一组反复妊娠丢失疾病诊疗免疫标志物及应用
阅读说明：本技术 一组反复妊娠丢失疾病诊疗免疫标志物及应用 (Diagnosis and treatment immune marker for recurrent pregnancy loss diseases and application thereof ) 是由 廖爱华 黄晓博 刘红 蔺新秀 尹芝南 于 2020-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物医学检测技术领域,尤其涉及一组反复妊娠丢失疾病诊疗免疫标志物及应用。免疫标志物包括：初始CD4～+T细胞、中心记忆CD4～+T细胞、效应记忆CD4～+T细胞、终末分化CD4～+T细胞、Treg细胞、外周辅助T细胞、中心CD8～+T细胞、终末分化CD8～+T细胞、非活跃期特异性的终末分化CD8～+T细胞、耗竭型CD8～+T细胞、T NK细胞、成熟NK细胞、未成熟NK细胞、未成熟NK/成熟NK比值、γδT细胞中的至少一种。这15种与反复妊娠丢失有关的免疫细胞亚型提示反复妊娠丢失妇女免疫系统处于免疫耐受不足的状态,从而不能够容受携带父系抗原的胎儿导致流产的发生。(The invention belongs to the technical field of biomedical detection, and particularly relates to a group of diagnosis and treatment immune markers for diseases caused by repeated pregnancy loss and application thereof. The immune markers include: initial CD4 + T cell, central memory CD4 + T cell, effector memory CD4 + T cell, terminally differentiated CD4 + T cells, Treg cells, peripheral helper T cells, central CD8 + T cell, terminally differentiated CD8 + T-cell, non-active phase specific terminally differentiated CD8 + T cell, depleted CD8 + At least one of T cells, T NK cells, mature NK cells, immature NK/mature NK ratio, γ δ T cells. These 15 subtypes of immune cells associated with recurrent pregnancy loss suggest that the immune system of women with recurrent pregnancy loss is under-tolerated and therefore unable to tolerate foetuses carrying paternal antigens leading to the development of miscarriage.)
技术领域
本发明属于生物医学检测技术领域，尤其涉及一组反复妊娠丢失疾病诊疗免疫标志物及应用。
背景技术
反复妊娠丢失是指在妊娠20周之前连续发生2次或2次以上的妊娠丢失，其在育龄期女性的发病率为1％～5％，该类患者再次妊娠发生流产的风险随着流产次数的增加而增加。其病因主要包括染色体异常、解剖结构异常、内分泌因素、自身免疫因素、易栓症、感染及环境、心理等因素。而困扰临床医生和患者的是：约50％的妇女在排除以上已知原因后仍找不到导致反复妊娠丢失的原因，其又称为不明原因反复妊娠丢失。目前越来越多的研究表明母体免疫失衡可能是不明原因反复妊娠丢失的主要原因，约占60％以上。
在月经周期及妊娠期，免疫细胞(NK细胞、T细胞及γδT细胞)随着激素水平的变化而发生动态变化。已有研究表明母体外周血中单一免疫细胞或者某一类免疫细胞亚群数量和(或)功能的异常与反复妊娠丢失的发生密切相关，但缺乏对母体多种免疫细胞亚群同时进行系统地、精准地检测和筛选。因此，缺乏对母体整体免疫细胞亚群数量及功能的评价。
目前对于不明原因反复妊娠丢失患者的检查主要包括基本的体格检查、超声检查及有创的子宫内膜病理检查，其不能评估母体的免疫状态，且缺乏特异的免疫标志物。尽管如此，反复妊娠丢失患者仍然有强烈的免疫指标检测或监测免疫治疗效果指标评估的愿望。
发明内容
针对现有技术存在的问题，本发明提供了一组反复妊娠丢失疾病诊疗免疫标志物及应用，目的在于解决现有技术中的一部分问题或至少缓解现有技术中的一部分问题。
本发明主要是采用多参数流式细胞术同时检测非妊娠妇女、已生育妇女和反复妊娠丢失妇女(每组各50例)外周血中63种免疫细胞亚型，通过多组非配对t检验，筛选未生育妇女组与反复妊娠丢失组、已生育妇女组与反复妊娠丢失组同时有差异的免疫指标为反复妊娠丢失相关的免疫细胞亚型。
本发明是这样实现的，一组反复妊娠丢失疾病诊疗免疫标志物，所述标志物包括初始CD4+T细胞、中心记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞、终末分化CD4+T细胞、Treg细胞、外周辅助T细胞、中心记忆CD8+T细胞、终末分化CD8+T细胞、非活跃期特异性的终末分化CD8+T细胞、耗竭型CD8+T细胞、T NK细胞、成熟NK细胞、未成熟NK细胞、未成熟NK/成熟NK比值、γδT细胞中的至少一种。
本发明还披露了如上述的一组反复妊娠丢失疾病诊疗免疫标志物在制备用于诊疗反复妊娠丢失疾病的试剂或试剂盒中的应用。
本发明还披露了一种用于诊疗反复妊娠丢失疾病的试剂或试剂盒，所述试剂或试剂盒包括用于检测权利要求1中所述的免疫标志物所表达的免疫相关分子的试剂。
进一步地，所述免疫相关分子包括CD3、CD4、CD8、CD56、CD45RA、CCR7、CD127、CD28、γδT、CXCR5、PD-1中的至少一种。
本发明还提供了外周辅助T细胞在作为正常妊娠预测的免疫标志物中的应用。
综上所述，本发明的优点及积极效果为：
本发明采用多参数流式细胞术同时检测未生育妇女、已生育妇女及反复妊娠丢失妇女(每组各50例)外周血中63种免疫细胞亚型；通过多组非配对t检验，筛选未生育妇女组与反复妊娠丢失组、已生育妇女组与反复妊娠丢失组同时有差异的免疫指标为反复妊娠丢失相关的免疫细胞亚型，所述免疫功能指标包括：初始CD4+T细胞、中心记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞、终末分化CD4+T细胞、Treg细胞、外周辅助T细胞、中心CD8+T细胞、终末分化CD8+T细胞、非活跃期特异性的终末分化CD8+T细胞、耗竭型CD8+T细胞、T NK细胞、成熟NK细胞、未成熟NK细胞、未成熟NK/成熟NK比值、γδT细胞。
本发明为不明原因反复妊娠丢失的检测提供免疫标志物，包括15种细胞亚型。这些与反复妊娠丢失有关的免疫细胞亚型提示反复妊娠丢失妇女免疫系统处于免疫耐受不足的状态，从而不能够容受携带父系抗原的胎儿导致流产的发生。
附图说明
图1是与反复妊娠丢失密切相关的免疫细胞亚型检测分析数据图。
图2是有临床潜在应用价值的9种免疫指标的ROC曲线图；
图3是九个差异性指标在已生育组vs.未生育组和反复妊娠丢失组vs.未生育组的ROC分析结果。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例对本发明进行进一步详细说明，各实施例及试验例中所用的设备和试剂如无特殊说明，均可从商业途径得到。此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
根据本申请包含的信息，对于本领域技术人员来说可以轻而易举地对本发明的精确描述进行各种改变，而不会偏离所附权利要求的精神和范围。应该理解，本发明的范围不局限于所限定的过程、性质或组分，因为这些实施方案以及其他的描述仅仅是为了示意性说明本发明的特定方面。实际上，本领域或相关领域的技术人员明显能够对本发明实施方式作出的各种改变都涵盖在所附权利要求的范围内。
为了更好地理解本发明而不是限制本发明的范围，在本申请中所用的表示用量、百分比的所有数字、以及其他数值，在所有情况下都应理解为以词语“大约”所修饰。因此，除非特别说明，否则在说明书和所附权利要求书中所列出的数字参数都是近似值，其可能会根据试图获得的理想性质的不同而加以改变。各个数字参数至少应被看作是根据所报告的有效数字和通过常规的四舍五入方法而获得的。本发明中，“约”指给定值或范围的10％以内，优选为5％以内。
本发明下述各实施例中所述常温是指四季中自然室温条件，不进行额外的冷却或加热处理，一般常温控制在10～30℃，最好是15～25℃。
本发明披露了一组反复妊娠丢失疾病诊疗免疫标志物及应用，具体如下实施例所示。
实施例1显著差异的外周血中免疫细胞亚型的筛选
实施例中主要包含了三组人群：50例非妊娠妇女(未生育组)、50例已生育妇女(已生育组)和50例反复妊娠丢失妇女(反复妊娠丢失组)。未生育组和已生育组妇女月经周期正常，没有不良生活史；已生育组妇女均已分娩一个正常的孩子，并在分娩后1～2年之间，没有不良生育史。反复妊娠丢失组的妇女均在妊娠20周前发生过两次及以上的自然流产或胚胎停育史，且已排除了染色体异常、子宫解剖结构异常、血栓前状态、内分泌因素、感染及自身免疫性疾病。
实施例中每个人抽取5ml外周血于肝素钠处理的采血管中并在采样后24h内检测。
将外周血室温静置后，吸取上层血浆，将血浆用PBS缓冲液按1：1稀释混匀，并平铺于外周血淋巴细胞分离液上面，密度梯度离心。收集细胞并用含10％胎牛血清的RPMI1640培养基重悬细胞，按照说明书加入检测所需的流式抗体，4℃避光孵育30min后，用PBS洗两次后，用分离缓冲液重悬细胞，采用BD LSRFortessa X-20进行多参数流式细胞检测，结果用FlowJo V10 software软件进行分析。
多参数流式细胞分析的63种包括：CD4与CD8的41种T细胞亚型、NK细胞10种亚型及γδT细胞12种亚型。
数据分布类型用Shapiro-Wilk检验，正态分布类型用均数和标准差，偏态分布数据用中位数和范围表示；数据差异用多组比较的方差分析进行统计学分析。
图1为与反复妊娠丢失及成功妊娠密切相关的15种免疫细胞亚型。其中，A-O：与反复妊娠丢失有关的15种免疫细胞亚型，包括：初始CD4+T细胞、中心记忆CD4+T细胞、效应记忆CD4+T细胞、终末分化CD4+T细胞、Treg细胞、外周辅助T细胞、中心记忆CD8+T细胞、终末分化CD8+T细胞、非活跃期特异性的终末分化CD8+T细胞、耗竭型CD8+T细胞、T NK细胞、成熟NK细胞、未成熟NK细胞、未成熟NK/成熟NK比值、γδT细胞。A-D和L-M为同时在反复妊娠丢失组vs.已生育组及反复妊娠丢失组vs.未生育组比较中均有统计学差异的免疫指标；F为同时在反复妊娠丢失组vs.未生育组及已生育组vs.未生育组比较中均有统计学差异的免疫指标；E和H-K为在反复妊娠丢失组vs.已生育组比较中有统计学差异的免疫指标；G和N-O为在反复妊娠丢失组vs.未生育组比较中有统计学差异的免疫指标；正态分布数据用均数±标准差，偏态分布数据用中位数±极值表示。数据差异用多组比较的方差分析进行统计学分析。差异水平：P<0.05(*)；P<0.01(**)；P<0.001(***)；and P<0.0001(****)。ns表示差异无统计学意义。
实施例2筛选出的差异指标的临床应用价值
实施例中包含了三组人群，50例非妊娠妇女(未生育组)、50例已生育妇女(已生育组)和50例反复妊娠丢失妇女(反复妊娠丢失组)。未生育组和已生育组妇女月经周期正常，没有不良生活史；已生育组妇女均已分娩一个正常的孩子，并在分娩后1～2年之间，没有不良生育史。反复妊娠丢失组的妇女均在妊娠20周前发生过两次及以上的自然流产或胚胎停育史，且已排除了染色体异常、子宫解剖结构异常、血栓前状态、内分泌因素、感染及自身免疫性疾病。
非妊娠妇女所代表的未生育组，作为育龄妇女妊娠前的基线状态。非妊娠妇女外周血中15种免疫细胞亚型比例的95％置信区间，以及相同的指标在正常妊娠(已生育组)及反复妊娠丢失组的95％置信区间见表1。比较发现，15种差异免疫指标的置信区间范围在未生育组和生育组总的差异较小，而与反复妊娠丢失组的差异较大。其中，初始CD4+T细胞、中心记忆CD8+T细胞、成熟NK细胞和中心记忆CD4+T细胞的置信区间在反复妊娠丢失组中完全高于未生育组，而效应记忆CD4+T细胞、未成熟NK细胞、成熟NK/未成熟NK比值、外周辅助T细胞和终末分化CD4+T细胞的置信区间在反复妊娠丢失组中低于未生育组；提示上述9个免疫指标对反复妊娠丢失疾病的预测提供临界值评判具有重要的参考价值。反复妊娠丢失患者外周血免疫功能检测出的指标与本实施例中的指标重合得越多，提示该患者发生反复妊娠丢失的风险越高。
表1差异免疫指标功能简述及其在在各组中的置信区间
此外，对上述中的9个差异性的指标进行接受者操作特性曲线(receiveroperating characteristic curve，简称ROC曲线)(图2)和曲线下面积(area under thecure；AUC)(图3)分析其对疾病预测临界值、灵敏度和特异度。在已生育组和未生育组比较中发现，外周辅助T细胞对预测正常妊娠具有重要价值，其截断值为61.1％(特异度高达88％，灵敏度为54％)。而在反复妊娠丢失组和未生育组比较中发现，9个指标的p值均小于0.01，表明其对反复妊娠丢失疾病的预测具有重要价值，其对反复妊娠丢失的诊断的灵敏度和特异度见图3(反复妊娠丢失组vs.未生育组)。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。