特异性结合h1.4移码突变蛋白的单克隆抗体制备及其应用

文档序号：80651 发布日期：2021-10-08 浏览：26次 >En<

阅读说明：本技术 特异性结合h1.4移码突变蛋白的单克隆抗体制备及其应用 (Preparation and application of monoclonal antibody specifically binding H1.4 frameshift mutant protein ) 是由李国红俞洋包新华胡明丽王胜章清萍阮海荷于 2021-07-01 设计创作，主要内容包括：本发明公开了特异性结合H1.4移码突变蛋白的单克隆抗体制备及其应用。具体地公开了特异性结合H1.4移码突变蛋白的检测性抗体或其抗原结合部分,包含氨基酸序列是SEQ ID No.1的重链和氨基酸序列是SEQ ID No.2的轻链。本发明首次利用H1.4移码突变体多肽半抗原制备了针对H1.4移码突变蛋白的鼠单克隆抗体,并且制备的抗体可以与H1.4移码突变蛋白特异性结合,能快速、灵敏、准确地检测出H1.4移码突变,为H1.4移码突变导致自闭症机制发生的研究提供了必不可少的实验材料,为自闭症患者的诊断提供了检测基础,在自闭症的诊断或辅助诊断领域、相关疾病的靶向药物开发领域,具有广泛的应用前景和重要的意义。(The invention discloses preparation and application of a monoclonal antibody specifically bound with H1.4 frameshift mutant protein. Specifically disclosed is a detection antibody or antigen-binding portion thereof that specifically binds to a H1.4 frameshift mutein, comprising a heavy chain having the amino acid sequence SEQ ID No.1 and a light chain having the amino acid sequence SEQ ID No. 2. The invention prepares the mouse monoclonal antibody aiming at the H1.4 frameshift mutant protein by utilizing the H1.4 frameshift mutant polypeptide hapten for the first time, and the prepared antibody can be specifically combined with the H1.4 frameshift mutant protein, can quickly, sensitively and accurately detect the H1.4 frameshift mutation, provides an essential experimental material for the research of the generation of an autism mechanism caused by the H1.4 frameshift mutation, provides a detection basis for the diagnosis of an autism patient, and has wide application prospect and important significance in the field of the diagnosis or auxiliary diagnosis of autism and the development of targeted drugs of related diseases.)

特异性结合H1.4移码突变蛋白的单克隆抗体制备及其应用

技术领域

本发明属于生物

技术领域

，具体涉及特异性结合H1.4移码突变蛋白的单克隆抗体制备及其应用。

背景技术

染色质是真核生物遗传物质的载体。核小体是染色质的基本结构单位，由组蛋白和DNA构成。组蛋白是染色质的基本结构蛋白，分别为H1、H2A、H2B、H3、H4，其中H1是最早发现的组蛋白，其余4种为核心组蛋白。真核生物细胞内的DNA不是裸露存在的，而是缠绕在组蛋白八聚体(H2A、H2B、H3、H4各2个分子形成)构成的核心结构外侧形成的核小体连成的串珠结构，组蛋白H1不构成核小体，而是结合在核小体连接DNA的进出口端。核小体串珠结构在连接组蛋白H1的作用下进一步折叠形成30nm染色质结构，再逐级压缩形成染色体储存在细胞核中，H1介导的30nm染色质结构一直以来备受关注，作为染色体的基本结构蛋白，组蛋白H1在表观调控、基因转录、DNA复制、DNA损伤修复、染色体重塑等方面发挥重要作用。

组蛋白H1有多个变体。在人和小鼠中已经鉴定出了11种变体，包括七种体细胞亚型H1.0、H1.1、H1.2、H1.3、H1.4、H1.5、H1X，三种睾丸特异性亚型H1t、H1T2、HILS1和一种卵母细胞特异性亚型H1oo。连接组蛋白H1及其变体在不同生物学过程中行使不同的多功能。近年来文献报道连接组蛋白H1的变体H1.4的羧基端的移码突变会导致自闭症，患者同时表现为发际线高，早衰，智力缺陷等症状，然而这些突变体的致病机制并不清楚，对于此类突变造成的自闭症的治疗也没有特效药。鉴于H1.4是重要的染色质结构调控蛋白，因此从H1.4移码突变对染色质结构的影响入手，阐释H1.4可能的致病机制是十分必要的。但是目前国内外市场上均没有H1.4移码突变蛋白检测的抗体，大大限制了H1.4致病机制的研究以及患者的诊断，因此，探索和挖掘能够识别H1.4移码突变的特异性检测抗体在自闭症患者的诊断或辅助诊断领域，以及相关疾病的靶向药物开发领域，都具有广泛的应用前景和重要的意义。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是如何快速、灵敏、特异地检测H1.4移码突变蛋白以及如何诊断或辅助诊断H1.4移码突变蛋白相关疾病。所要解决的技术问题不限于如所描述的技术主题，本领域技术人员通过以下描述可以清楚地理解本文未提及的其它技术主题。

为解决上述技术问题，本发明首先提供了特异性结合H1.4移码突变蛋白的单克隆抗体或其抗原结合部分，所述单克隆抗体或其抗原结合部分包含重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区包含氨基酸序列分别是SEQ ID No.1的第45-52位、SEQ ID No.1的第70-77位和SEQ ID No.1的第116-125位的三个互补决定区；所述轻链可变区包含氨基酸序列分别是SEQ ID No.2的第46-56位、SEQ ID No.2的第74-76位和SEQ ID No.2的第113-121位的三个互补决定区。其中：

重链可变区CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No.1的第45-52位；

重链可变区CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No.1的第70-77位；

重链可变区CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No.1的第116-125位；

轻链可变区CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第46-56位；

轻链可变区CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第74-76位；

轻链可变区CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第113-121位。

其中所述抗原结合部分可为双特异性抗体、Fab抗体、Fv抗体、单链抗体(ScFv)、单域抗体或最小识别单位(MRU)。

进一步地，所述重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.14；所述轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.16。

所述重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID No.1的第20-136位；所述轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第20-131位。

进一步地，所述重链的氨基酸序列为SEQ ID No.1；所述轻链的氨基酸序列为SEQID No.2。

进一步地，所述重链可变区和轻链可变区均包含框架区，所述框架区可来源于小鼠。

进一步地，所述单克隆抗体可为鼠源单克隆抗体。

进一步地，所述单克隆抗体可为检测性抗体。

本发明还提供了多肽或所述多肽作为半抗原在制备特异性结合H1.4移码突变蛋白的检测抗体中的应用，所述多肽的氨基酸序列是SEQ ID No.3。

上述应用中，所述应用包括将所述半抗原与蛋白质载体偶联，得到的人工抗原在制备特异性结合H1.4移码突变蛋白的检测抗体中的应用。

所述蛋白质载体可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。

本发明还提供了生物材料，所述生物材料为下述B1)至B6)中的任一种：

B1)编码所述单克隆抗体或其抗原结合部分中的重链和/或轻链的核酸分子；

B2)含有B1)所述核酸分子的表达盒；

B3)含有B1)所述核酸分子的重组载体、或含有B2)所述表达盒的重组载体；

B4)含有B1)所述核酸分子的重组微生物、或含有B2)所述表达盒的重组微生物、或含有B3)所述重组载体的重组微生物；

B5)含有B1)所述核酸分子的细胞系、或含有B2)所述表达盒的细胞系、或含有B3)所述重组载体的细胞系；

B6)编码所述单克隆抗体或其抗原结合部分中的重链可变区和/或轻链可变区的核酸分子。

上述生物材料中，所述核酸分子为下述任一种：

C1)编码序列是SEQ ID No.4的重链DNA分子；

C2)编码序列是SEQ ID No.5的轻链DNA分子；

C3)编码序列是SEQ ID No.15的重链可变区DNA分子；

C4)编码序列是SEQ ID No.17的轻链可变区DNA分子；

C5)与C1)-C4)限定的核苷酸序列具有75％或75％以上同一性，且编码所述单克隆抗体或其抗原结合部分中的重链和/或轻链和/或重链可变区和/或轻链可变区DNA分子。

SEQ ID No.4所示的DNA分子编码SEQ ID No.1所示的重链；

SEQ ID No.5所示的DNA分子编码SEQ ID No.2所示的轻链；

SEQ ID No.15是SEQ ID No.4的58-408位的重链可变区DNA分子；

SEQ ID No.17是SEQ ID No.5的58-393位的轻链可变区DNA分子；

上述生物材料中，所述载体可为质粒、黏粒、噬菌体或病毒载体。

上述生物材料中，所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中，细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia)，欧文氏菌(Erwinia)，根癌农杆菌属(Agrobacterium)、黄杆菌属(Flavobacterium)，产碱菌属(Alcaligenes)，假单胞菌属(Pseudomonas)，芽胞杆菌属(Bacillus)等。

上述生物材料中，所述细胞可为哺乳动物细胞、昆虫细胞、酵母细胞或原核细胞。

本发明还提供了用于检测H1.4移码突变的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒含有所述单克隆抗体或其抗原结合部分。

所述试剂盒可为化学发光免疫试剂盒、酶联免疫检测试剂盒、胶体金免疫试剂盒、或荧光免疫试剂盒，但不限于此。

本发明还提供了所述单克隆抗体或其抗原结合部分和/或所述生物材料在制备诊断或辅助诊断H1.4移码突变蛋白相关疾病的产品中的应用。

上述应用中，所述H1.4移码突变蛋白相关疾病可为自闭症。

本文中，术语“双特异性抗体”是指将两套轻链、重链基因导入骨髓瘤细胞中，选择合适的抗体恒定区及Ig类型，可获得产量大、均一性和纯度高的双特异性抗体。另外，以化学交联技术或杂交-杂交瘤技术也可获得双特异性抗体。

术语“Fab抗体”是由重链Fd和完整轻链通过二硫键结合而成的异二聚体，仅含一个抗原结合位点。将重链Fd和完整轻链的编码基因连接，融合细菌蛋白信号肽基因后可在大肠杆菌内分泌表达Fab抗体，并有完整的立体折叠和链内、链间二硫键。所述重链Fd指Fab中约1/2的H链部分(约含225个氨基酸残基，包括V_H、C_H1和部分铰链区)。

术语“Fv抗体”是指可分别构建含有V_H和V_L基因的载体，共转染细胞，使之分别表达，再组装成功能性Fv抗体；也可在载体中的V_H和V_L之间设置终止密码，分别表达两个小分子蛋白片段，再通过非共价键结合而形成Fv抗体。

术语“单链抗体(ScFv)”是指用适当的寡核苷酸接头(linker)连接轻链和重链可变区基因，使之表达单一的多肽链，称为单链抗体(ScFv)。多肽链能自发折叠成天然构想，保持Fv的特异性和亲和力。

术语“单域抗体”是指将抗体重链V区通过基因工程方法表达，获得仅含V_H片段的抗体。单域抗体与抗原结合的能力及其稳定性，与完全抗体基本一致。

术语“最小识别单位(MRU)”是指仅含可变区中单一CDR结构，分子质量仅为完整抗体的1％左右，可结合相应抗原。

本发明首次利用H1.4移码突变体多肽半抗原制备了针对H1.4移码突变蛋白的鼠单克隆抗体，并且制备的抗体可以与H1.4移码突变蛋白特异性结合，从而可以快速、灵敏、准确的检测出H1.4移码突变蛋白，识别H1.4移码突变的效果出人预料地好。为H1.4移码突变导致自闭症机制发生的研究提供了必不可少的实验材料，为此类自闭症患者的诊断提供了检测基础，同时为疾病的靶向药物设计提供极大的可能，具有重要的应用价值。

附图说明

图1为Western Blot检测特异性结合H1.4移码突变蛋白的单克隆抗体(H1.4移码突变抗体)特异性。

图2为免疫荧光检测H1.4移码突变抗体的性质。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明进行进一步的详细描述，给出的实施例仅为了阐明本发明，而不是为了限制本发明的范围。以下提供的实施例可作为本技术领域普通技术人员进行进一步改进的指南，并不以任何方式构成对本发明的限制。

下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

实施例1特异性结合H1.4移码突变蛋白的单克隆抗体的制备

1、抗原的制备

(1)半抗原的制备

H1.4的移码突变体有H1.4 Ala123Gly fs*73、Lys136Ile fs*60、Lys137Glu fs*59、Lys140Glu fs*56、Ala144Gly fs*52、Thr146His fs*50、Lys157Glu fs*39，这些移码突变体最终都产生一段38个氨基酸的肽段，且此肽段在正常的细胞中不存在，本发明首次利用移码突变体的最后30个氨基酸的肽段(H1.4移码突变体多肽半抗原)制备了针对H1.4移码突变蛋白的鼠单克隆抗体，并且制备的抗体识别H1.4移码突变的效果出人预料地好。

H1.4移码突变体多肽半抗原氨基酸序列为：CWSQKSEKPEKGESSQAKKGAQEPSEGQSS(SEQ ID No.3)，半抗原多肽合成由武汉爱博泰克生物科技有限公司合成并进行纯化。

(2)人工抗原(免疫原)的制备

一般人工合成的简单半抗原分子，免疫原性比较低，只有与蛋白质载体偶联后，才可诱导出抗半抗原抗体。所述蛋白质载体可为牛血清白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白或血蓝蛋白中的任意一种。本实施例选用血蓝蛋白(Keyhole Limpet Hemocyanin，KLH)作为载体蛋白用于免疫偶联，牛血清白蛋白(Bovine Serum Albumin，BSA)用于筛选。具体操作步骤如下：

步骤(1)纯化后的半抗原多肽分别与血蓝蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)偶联，偶联反应按照美国Pierce公司的试剂盒(Imject Maleimide Activated ImmunogenConjugation Kit With mcKLH and BSA)操作说明书进行，偶联后即刻过柱纯化、分装。

按照上述步骤将半抗原多肽(SEQ ID No.3)分别与载体蛋白(KLH)和牛血清白蛋白(BSA)连接后得到半抗原多肽-KLH偶联复合物(用于免疫小鼠)和半抗原多肽-BSA偶联复合物(用于ELASA法检测小鼠血清抗体效价)。

2、抗体的制备

2-1免疫小鼠

免疫小鼠的品系为Balb/C小鼠，雌鼠或者雄鼠都可以，小鼠鼠龄为6-10周，体重20g左右，健康无病，使用免疫原(上述步骤1中(2)合成的半抗原多肽-KLH偶联复合物)联合佐剂(非完全弗氏试剂)免疫5只Balb/C小鼠。第一次免疫三周后进行第二次免疫，第二次免疫两周后进行加强免疫，三免之后对小鼠尾部静脉血清进行ELISA法检测抗体效价和內源样品蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)检测。若ELISA检测抗体效价达到1:50000以上、WB有目的条带则说明免疫合格，选择检测结果最好的1只小鼠取脾细胞进行细胞融合及筛选；若免疫不合格，可以进行加免后再次检测；

实验设置免疫组和对照组：

免疫组的免疫原为上述步骤1中(2)合成的半抗原多肽-KLH偶联复合物，免疫剂量为100μg/只小鼠，佐剂为非完全弗式佐剂，免疫5只小鼠；

对照组的免疫原为生理盐水，免疫剂量为100μg/只小鼠，佐剂为非完全弗式佐剂，免疫5只小鼠。

2-2ELISA法检测小鼠血清抗体效价

三免之后对小鼠尾部静脉血清进行ELISA法检测抗体效价。

通过间接ELISA法来检测血清中抗体的效价。

a)2个参照：阴性参照为预取血血清，均以一抗起始浓度稀释(封闭液稀释)；阳性参照为以前阳性血清或者细胞上清，或者直接将一抗作为抗原包埋。

b)于96孔板中加入每孔50μL，即100ng的抗原。边沿孔应尽量避免使用，会降低吸光值影响结果。于4℃过夜，时间紧急也可37℃孵育2小时。

c)倒去抗原，每孔加入100μL封闭液。如果载体蛋白是BSA，则用1％的脱脂奶粉代替BSA。4℃过夜或者37℃孵育2小时。

d)倒去封闭液，在吸水纸上拍打尽量吸干残留液体，用洗涤液(0.1M KPi,0.05％Tween-20,pH7)洗板3次，每次都尽量拍干(吸水纸)残留液体，若要放置一段时间，尽量风干板子，或30℃烘干并用封口袋封好于4℃保存。

e)加入每孔50μL的一抗，如果是杂交瘤细胞，则一抗就是细胞上清，如果是免疫动物的血清，则需要进行一系列的稀释(封闭液稀释)，通常起始稀释度为1：499，往后2倍的稀释下去。37℃孵育1小时。

f)洗板3次，同上。

g)加入每孔50μL的1：2000稀释(封闭液稀释)的HRP标记的二抗，37℃孵育45min。

h)洗板3次，同上。

i)加入每孔100μL的TMB底物(必须现配)，室温孵育5-20分钟(根据颜色的改变速度)。

j)加入每孔100μL的终止液(0.5M草酸)。

k)在酶标仪上读取450nm的吸光度。

ELISA法检测抗体的效价结果如表1所示：

表1 ELISA法检测抗体效价

ELISA筛选原：CWSQKSEKPEKGESSQAKKGAQEPSEGQSS+BSA(多肽与BSA形成的偶联物，其中多肽的氨基酸序列为CWSQKSEKPEKGESSQAKKGAQEPSEGQSS)；

包被浓度：1μg/mL，100μL/孔；

二抗：Peroxidase-conjugated AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG(H+L)[Jackson ImmunoResearch,115-035-003]

二抗稀释比：1:10000

如表1所示，M02小鼠免疫产生的抗体效价最高，抗体效价为0.970。

2-3內源样品蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)鉴定

N端带有Flag标签的H1.4 K157E移码突变体，都在pFLAG-CMV载体上，用pFLAG-CMV-H1.4 K157E fs*的重组质粒转染NIH 3T3细胞(3×10⁶)，36小时后收取细胞。所述内源样品为在小鼠NIH 3T3细胞中过表达pFLAG-CMV-H1.4 K157E fs*的质粒，得到的flag-H1.4K157E蛋白。

(1)用200μL Lysis buffer(10mM Tris,1mM EDTA,1％SDS)裂解细胞。

(2)水浴超声至样品不粘稠，经十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺凝胶分离蛋白。

(3)将变性胶上的样品转移至尼龙膜上。

(4)室温，牛奶封闭1小时，TBST洗三次。

(5)尼龙膜用H1.4移码突变的一抗，4℃，孵育过夜

(6)回收一抗，尼龙膜用TBST洗三次。

(7)相应二抗室温孵育1小时,TBST洗三次。

(8)尼龙膜与发光底物孵育3min,显影。

WB实验结果在25kDa处出现明显的条带，表明免疫后小鼠体内产生了能特异性结合H1.4移码突变蛋白的抗体。

2-4细胞融合及单抗筛选

选择1只免疫合格的小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞(SP2/0)进行融合，制备杂交瘤，融合后的细胞铺板数为10块96孔细胞板，培养7-10天后，使用筛选原(ELISA的筛选原为抗原，WB的筛选原为体外纯化的H1.4 K157E移码突变体)进行融合上清(杂交瘤的培养上清液)的ELISA检测和WB内源验证，根据检测结果，通过有限稀释法进行亚克隆。

每个融合筛选1-20个阳性单克隆进行后续亚克隆，根据实验情况进行两次或三次亚克隆，最后筛选1-3个阳性单克隆进行细胞定株；

获得能分泌特异性结合H1.4移码突变蛋白的单克隆抗体的一株杂交瘤细胞株，命名为A1。

将获得的杂交瘤细胞株A1注射BALB/c鼠腹腔，细胞浓度为3×10⁵个细胞/只。5-10天后收集含有单克隆抗体的腹水。使用Protein G-Sepharose4B吸附层析柱纯化腹水中的抗体得到特异性结合H1.4移码突变蛋白的单克隆抗体。

2-5单克隆抗体的序列确定

委托武汉爱博泰克生物科技有限公司测序纯化的单克隆抗体，在Sanger测序获得核酸序列的基础上，利用三联密码子编码一个氨基酸的规则，获得对应氨基酸序列。

最终确定特异性结合H1.4移码突变蛋白的单克隆抗体的重链的氨基酸序列为SEQID No.1，重链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.4；轻链的氨基酸序列为SEQ ID No.2，轻链基因的核苷酸序列为SEQ ID No.5。其中：

重链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.14；

重链可变区的氨基酸序列是SEQ ID No.1的第20-136位；

轻链可变区的氨基酸序列为SEQ ID No.16；

轻链可变区的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第20-131位；

重链可变区基因的核苷酸序列为SEQ ID No.15；

重链可变区基因的核苷酸序列是SEQ ID No.4的第58-408位；

轻链可变区基因的核苷酸序列为SEQ ID No.17；

轻链可变区基因的核苷酸序列是SEQ ID No.5的第58-393位；

重链可变区CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No.1的第45-52位；

重链可变区CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No.1的第70-77位；

重链可变区CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No.1的第116-125位；

轻链可变区CDR1的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第46-56位；

轻链可变区CDR2的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第74-76位；

轻链可变区CDR3的氨基酸序列是SEQ ID No.2的第113-121位。

2-6基因工程方法制备抗体

1.将抗体的轻重链序列克隆到真核细胞的表达载体上；

2.用克隆好的载体转染真核细胞，转然后48小时收集培养基；

3.收集培养基后离心，留上清，使用Protein G-Sepharose4B吸附层析柱纯化抗体。

实施例2蛋白质免疫印迹(Western Blot，WB)检测抗体特异性

1、样品制备

制备下述样品用来检测单克隆抗体的特异性：

体外纯化的组蛋白H1.4(WT H1.4)

体外纯化的H1.4移码突变蛋白(H1.4 K157E fs*)

内源过表达的组蛋白H1.4(WT H1.4)

内源过表达的H1.4移码突变蛋白(H1.4 K157E fs*)

1-1组蛋白H1.4和H1.4移码突变蛋白的纯化

1)将pET-28a-WT H1.4、pET-28a-H1.4 K157E重组载体分别导入大肠杆菌BL21(DE3)中，得到含有重组载体的菌株。

重组载体pET-28a-WT H1.4是将pET-28a(+)载体的Nco I和Xhol I识别位点间的片段替换为序列表中SEQ ID No.6的第7-665位所示的DNA片段，保持pET-28a(+)载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。其中，SEQ ID No.6的第9-665位是组蛋白H1.4基因(野生型)的核苷酸序列。pET-28a-WT H1.4含有编码序列是SEQ ID No.6的融合基因，能表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.8的融合蛋白，SEQ ID No.8的第3-221位是组蛋白H1.4(野生型)的氨基酸。

重组载体pET-28a-H1.4 K157E是将pET-28a(+)载体的Nco I和Xhol I识别位点间的片段替换为序列表中SEQ ID No.7的第7-590位所示的DNA片段，保持pET-28a(+)载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。其中，SEQ ID No.7的第9-590位是移码突变体Lys157Glu fs*39的核苷酸序列。pET-28a-H1.4K157E含有编码序列是SEQ ID No.7的融合基因，能表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.9的融合蛋白，SEQ ID No.9的第3-196位是移码突变体Lys157Glu fs*39的氨基酸。

2)挑取单克隆接种到100mL LB液体培养基中，37℃，220rpm，培养12小时。

3)将菌液按照1：50分别接种到6个750mL的LB液体培养基中扩大培养(37℃，220rpm),培养至OD＝0.6时，加入IPTG(终浓度为0.5mM)诱导4小时。

4)将菌液离心，弃上清，用100mL PBS重悬菌液并离心(4℃，4000rpm,30min),弃上清。

5)破菌，加入100mL的Lysis Buffer(50mM Tris,pH 7.5，100mM NaCl，1mM EDTA)，充分重悬菌沉后进行超声，超声5s停8s，功率200W。

6)超声结束后，4℃，18,000rpm，离心20min，弃上清。

7)加入30mL Unfolding Buffer(1M NaCl，50mM Tris-HCl，pH 7.5，5mM β-Me)溶解沉淀中的H1.4，室温搅拌2小时。

8)18,000rpm，4℃，离心30min，将上清转移到干净的烧杯中。

9)使用HiTrap Heparin HP柱来纯化H1.4，低盐Buffer A(50mM Tris，pH 7.5，500mM NaCl)进行挂柱，混合低盐Buffer A和高盐Buffer B(50mM Tris，2M NaCl，pH 8.0)形成不同的盐浓度对蛋白进行洗脱，收集洗脱液，SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化结果。

10)使用羟基磷灰石柱子去除蛋白中的核酸，低盐Buffer A(200mM K2HPO4，KH2PO4，pH 6.8)进行挂柱，混合低盐Buffer A和高盐Buffer B(1M K2HPO4，KH2PO4，pH6.8)形成不同的盐浓度对蛋白进行洗脱，收集洗脱液，SDS-PAGE凝胶电泳检测纯化结果。

11)收集目的蛋白并将其透析到BC100 Buffer(100mM NaCl，20mM Tris，pH 8.0，20％Glycerol)中，最后将蛋白分装，保存于-80℃。

最终得到体外纯化的组蛋白H1.4(WT H1.4)和H1.4移码突变蛋白(H1.4K157Efs*)。

1-2组蛋白H1.4和H1.4移码突变蛋白的过表达

1)将pFLAG-CMV-WT H1.4、pFLAG-CMV-H1.4 K157E fs*重组质粒4ug转染NIH 3T3细胞，36小时后收取细胞。

其中，重组载体pFLAG-CMV-WT H1.4是将pFLAG-CMV载体的EcoRI和BamHI识别位点间的片段替换为序列表中SEQ ID No.10的第88-747位所示的DNA片段，保持CMV-flag载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。其中，SEQ ID No.10的第88-747位是组蛋白H1.4基因(野生型)的核苷酸序列。pFLAG-CMV-WT H1.4含有编码序列是SEQ ID No.10的融合基因，能表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.12的融合蛋白，SEQ ID No.12的第30-248位是组蛋白H1.4(野生型)的氨基酸。

重组载体pFLAG-CMV-H1.4 K157E fs*是将pFLAG-CMV载体的EcoRI和BamHI识别位点间的片段替换为序列表中SEQ ID No.11的第88-672位所示的DNA片段，保持pFLAG-CMV载体的其他序列不变，得到的重组表达载体。其中，SEQ ID No.11的第88-672位是H1.4移码突变蛋白(H1.4 K157E fs*)的核苷酸序列。pFLAG-CMV-H1.4 K157E fs*含有编码序列是SEQID No.11的融合基因，能表达氨基酸序列是序列表中SEQ ID No.13的融合蛋白，SEQ IDNo.13的第30-223位是H1.4移码突变蛋白(H1.4 K157E fs*)的氨基酸。

2)200μL Lysis buffer(10mM Tris,1mM EDTA,1％SDS)裂解细胞。

最终得到内源过表达的组蛋白H1.4(WT H1.4)和H1.4移码突变蛋白(H1.4 K157Efs*)。

2、特异性检测

1)取步骤1-1体外纯化的组蛋白H1.4(WT H1.4)以及H1.4移码突变蛋白(H1.4K157E fs*)各100ng，取步骤1-2内源过表达的组蛋白H1.4(WT H1.4)以及H1.4移码突变蛋白(H1.4 K157E fs*)的细胞裂解液的总蛋白量50μg进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳。

2)将凝胶胶上的样品转移至尼龙膜上。

3)室温，牛奶封闭1小时，TBST洗三次。

4)尼龙膜用H1.4移码突变的抗体(即本发明特异性结合H1.4移码突变蛋白的单克隆抗体)，4℃，孵育过夜。

5)回收一抗，尼龙膜用TBST洗三次。

6)尼龙膜用山羊抗鼠二抗室温孵育1小时,TBST洗三次。

7)尼龙膜与发光底物孵育3min,显影。

抗体检测结果如图1：无论体外纯化的还是在细胞内过表达的H1.4 K157E fs*移码突变体，抗体都能很好的识别，然而，对于体外纯化或者细胞内过表达的野生型H1.4，抗体均不能识别，说明本发明特异性结合H1.4移码突变蛋白的单克隆抗体只能识别H1.4移码突变蛋白，说明H1.4移码突变的抗体特异性非常好。

实施例3免疫荧光检测单克隆抗体

实施例1所制备的抗体进行小鼠脑片的免疫荧光染色。实验中观察了H1.4K157E移码突变的小鼠脑组织切片中H1.4 K157E突变体的分布，小鼠脑片制备及免疫荧光染色的步骤如下：

1)将小鼠麻醉后，用PBS对小鼠进行心脏灌流，冲走小鼠脑组织中的血液。

2)用4％的多聚甲醛进行心脏灌流，待小鼠固定好后，小心取出小鼠的脑组织，并浸于4％的多聚甲醛中48小时以上。

3)将脑组织置于20％的蔗糖中，沉糖，72小时以上，主要是为了去除组织中的水分。

4)将脑组织置于30％的蔗糖中进一步沉糖，72小时以上。

5)用组织包埋液对脑组织进行包埋，包埋的样品置于-20℃，至少48小时。

6)用冷冻切片机(Leica CM1950)获取脑组织的矢状切面，并使其贴附于载玻片上，此时能明显的看到脑组织中的海马神经元，将玻片置于-80℃保存。

7)用PBS将玻片洗涤三次，去除样品附近的包埋液。

8)将玻片置于柠檬酸缓冲液(9mM柠檬酸钠+1mM柠檬酸)中，然后，将样品放入微波炉中，高火4min煮沸缓冲液，换至低火加热4min，重复低火加热两次，室温冷却。在加热的过程中，需及时补充柠檬酸缓冲液，不可使缓冲液的液面低于组织，否则会引起脱片。

9)PBS洗三次，用含有1％Triton X-100的PBS对细胞进行透化，室温30min。

10)PBS洗涤三次，5％的BSA封闭样品，室温1小时。

11)PBS洗涤三次，样品用H1.4移码突变的鼠抗以及核仁素抗体(Anti-Nucleolin：ab129200)，4℃，孵育过夜。

12)PBS洗涤三次，样品用相应的荧光二抗(Alex488抗鼠IgG，Genecopoeia,L109A、Alex494抗兔IgG，Genecopoeia,L120A)室温孵育1小时。

13)PBS洗涤三次，加入抗淬灭剂，封片，用荧光显微镜观察结果。

14)结果显示H1.4 K157E fs*定位于细胞核中，且在核仁区域富集(图2)。

以上对本发明进行了详述。对于本领域技术人员来说，在不脱离本发明的宗旨和范围，以及无需进行不必要的实验情况下，可在等同参数、浓度和条件下，在较宽范围内实施本发明。虽然本发明给出了特殊的实施例，应该理解为，可以对本发明作进一步的改进。总之，按本发明的原理，本申请欲包括任何变更、用途或对本发明的改进，包括脱离了本申请中已公开范围，而用本领域已知的常规技术进行的改变。按以下附带的权利要求的范围，可以进行一些基本特征的应用。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院生物物理研究所

北京大学第一医院

<120> 特异性结合H1.4移码突变蛋白的单克隆抗体制备及其应用

<160> 17

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 460

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 1

Met Gly Trp Val Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser

1 5 10 15

Ile Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Asp Tyr Ser Met Gln Trp Met Lys Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Lys Trp Met Gly Trp Ile Asp Thr Gly Thr Gly Glu Pro Ser Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Leu Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Ser Tyr Gly Tyr Phe Ala Phe Trp Gly Gln

115 120 125

Gly Thr Leu Val Ala Val Ser Ala Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val

130 135 140

Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Ser Ala Ala Gln Thr Asn Ser Met Val Thr

145 150 155 160

Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr

165 170 175

Trp Asn Ser Gly Ser Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val

180 185 190

Leu Gln Ser Asp Leu Tyr Thr Leu Ser Ser Ser Val Thr Val Pro Ser

195 200 205

Ser Thr Trp Pro Ser Glu Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala

210 215 220

Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Val Pro Arg Asp Cys Gly Cys

225 230 235 240

Lys Pro Cys Ile Cys Thr Val Pro Glu Val Ser Ser Val Phe Ile Phe

245 250 255

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Val Leu Thr Ile Thr Leu Thr Pro Lys Val

260 265 270

Thr Cys Val Val Val Asp Ile Ser Lys Asp Asp Pro Glu Val Gln Phe

275 280 285

Ser Trp Phe Val Asp Asp Val Glu Val His Thr Ala Gln Thr Gln Pro

290 295 300

Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Phe Arg Ser Val Ser Glu Leu Pro

305 310 315 320

Ile Met His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Phe Lys Cys Arg Val

325 330 335

Asn Ser Ala Ala Phe Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Thr

340 345 350

Lys Gly Arg Pro Lys Ala Pro Gln Val Tyr Thr Ile Pro Pro Pro Lys

355 360 365

Glu Gln Met Ala Lys Asp Lys Val Ser Leu Thr Cys Met Ile Thr Asp

370 375 380

Phe Phe Pro Glu Asp Ile Thr Val Glu Trp Gln Trp Asn Gly Gln Pro

385 390 395 400

Ala Glu Asn Tyr Lys Asn Thr Gln Pro Ile Met Asp Thr Asp Gly Ser

405 410 415

Tyr Phe Val Tyr Ser Lys Leu Asn Val Gln Lys Ser Asn Trp Glu Ala

420 425 430

Gly Asn Thr Phe Thr Cys Ser Val Leu His Glu Gly Leu His Asn His

435 440 445

His Thr Glu Lys Ser Leu Ser His Ser Pro Gly Lys

450 455 460

<210> 2

<211> 238

<212> PRT

<213> Mus musculus

<400> 2

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Asn Ile

35 40 45

Val His Val Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp Tyr Leu Gln Lys Pro

50 55 60

Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val Ser Asn Arg Phe Ser

65 70 75 80

Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr

85 90 95

Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys

100 105 110

Phe Gln Gly Ser His Val Pro Phe Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu

115 120 125

Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Gln Leu Thr Ser Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Phe Leu

145 150 155 160

Asn Asn Phe Tyr Pro Lys Asp Ile Asn Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly

165 170 175

Ser Glu Arg Gln Asn Gly Val Leu Asn Ser Trp Thr Asp Gln Asp Ser

180 185 190

Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Thr Leu Thr Lys Asp

195 200 205

Glu Tyr Glu Arg His Asn Ser Tyr Thr Cys Glu Ala Thr His Lys Thr

210 215 220

Ser Thr Ser Pro Ile Val Lys Ser Phe Asn Arg Asn Glu Cys

225 230 235

<210> 3

<211> 30

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 3

Cys Trp Ser Gln Lys Ser Glu Lys Pro Glu Lys Gly Glu Ser Ser Gln

1 5 10 15

Ala Lys Lys Gly Ala Gln Glu Pro Ser Glu Gly Gln Ser Ser

20 25 30

<210> 4

<211> 1383

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 4

atgggttggg tgtggaactt gctattcctg atggcagctg cccaaagtat ccaagcacag 60

atccagttgg tgcagtctgg acctgaactg aagaagcctg gagagacagt caagatctcc 120

tgcaaggctt ctggttacac cttcacagac tattcaatgc agtggatgaa gcaggctcca 180

ggaaagggtt taaagtggat gggctggata gacactggga ctggtgagcc atcatatgca 240

gatgacttca agggacggtt tgccttctct ttggaaacct ctgccagcac tgcctatttg 300

cagatcaaca acctcaaaaa tgaggacacg gctacatatt tctgtgctag acgctcctat 360

ggttattttg ctttctgggg ccaagggact ctggtcgctg tctctgcagc caaaacgaca 420

cccccatctg tctatccact ggcccctgga tctgctgccc aaactaactc catggtgacc 480

ctgggatgcc tggtcaaggg ctatttccct gagccagtga cagtgacctg gaactctgga 540

tccctgtcca gcggtgtgca caccttccca gctgtcctgc agtctgacct ctacactctg 600

agcagctcag tgactgtccc ctccagcacc tggcccagcg agaccgtcac ctgcaacgtt 660

gcccacccgg ccagcagcac caaggtggac aagaaaattg tgcccaggga ttgtggttgt 720

aagccttgca tatgtacagt cccagaagta tcatctgtct tcatcttccc cccaaagccc 780

aaggatgtgc tcaccattac tctgactcct aaggtcacgt gtgttgtggt agacatcagc 840

aaggatgatc ccgaggtcca gttcagctgg tttgtagatg atgtggaggt gcacacagct 900

cagacgcaac cccgggagga gcagttcaac agcactttcc gctcagtcag tgaacttccc 960

atcatgcacc aggactggct caatggcaag gagttcaaat gcagggtcaa cagtgcagct 1020

ttccctgccc ccatcgagaa aaccatctcc aaaaccaaag gcagaccgaa ggctccacag 1080

gtgtacacca ttccacctcc caaggagcag atggccaagg ataaagtcag tctgacctgc 1140

atgataacag acttcttccc tgaagacatt actgtggagt ggcagtggaa tgggcagcca 1200

gcggagaact acaagaacac tcagcccatc atggacacag atggctctta cttcgtctac 1260

agcaagctca atgtgcagaa gagcaactgg gaggcaggaa atactttcac ctgctctgtg 1320

ttacatgagg gcctgcacaa ccaccatact gagaagagcc tctcccactc tcctggtaaa 1380

taa 1383

<210> 5

<211> 717

<212> DNA

<213> Mus musculus

<400> 5

atgggctggt cctgtatcat cctgttcctg gtggctacag ccacaggagt gcatagtgat 60

gttgtgatga cccaaactcc actctccctg cctgtcagtc ttggagatca agcctccatc 120

tcttgcagat ctagtcagaa cattgtacat gttaatggaa atacctattt agaatggtac 180

ttgcagaaac caggccagtc tccaaagctc ctgatctaca aagtttccaa ccgattttct 240

ggggtcccag acaggttcag tggcagtgga tcagggacag aattcacact caagatcagc 300

agagtggagg ctgaggatct gggagtttat tattgctttc aaggttcaca tgttcctttc 360

acgttcggtg ctgggaccaa gctggagctg aaacgggctg atgctgcacc aactgtatcc 420

atcttcccac catccagtga gcagttaaca tctggaggtg cctcagtcgt gtgcttcttg 480

aacaacttct accccaaaga catcaatgtc aagtggaaga ttgatggcag tgaacgacaa 540

aatggcgtcc tgaacagttg gactgatcag gacagcaaag acagcaccta cagcatgagc 600

agcaccctca cgttgaccaa ggacgagtat gaacgacata acagctatac ctgtgaggcc 660

actcacaaga catcaacttc acccattgtc aagagcttca acaggaatga gtgttaa 717

<210> 6

<211> 692

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 6

ccatgggcat gtccgagact gcgcctgccg cgcccgctgc tccggcccct gccgagaaga 60

ctcccgtgaa gaagaaggcc cgcaagtctg caggtgcggc caagcgcaaa gcgtctgggc 120

ccccggtgtc cgagctcatt actaaagctg ttgccgcctc caaggagcgc agcggcgtat 180

ctttggccgc tctcaagaaa gcgctggcag ccgctggcta tgacgtggag aagaacaaca 240

gccgcatcaa gctgggtctc aagagcctgg tgagcaaggg caccctggtg cagaccaagg 300

gcaccggcgc gtcgggttcc ttcaaactca acaagaaggc ggcctctggg gaagccaagc 360

ctaaggctaa aaaggcaggc gcggccaagg ccaagaagcc agcaggagcg gcgaagaagc 420

ccaagaaggc gacgggggcg gccaccccca agaagagcgc caagaagacc ccaaagaagg 480

cgaagaagcc ggctgcagct gctggagcca aaaaagcgaa aagcccgaaa aaggcgaaag 540

cagccaagcc aaaaaaggcg cccaagagcc cagcgaaggc caaagcagtt aaacccaagg 600

cggctaaacc aaagaccgcc aagcccaagg cagccaagcc aaagaaggcg gcagccaaga 660

aaaagctcga gcaccaccac caccaccact ga 692

<210> 7

<211> 617

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 7

ccatgggcat gtccgagact gcgcctgccg cgcccgctgc tccggcccct gccgagaaga 60

ctcccgtgaa gaagaaggcc cgcaagtctg caggtgcggc caagcgcaaa gcgtctgggc 120

ccccggtgtc cgagctcatt actaaagctg ttgccgcctc caaggagcgc agcggcgtat 180

ctttggccgc tctcaagaaa gcgctggcag ccgctggcta tgacgtggag aagaacaaca 240

gccgcatcaa gctgggtctc aagagcctgg tgagcaaggg caccctggtg cagaccaagg 300

gcaccggcgc gtcgggttcc ttcaaactca acaagaaggc ggcctctggg gaagccaagc 360

ctaaggctaa aaaggcaggc gcggccaagg ccaagaagcc agcaggagcg gcgaagaagc 420

ccaagaaggc gacgggggcg gccaccccca agaagagcgc caagaagacc cccaaagaag 480

gcgaagaagc cggctgcagc tgctggagcc aaaaaagcga aaagcccgaa aaaggcgaaa 540

gcagccaagc caaaaaaggc gcccaagagc ccagcgaagg ccaaagcagt ctcgagcacc 600

accaccacca ccactga 617

<210> 8

<211> 229

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 8

Met Gly Met Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro

1 5 10 15

Ala Glu Lys Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Arg Lys Ser Ala Gly Ala

20 25 30

Ala Lys Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys

35 40 45

Ala Val Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu

50 55 60

Lys Lys Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser

65 70 75 80

Arg Ile Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val

85 90 95

Gln Thr Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys

100 105 110

Ala Ala Ser Gly Glu Ala Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala

115 120 125

Lys Ala Lys Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Ala Thr

130 135 140

Gly Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ala Lys Lys Thr Pro Lys Lys Ala

145 150 155 160

Lys Lys Pro Ala Ala Ala Ala Gly Ala Lys Lys Ala Lys Ser Pro Lys

165 170 175

Lys Ala Lys Ala Ala Lys Pro Lys Lys Ala Pro Lys Ser Pro Ala Lys

180 185 190

Ala Lys Ala Val Lys Pro Lys Ala Ala Lys Pro Lys Thr Ala Lys Pro

195 200 205

Lys Ala Ala Lys Pro Lys Lys Ala Ala Ala Lys Lys Lys Leu Glu His

210 215 220

His His His His His

225

<210> 9

<211> 204

<212> PRT

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 9

Met Gly Met Ser Glu Thr Ala Pro Ala Ala Pro Ala Ala Pro Ala Pro

1 5 10 15

Ala Glu Lys Thr Pro Val Lys Lys Lys Ala Arg Lys Ser Ala Gly Ala

20 25 30

Ala Lys Arg Lys Ala Ser Gly Pro Pro Val Ser Glu Leu Ile Thr Lys

35 40 45

Ala Val Ala Ala Ser Lys Glu Arg Ser Gly Val Ser Leu Ala Ala Leu

50 55 60

Lys Lys Ala Leu Ala Ala Ala Gly Tyr Asp Val Glu Lys Asn Asn Ser

65 70 75 80

Arg Ile Lys Leu Gly Leu Lys Ser Leu Val Ser Lys Gly Thr Leu Val

85 90 95

Gln Thr Lys Gly Thr Gly Ala Ser Gly Ser Phe Lys Leu Asn Lys Lys

100 105 110

Ala Ala Ser Gly Glu Ala Lys Pro Lys Ala Lys Lys Ala Gly Ala Ala

115 120 125

Lys Ala Lys Lys Pro Ala Gly Ala Ala Lys Lys Pro Lys Lys Ala Thr

130 135 140

Gly Ala Ala Thr Pro Lys Lys Ser Ala Lys Lys Thr Pro Lys Glu Gly

145 150 155 160

Glu Glu Ala Gly Cys Ser Cys Trp Ser Gln Lys Ser Glu Lys Pro Glu

165 170 175

Lys Gly Glu Ser Ser Gln Ala Lys Lys Gly Ala Gln Glu Pro Ser Glu

180 185 190

Gly Gln Ser Ser Leu Glu His His His His His His

195 200

<210> 10

<211> 753

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 10

atgtctgcac ttctgatcct agctcttgtt ggagctgcag ttgctgacta caaagacgat 60

gacgacaagc ttgcggccgc gaattcaatg tccgagactg cgcctgccgc gcccgctgct 120

ccggcccctg ccgagaagac tcccgtgaag aagaaggccc gcaagtctgc aggtgcggcc 180

aagcgcaaag cgtctgggcc cccggtgtcc gagctcatta ctaaagctgt tgccgcctcc 240

aaggagcgca gcggcgtatc tttggccgct ctcaagaaag cgctggcagc cgctggctat 300

gacgtggaga agaacaacag ccgcatcaag ctgggtctca agagcctggt gagcaagggc 360

accctggtgc agaccaaggg caccggcgcg tcgggttcct tcaaactcaa caagaaggcg 420

gcctctgggg aagccaagcc taaggctaaa aaggcaggcg cggccaaggc caagaagcca 480

gcaggagcgg cgaagaagcc caagaaggcg acgggggcgg ccacccccaa gaagagcgcc 540

aagaagaccc caaagaaggc gaagaagccg gctgcagctg ctggagccaa aaaagcgaaa 600

agcccgaaaa aggcgaaagc agccaagcca aaaaaggcgc ccaagagccc agcgaaggcc 660

aaagcagtta aacccaaggc ggctaaacca aagaccgcca agcccaaggc agccaagcca 720

aagaaggcgg cagccaagaa aaagtaggga tcc 753

<210> 11

<211> 678

<212> DNA

<213> 人工序列（Artificial sequence）

<400> 11