcccag 56
<210> 65
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 65
caggagtcag gcccaggact ggtgaagcct tcggagaccc tgtccctcac ctgcac 56
<210> 66
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 66
aagccttcgg agaccctgtc cctcacctgc actgtctctg gtggctccat c 51
<210> 67
<211> 56
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 67
gttcttggac gtgtctacgg atatggtgac tcgactcttg agggaggggt tgtagt 56
<210> 68
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 68
tccgtagaca cgtccaagaa ccagttctcc ctgaaactga gctc 44
<210> 69
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 69
gatgggccct tggtcgacgc tgaagagacg gtgacggtgg tcccttggcc ccagaaatc 59
<210> 70
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 70
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catacagatg acgcagtctc catcc 55
<210> 71
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 71
cagcaaaaac cggggaaagc ccctaagctc ctgatctatt atgc 44
<210> 72
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 72
gaaccttgat gggaccccac tttgcaaacg atttgcataa tagatcagga gc 52
<210> 73
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 73
ctgtcccaga tccactgcca ctgaaccttg atgggacccc 40
<210> 74
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 74
gcagtggatc tgggacagat ttcactctca ccatcagcag cctgcaacct gagg 54
<210> 75
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 75
gcagcctgca acctgaggat tttgcaactt attactgtca ac 42
<210> 76
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 76
gaccaaggtg gaaatcaaac gtacggtggc tgcaccat 38
<210> 77
<211> 69
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 77
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtcgg gcccaggact 60
ggtgaagcc 69
<210> 78
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 78
attcccgggt agatgcccag taaaagagca gcttaggagg ctgtcctggt ttctgctg 58
<210> 79
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 79
ggtgtctcca tcagcagtcc ttatgactgg acctgggtcc gccagccccc agggaag 57
<210> 80
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 80
aactggttct tggacttgtc tactgaaatg gtgactcgac tcttgaggga ggggttg 57
<210> 81
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 81
agacaagtcc aagaaccagt tctccctgaa gctgagctct gtgaccgccg c 51
<210> 82
<211> 59
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 82
gaaacctggg gccagggaac cctggtcacc gtctcctcag cgtcgaccaa gggcccatc 59
<210> 83
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 83
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catcgtgatg acccagtctc cagactcc 58
<210> 84
<211> 64
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 84
cccagtctcc agactccctg gctgtgtctc tgggagagag ggccaccatc aactgcaagt 60
ccag 64
<210> 85
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 85
cagcagaaac caggacagcc tcctaagctg ctcttttact gggcatctac ccgggaat 58
<210> 86
<211> 66
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 86
gtgaaatctg tcccagatcc actgccactg aatcggtcag ggaccccgga ttcccgggta 60
gatgcc 66
<210> 87
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 87
ggcagtggat ctgggacaga tttcactctc accatcagca gcctgcaggc tgaagatg 58
<210> 88
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 88
atggtgcagc caccgtacgt ttgatttcca ccttggtcc 39
<210> 89
<211> 52
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 89
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtcag gc 52
<210> 90
<211> 35
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 90
gatgggccct tggtcgacgc tgaagagacg gtgac 35
<210> 91
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 91
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catacagatg acgcagtc 48
<210> 92
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 92
atggtgcagc caccgtacgt ttgatttcca ccttggtccc 40
<210> 93
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 93
gtagtaacta ctgatggagc caccagagac agtgcaggtg ag 42
<210> 94
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 94
ggtggctcca tcagtagtta ctactggagc tggatccgcc ag 42
<210> 95
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 95
atagtaacta ccactgctga cggagccacc agagacagtg caggtgag 48
<210> 96
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 96
ggtggctccg tcagcagtgg tagttactat tggagctgga tccgccag 48
<210> 97
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 97
ggtgctccca ctggtataga tatacccaat ccactccag 39
<210> 98
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 98
atctatacca gtgggagcac cgactacaac ccctccctc 39
<210> 99
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 99
tgtgtaacta ctactactac taatataccc aatccactcc ag 42
<210> 100
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 100
attagtagta gtagtagtta cacagactac aacccctccc tc 42
<210> 101
<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 101
gtagctgctg ctaacactct gagttgcccg gcaagtgatg g 41
<210> 102
<211> 37
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 102
cagagtgtta gcagcagcta cttaaattgg tatcagc 37
<210> 103
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 103
agtattactt ccgatgttgg agctagttgc ccggcaagtg atgg 44
<210> 104
<211> 40
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 104
agctccaaca tcggaagtaa tactttaaat tggtatcagc 40
<210> 105
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 105
gaccccactt tgcaaacggg atgcagcata gatcaggagc ttagg 45
<210> 106
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 106
cctaagctcc tgatctatgc tgcatcccgt ttgcaaagtg gggtc 45
<210> 107
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 107
gaccccactt tgcaaacgag acgccttata gatcaggagc ttagg 45
<210> 108
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 108
cctaagctcc tgatctataa ggcgtctcgt ttgcaaagtg gggtc 45
<210> 109
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 109
agtgagaggg taattgtaat cttgtagaca gtaataagtt gcaaaatc 48
<210> 110
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 110
ctacaagatt acaattaccc tctcactttc ggcggaggga ccaag 45
<210> 111
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 111
agtgagaggt aaactactac tctgatgaca gtaataagtt gcaaaatc 48
<210> 112
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 112
catcagagta gtagtttacc tctcactttc ggcggaggga ccaag 45
<210> 113
<211> 49
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 113
agtagcaact gcaaccggtg tacattctca ggtgcagctg caggagtcg 49
<210> 114
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 114
gatgggccct tggtcgacgc tgaggagacg gtgaccag 38
<210> 115
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 115
agtagcaact gcaaccggtg tacattctga catcgtgatg acccagtctc 50
<210> 116
<211> 38
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 116
atggtgcagc caccgtacgt ttgatttcca ccttggtc 38
<210> 117
<211> 54
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 117
ggagtaacca ccactgctga tggagccacc agagacagcg caggtgaggg acag 54
<210> 118
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 118
ggtggctcca tcagcagtgg tggttactcc acctgggtcc gccagccc 48
<210> 119
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 119
ccagttacta ctgctgatgg agccaccaga gacagcgcag gtgagggaca g 51
<210> 120
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 120
ggtggctcca tcagcagtag taactggacc tgggtccgcc agccc 45
<210> 121
<211> 39
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 121
ggtgctccca ctatgataga ttcgtccaat ccactccag 39
<210> 122
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 122
atctatcata gtgggagcac cagctacaac ccctccctca ag 42
<210> 123
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 123
tgtgctacca ccactaccac taattcgtcc aatccactcc ag 42
<210> 124
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 124
attagtggta gtggtggtag cacaagctac aacccctccc tcaag 45
<210> 125
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 125
ataggtcttt ccatcactat gcaggaggct ctggctggac ttgcagttga tggtggc 57
<210> 126
<211> 55
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 126
cagagcctcc tgcatagtga tggaaagacc tatttagcct ggtaccagca gaaac 55
<210> 127
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 127
gtagctgctg ctaacactct ggctggactt gcagttgatg gtggc 45
<210> 128
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 128
cagagtgtta gcagcagcta cttagcctgg taccagcaga aac 43
<210> 129
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 129
gggaccccgg attcccgggt agaacccaag taaaagagca gcttaggagg 50
<210> 130
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 130
cctcctaagc tgctctttta cttgggttct acccgggaat ccggggtccc 50
<210> 131
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 131
gggaccccgg attcccgggt ggatgcaccg taaaagagca gcttaggagg 50
<210> 132
<211> 50
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 132
cctcctaagc tgctctttta cggtgcatcc acccgggaat ccggggtccc 50
<210> 133
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 133
cgtccaagga gtactataat attgctgaca gtaatacact gccacatc 48
<210> 134
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 134
cagcaatatt atagtactcc ttggacgttc ggccaaggga ccaag 45
<210> 135
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 135
cgtccaagga gtttgtagag cttgcataca gtaatacact gccacatc 48
<210> 136
<211> 45
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 136
atgcaagctc tacaaactcc ttggacgttc ggccaaggga ccaag 45
<210> 137
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGHV4-4*08) for M1D HCDR-1
<400> 137
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr Tyr
1 5
<210> 138
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGHV4-61*01) for M1D HCDR-1
<400> 138
Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly Ser Tyr Tyr
1 5 10
<210> 139
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV1-39*01) for M1D LCDR-2
<400> 139
Ala Ala Ser
1
<210> 140
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGKV1-5*03) for M1D LCDR-2
<400> 140
Lys Ala Ser
1
<210> 141
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGHV4-4*02) for M3D HCDR-2
<400> 141
Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 142
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGHV3-23*02) for M3D HCDR-2
<400> 142
Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr
1 5
<210> 143
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV2-28*01) for M3D LCDR-2
<400> 143
Leu Gly Ser
1
<210> 144
<211> 3
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGKV3-15*01) for M3D LCDR-2
<400> 144
Gly Ala Ser
1
<210> 145
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGHV4-4*08) for M1D HCDR-2
<400> 145
Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr
1 5
<210> 146
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGHV3-11*03) for M1D HCDR-2
<400> 146
Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Thr
1 5
<210> 147
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV3D-7*01) for M1D LCDR-1
<400> 147
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 148
<211> 8
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGLV1-44*01) for M1D LCDR-1
<400> 148
Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Thr
1 5
<210> 149
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV1-6*01) for M1D LCDR-3
<400> 149
Leu Gln Asp Tyr Asn Tyr Pro Leu Thr
1 5
<210> 150
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV6-21*02) for M1D LCDR-3
<400> 150
His Gln Ser Ser Ser Leu Pro Leu Thr
1 5
<210> 151
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGHV4-30-4*07) for M3D HCDR-1
<400> 151
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly Gly Tyr Ser
1 5 10
<210> 152
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGHV4-4*01) for M3D HCDR-1
<400> 152
Gly Gly Ser Ile Ser Ser Ser Asn Trp
1 5
<210> 153
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV2-29*02) for M3D LCDR-1
<400> 153
Gln Ser Leu Leu His Ser Asp Gly Lys Thr Tyr
1 5 10
<210> 154
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGKV3D-7*01) for M3D LCDR-1
<400> 154
Gln Ser Val Ser Ser Ser Tyr
1 5
<210> 155
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-A (IGKV4-1*01) for M3D LCDR-3
<400> 155
Gln Gln Tyr Tyr Ser Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 156
<211> 9
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CDR-B (IGKV2-28*01) for M3D LCDR-3
<400> 156
Met Gln Ala Leu Gln Thr Pro Trp Thr
1 5
<210> 157
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D (HCDR1-A) 重链可变区
<400> 157
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Tyr
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 158
<211> 124
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D (HCDR1-B) 重链可变区
<400> 158
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Val Ser Ser Gly
20 25 30
Ser Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Tyr Ile Ser Gly Ser Gly Thr Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro
50 55 60
Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln
65 70 75 80
Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr
85 90 95
Tyr Cys Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp
100 105 110
Phe Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 159
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D (LCDR2-A) 轻链可变区
<400> 159
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Ala Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 160
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D (LCDR2-B) 轻链可变区
<400> 160
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Gln Asp Ile Ser Ser Ser
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr Lys Ala Ser Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu Pro Leu
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 161
<211> 122
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D (HCDR2-B) 重链可变区
<400> 161
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Thr Ser Asn
20 25 30
Phe Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Ser Ser Ser Ser Ser Tyr Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Ser His Asp Tyr Gly Ser Asn Asp Tyr Ala Phe Asp Phe Trp
100 105 110
Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
115 120
<210> 162
<211> 109
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M1D (LCDR1-B) 轻链可变区
<400> 162
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Thr Ser Ser Asn Ile Gly Ser
20 25 30
Asn Thr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Tyr Ala Asn Arg Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu
65 70 75 80
Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Ser Leu
85 90 95
Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105
<210> 163
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D (HCDR2-A) 重链可变区
<400> 163
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro
20 25 30
Tyr Asp Trp Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Arg Ile Tyr Thr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu
50 55 60
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe Ser
65 70 75 80
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Val Arg Asp Glu Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
100 105 110
<210> 164
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D (HCDR2-B) 重链可变区
<400> 164
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gly
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Ala Val Ser Gly Val Ser Ile Ser Ser Pro
20 25 30
Tyr Asp Trp Thr Trp Val Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Arg Ile Ser Gly Ser Gly Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Lys Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Val Arg Asp Glu Thr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Ser
<210> 165
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D (LCDR2-A) 轻链可变区
<400> 165
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Leu Gly Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 166
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D (LCDR2-B) 轻链可变区
<400> 166
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Tyr Ser
20 25 30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln
35 40 45
Pro Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
His Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
100 105 110
Lys
<210> 167
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> M3D (LCDR1-A) 轻链可变区
<400> 167
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1 5 10 15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Pro
35 40 45
Pro Lys Leu Leu Phe Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln His
85 90 95
Tyr Thr Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
<210> 168
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> HBsAg-aa113-135 (SEQ13-B)
<400> 168
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 169
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-S117A
<400> 169
Ser Ser Thr Thr Ala Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 170
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-T118A
<400> 170
Ser Ser Thr Thr Ser Ala Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 171
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-G119A
<400> 171
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Ala Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 172
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-P120A
<400> 172
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Ala Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 173
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-C121S
<400> 173
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Ser Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 174
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-K122A
<400> 174
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Ala Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 175
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-T123A
<400> 175
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Ala Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 176
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-C124S
<400> 176
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Ser Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 177
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-T125A
<400> 177
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Ala Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 178
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-T126A
<400> 178
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ala Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 179
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-P127A
<400> 179
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Ala Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 180
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-Q129A
<400> 180
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Ala Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 181
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-T131A
<400> 181
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Ala Ser Met Phe Pro
20
<210> 182
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> S13-S132A
<400> 182
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ala Met Phe Pro
20
<210> 183
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 183
atcaactacc gccacgggac catgcaagac ctgcac 36
<210> 184
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 184
ggtcccgtgg cggtagttga tgttcctgga agtaga 36
<210> 185
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 185
aactaccagc gcgggaccat gcaagacctg cacgat 36
<210> 186
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 186
catggtcccg cgctggtagt tgatgttcct ggaagt 36
<210> 187
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 187
accagcacgg caccatgcaa gacctgcacg attcct 36
<210> 188
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 188
cttgcatggt gccgtgctgg tagttgatgt tcctgg 36
<210> 189
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 189
cagcacggga gcatgcaaga cctgcacgat tcctgc 36
<210> 190
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 190
gtcttgcatg ctcccgtgct ggtagttgat gttcct 36
<210> 191
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 191
acgggaccat ccaagacctg cacgattcct gctcaa 36
<210> 192
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 192
gcaggtcttg gatggtcccg tgctggtagt tgatgt 36
<210> 193
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 193
gggaccatgc cggacctgca cgattcctgc tcaagg 36
<210> 194
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 194
gtgcaggtcc ggcatggtcc cgtgctggta gttgat 36
<210> 195
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 195
gggaccatgc gcgacctgca cgattcctgc tcaagg 36
<210> 196
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 196
gtgcaggtcg cgcatggtcc cgtgctggta gttgat 36
<210> 197
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 197
accatgcaag gcctgcacga ttcctgctca aggaac 36
<210> 198
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 198
atcgtgcagg ccttgcatgg tcccgtgctg gtagtt 36
<210> 199
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 199
tgcaagacct ccacgattcc tgctcaagga acctct 36
<210> 200
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 200
aggaatcgtg gaggtcttgc atggtcccgt gctggt 36
<210> 201
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 201
caagacctgc gcgattcctg ctcaaggaac ctctat 36
<210> 202
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 202
gcaggaatcg cgcaggtctt gcatggtccc gtgctg 36
<210> 203
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 203
gacctgcacg gctcctgctc aaggaacctc tatgtt 36
<210> 204
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 204
tgagcaggag ccgtgcaggt cttgcatggt cccgtg 36
<210> 205
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 205
ctgcacgatt gctgctcaag gaacctctat gtttcc 36
<210> 206
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 206
ccttgagcag caatcgtgca ggtcttgcat ggtccc 36
<210> 207
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 207
gattcctgct gcaggaacct ctatgtttcc ctcttg 36
<210> 208
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 208
gaggttcctg cagcaggaat cgtgcaggtc ttgcat 36
<210> 209
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 209
tgctcaagga gcctctatgt ttccctcttg ttgctg 36
<210> 210
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 210
aacatagagg ctccttgagc aggaatcgtg caggtc 36
<210> 211
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 211
tcaaggaacc gctatgtttc cctcttgttg ctgtac 36
<210> 212
<211> 36
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 引物
<400> 212
ggaaacatag cggttccttg agcaggaatc gtgcag 36
<210> 213
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13-A
<400> 213
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Asn Ser Met Phe Pro
20
<210> 214
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13-C
<400> 214
Thr Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ile Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 215
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13-D
<400> 215
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Tyr Pro
20
<210> 216
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13-E
<400> 216
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Leu Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 217
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13-F/H
<400> 217
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Leu Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 218
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13F1
<400> 218
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Ala Leu Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Phe Pro
20
<210> 219
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13F2
<400> 219
Ser Thr Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Arg Thr Cys Thr Thr Leu Ala
1 5 10 15
Gln Gly Thr Ser Met Leu Pro
20
<210> 220
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SEQ13-G
<400> 220
Ser Ser Thr Thr Ser Thr Gly Pro Cys Lys Thr Cys Thr Thr Pro Ala
1 5 10 15
Gln Gly Asn Ser Met Tyr Pro
20