具体实施方式

本发明的微生物增殖抑制剂含有异黄腐酚作为有效成分。

异黄腐酚对热稳定，表现出抗菌作用。因此，即使调配至在制造中需要进行基于日本食品卫生法的杀菌条件的加热的饮料中时，也表现出微生物的增殖抑制效果，从而本发明的微生物增殖抑制剂适合用于在制造工序中需要加热的饮食品。尤其适合用于饮料。

从而，本发明的微生物增殖抑制剂优选为饮料用。

异黄腐酚例如可通过加热等工序由啤酒花(Humulus lupulus)萃取物来制备。通过加热啤酒花萃取物，可在该萃取物中生成异黄腐酚。啤酒花萃取物通常可用溶剂对啤酒花的球花进行萃取，根据需要可通过和提纯相关的工序来制备，可根据公知的啤酒花萃取物的制备方法获得。作为萃取方法，例如可列举作为啤酒酿造中使用的啤酒花萃取物的制备方法而使用的基于乙醇溶剂的萃取方法。市面上销售有啤酒花萃取物，也可以使用市售的啤酒花萃取物。为了生成异黄腐酚而对啤酒花萃取物的加热优选于80～140℃(更优选85～100℃)下实施15分钟～5小时(更优选20分钟～3小时)。为了制备异黄腐酚而对啤酒花萃取物的提纯以公知的方法实施。作为提纯方法，例如可列举使用HPLC或吸附柱等，或利用溶解度的变化的析出等方法。此外，异黄腐酚可通过对黄腐酚进行加热来制造。此时的加热温度可优选采用80～140℃(更优选85～100℃)下15分钟～5小时(更优选20分钟～3小时)。

报告称例如异黄腐酚在100℃的高温条件也稳定。日本食品卫生法中作为清凉饮料水等的规格标准规定了杀菌条件，例如pH4.0以上的物质(pH4.6以上且水分活性超过0.94的物质除外)需要于85℃下加热30分钟。即使在这样的杀菌工序中，异黄腐酚也可稳定地含有于饮料中，因此具有容易在饮料中调配的优点。从而，根据本发明可提供使用安全且对于各种微生物具有抗菌作用的微生物增殖抑制剂的饮料。

作为学术上的定义，微生物不仅包含细菌(Bacteria)，还包含菌类(蘑菇、霉菌、酵母菌等)、病毒、微藻类等，但在本说明书中，微生物是指细菌(Bacteria)。

本发明的微生物增殖抑制剂中微生物优选为选自脂环酸芽孢杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌、梭状芽孢杆菌属细菌及葡萄球菌属细菌中的至少一种的细菌。

此外，微生物更优选为选自酸土脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillusacidoterrestris)、蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)、产气荚膜梭菌(Clostridiumperfringens)、艰难梭菌(Clostridium difficile)及黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)中的至少一种。异黄腐酚对于上述微生物表现出抗菌作用。

Alicyclobacillus acidoterrestris为属于革兰阳性的产芽孢细菌的脂环酸芽孢杆菌(Alicyclobacillus)属的细菌，为嗜酸耐热菌。嗜酸耐热菌即使在pH6.5以下的酸性条件下，在通常的加热杀菌中也不易灭绝，具有使果汁中的阿魏酸变成异臭原因物质愈创木酚的作用。因此，已知其增殖时导致饮食品的品质劣化。作为主要的防止策略，可列举比标准更高的高温条件下的杀菌或使用安息香酸等，然而存在前者破坏饮料的风味，后者为合成防腐剂而被忌避的课题。

Bacillus cereus为属于Bacillus属的革兰阳性兼性厌氧性杆菌，形成芽孢。为多存在于土壤或污水等自然界中的食物中毒菌。

Clostridium perfringens，通用名为“产气荚膜梭菌”，为属于梭状芽孢杆菌属的厌氧性杆菌。为人类或动物的肠道内的常住菌，在土壤等自然环境中广泛分布。产气荚膜梭菌中，产生肠毒素的为食物中毒的原因菌。

Clostridium difficile栖息于土壤、干草、沙子等自然环境或人类或动物的肠道及粪便中。由于该菌形成近端芽孢，从而在酸、碱、好氧状态、高温、低营养状态等残酷的环境下也稳定。

Staphylococcus aureus为革兰阳性兼性厌氧性球菌。该菌为存在于人体的皮肤表面、毛孔中的常住菌。产生肠毒素性的菌株在食品中增殖时产生毒素。由于摄取食品的同时摄取肠毒素而发生葡萄球菌食物中毒。肠毒素的性质为耐热性(100℃、30分钟)，在通常的加热烹饪中不失活，在冷冻下也稳定。在常在于人类皮肤中的葡萄球菌之中毒性高。

上述微生物作为饮食品有害菌被列举为检查对象，尤其嗜酸耐热菌(Alicyclobacillus acidoterrestris)，为其增殖在酸性饮料中具有成为问题的风险的细菌。

此外，本发明还为一种饮料的微生物污染防止方法，其特征在于，以达到25质量ppm以上的方式添加异黄腐酚。

当向饮料中添加25质量ppm以上的异黄腐酚时，可充分获得对于包括嗜酸耐热菌的微生物的增殖抑制效果。

另外，更优选以达到50质量ppm以上的方式添加异黄腐酚。这是由于可充分获得对于各种微生物的增殖抑制效果即抗菌活性。

异黄腐酚的添加量越多，越可期待微生物污染防止效果，但从维持该饮料本来具有的香味的观点出发，本发明的饮料的微生物污染防止方法中，优选以达到500质量ppm以下的方式添加异黄腐酚。

相对于饮料，优选以达到25～500质量ppm的方式添加异黄腐酚，更优选以达到50～500质量ppm的方式添加异黄腐酚。

另外，异黄腐酚具有特有的酸味及苦味，为对饮料大量调配时呈现苦味及酸味的物质。

在此，苦味或酸味包含于作为5种基本味的甜味、酸味、苦味、咸味(卤味)及鲜味中，为通过舌头上的味蕾的刺激而产生的感觉。饮食品的味道或美味程度，通过各种要素构成，除上述通过味蕾感知的基本味外，直接刺激口腔内的皮肤的痛觉、温度感觉及嗅觉所感知的气味也会影响，为各种信息相辅相成而感觉到的感觉。

在此，作为饮料等的酸味或苦味的改善方法，一般已知有添加具有甜味的糖类或氨基酸、核酸等的方法。这些方法并未消除酸味或苦味本身，而是以强甜味掩盖酸味及苦味。

然而，甜味在人类肌肤左右的温度(37℃)带下最容易感知，在低温区域(5℃以下)及高温区域(55℃以上)中，由于加上温度刺激具有变得难以感知的倾向。另一方面，苦味或酸味即使在低温区域中也容易感知，此外，就酸味而言，即使在高温区域中也具有容易感知的倾向。因此，就室温(25℃)的饮料和低温(5℃以下)的饮料而言，即使含有相同成分，低温的饮料一方也不易感知甜味而容易感知苦味及酸味。另一方面，室温的饮料一方容易感知甜味，而苦味及酸味被甜味掩盖而难以感知。

就固体食品和饮料而言，其状态为固体和液体而有所不同，由于作为液体的饮料一方摄取后很快在口腔内扩散，大量接触舌头上的味蕾，因此饮料一方具有容易强烈感知味道的倾向。

如此，就人类感知饮食品的味道或美味程度而言，除饮食品中所含成分及成分量外，饮食品的温度或状态也会影响。

从饮料的香味的观点出发，更优选以相对于饮料达到200质量ppm以下的方式添加异黄腐酚，进一步优选以达到180质量ppm以下的方式添加。关于本发明的一种实施方式的饮料，优选含有200质量ppm以下的异黄腐酚，更优选含有180质量ppm以下的异黄腐酚。

本发明的微生物增殖抑制剂及饮料的微生物污染防止方法优选用于pH4.6以下的饮料，更优选用于pH4.0以下的饮料。这是由于依照日本食品卫生法记载的制造标准，pH小于4.0的物质需要在65℃、10分钟或其同等以上的条件下加热杀菌，pH4.0以上且小于4.6的物质需要在85℃、30分钟或其同等以上的条件下加热杀菌，而在这样的加热杀菌处理中，存在嗜酸耐热菌导致的污染风险残存的可能性。

在一种方式中，本发明的饮料的微生物污染防止方法优选具有将饮料的pH调节至4.6以下的工序。如上所述，是因为本发明的饮料的微生物污染防止方法适合用于饮料中的嗜酸耐热菌的污染防止。此外，本发明的方法更优选具有将饮料的pH调节至4.0以下的工序。这是由于依照日本食品卫生法记载的制造标准，pH小于4.0的物质需要在65℃、10分钟或其同等以上的条件下加热杀菌，pH4.0以上且小于4.6的物质需要在85℃、30分钟或其同等以上的条件下加热杀菌，而在这样的加热杀菌处理中，存在嗜酸耐热菌导致的污染风险残存的可能性。

另外，可将饮料的pH调节至小于4.6，也可调节至小于4.0。

另外，饮料的pH只要最终达到上述记载的pH即可。

pH的调节例如可根据需要通过添加pH调节剂等公知的方法来实施。pH可通过市售的pH计来测定。

此外，饮料的微生物污染防止方法中，微生物优选为选自脂环酸芽孢杆菌属细菌、芽孢杆菌属细菌、梭状芽孢杆菌属细菌及葡萄球菌属细菌中的至少一种的细菌。

此外，微生物更优选为选自Alicyclobacillus acidoterrestris、Bacilluscereus、Clostridium perfringens、Clostridium difficile及Staphylococcus aureus中的至少一种。异黄腐酚对于饮料中的上述微生物的污染防止有效。

作为使用本发明的微生物增殖抑制剂及微生物污染防止方法的饮料，于以下进行详细记载，优选为酒精饮料、无酒精啤酒风味饮料、碳酸饮料、功能性饮料或果实及蔬菜类饮料。这是因为上述饮料pH为4.6以下，期待其对于来自对酸性饮料有害的嗜酸耐热菌即Alicyclobacillus acidoterrestris、属于Bacillus属的细菌(Bacillus cereus)、梭状芽孢杆菌属及葡萄球菌属的各种微生物具有抗菌作用。其中，更优选用于无酒精啤酒风味饮料、碳酸饮料、功能性饮料或果实及蔬菜类饮料，其中进一步优选用于功能性饮料或果实及蔬菜类饮料。这是由于嗜酸耐热菌的增殖可能性高。

此外，本发明还为一种饮料，其特征在于，以大于50质量ppm且180质量ppm以下的范围含有异黄腐酚，且pH为4.6以下。

这是由于对于pH4.6以下的饮料，通过含有大于50质量ppm的异黄腐酚，可获得对于各种微生物的充分的抗菌活性，即微生物的增殖抑制效果。进一步，由于异黄腐酚的含量为180质量ppm以下，因此可不破坏pH4.6以下的饮料的风味的同时获得充分的微生物的增殖抑制效果。

由于依照日本食品卫生法记载的制造标准，pH小于4.0的物质需要在65℃、10分钟或其同等以上的条件下加热杀菌，pH4.0以上且小于4.6的物质需要在85℃、30分钟或其同等以上的条件下加热杀菌，而在这样的加热杀菌处理中，存在发生嗜酸耐热菌导致的污染问题的可能性。例如，关于为了将Alicyclobacillus属的活菌数减少至1/10所需要的杀菌温度和时间，报告为90℃的加热温度时，需10分钟以上(《食品和容器2015VOL.56NO.3》)。因此，在日本食品卫生法记载的条件下进行杀菌时，pH小于4.6的清凉饮料中，存在无法绝对地说嗜酸耐热菌被充分灭绝的可能性。

另外，本发明的饮料优选含有60质量ppm以上的异黄腐酚。

异黄腐酚的含量例如可使用高效液相色谱法(HPLC)或LC-MS/MS系统(TSQQuantiva，Thermo Fisher Scientific公司)进行定量分析来测定。作为使用高效液相色谱法(HPLC)的异黄腐酚的测定方法，例如可列举以下条件。

(基本条件)

装置：SHIMADZU LC-20AD(株式会社岛津制作所制)

流速：1.0mL/分钟

分析时间：25分钟/样本

管柱：NOMURA CHEMICALS Develosil C30-UG-5，4.6mmΦ×150mm

柱温：40℃

检测器：SPD-20A

检测波长：280nm

(流动相)

A相：0.1％甲酸水溶液

B相：0.1％含甲酸的乙腈

(梯度条件)

于下述表1中示出梯度条件。B相的比率(％)为v/v％。

[表1]

此外，本发明的饮料优选为酒精饮料、无酒精啤酒风味饮料、碳酸饮料、功能性饮料或果实及蔬菜类饮料。

作为上述酒精饮料，可列举啤酒、啤酒类饮料、啤酒及啤酒类饮料以外的酒精饮料。

本发明的饮料为啤酒类饮料时，优选为发泡酒或第三啤酒。

本发明的饮料为啤酒及啤酒类饮料以外的酒精饮料时，优选为烧酒、碳酸烧酒、利口酒、鸡尾酒、烈酒、威士忌。

本说明书中的“无酒精啤酒风味饮料”是指具有啤酒般的风味的碳酸饮料，为非发酵的无酒精类型，其实质上不含酒精。在此，无酒精啤酒风味饮料不排除含有无法检测的程度的极微量的酒精的饮料。

本发明的饮料为碳酸饮料时，优选为可乐风味饮料、透明碳酸饮料、姜汁汽水、果汁类碳酸饮料、含奶类碳酸饮料或无糖碳酸饮料。

本发明的饮料为功能性饮料时，优选为运动饮料、能量饮料、健康补给饮料或袋装果冻饮料。

本发明的饮料为果实及蔬菜类饮料时，优选为100％果实饮料、含果实饮料、低含量果汁清凉饮料、含果粒的果实饮料或果肉饮料。

本发明的饮料优选为无酒精啤酒风味饮料、碳酸饮料、功能性饮料或果实及蔬菜类饮料，其中更优选功能性饮料或果实及蔬菜类饮料。此时饮料的pH为4.6以下，也可为小于4.6。此外，pH优选为3.0以上。

在优选方式中，本发明的饮料对于各种微生物具有抗菌作用，作为抑制微生物引起的污染的饮料有用。其中，由于对于嗜酸耐热菌具有抗菌作用，从而作为抑制嗜酸耐热菌引起的污染的饮料特别有用。

此外，本发明的饮料优选为在5℃以下(例如4～5℃)的低温区域或55℃以上(例如55～95℃)的高温区域中提供的饮料。这是由于，本发明的饮料含有具有抗菌活性的异黄腐酚，但由于其以不破坏饮料的风味的程度的特定浓度含有，从而即使在容易感知苦味及酸味的低温区域或容易感知酸味的高温区域中，饮料的风味也不会被破坏。

饮料形态并无特别限定，可制成容器装饮料。容器装饮料的容器并无特别限定，可使用任意形态及材质的容器，例如使用铝罐、钢罐等金属制容器；PET瓶等树脂制容器；纸盒等纸容器；玻璃瓶等玻璃制容器；木桶等木制容器等通常所用容器的任一种均可。通过将饮料填充及密封至这样的容器中，可获得容器装饮料。

饮料例如可通过将异黄腐酚调配至饮料制造所用物质(例如任意的食品原料或食品添加物)中来制备。

实施例

以下示出更具体地说明本发明的实施例。另外，本发明并不仅限定于这些实施例。

＜制备例1＞

异黄腐酚的制备

由啤酒花萃取物(Asama Chemical公司制)，用以下的方法对异黄腐酚进行分离提纯。即，通过正相柱层析法、反相柱层析法、制备型HPLC提纯，以啤酒花萃取物为原料，提纯异黄腐酚，并通过HPLC分析来确定纯度在95％以上。另外在HPLC分析中，作为管柱使用Develosil C30-UG-5(野村化学公司)，检测器的紫外线吸收测定波长设置为280nm。将得到的异黄腐酚作为标准品(纯度95％以上)用于以下实验。

＜实施例1＞

作为试验菌，针对以下微生物(细菌，Bacteria)进行前培养获得试验菌液。另外，前培养的条件分别如下所示。嗜酸耐热菌使用YSG broth，于50±1℃下实施2天好氧培养。蜡状芽孢杆菌和黄色葡萄球菌使用Mueller Hinton Broth(Difco日本碧迪公司制)，于37±1℃下实施18～20小时好氧培养。产气荚膜梭菌使用GAM Broth(日水制药株式会社)，于35±1℃下实施18～20小时厌氧培养。艰难梭菌(芽孢)使用添加牛磺胆酸的BHIA培养基，于37±1℃下实施7天厌氧培养。

(试验菌)

·嗜酸耐热菌(Alicyclobacillus acidoterrestris ATCC 49025)

·蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus IFO 13494)

·产气荚膜梭菌(Clostridium perfringens JCM 1290)

·艰难梭菌(芽孢)(Clostridium difficile ATCC 9689)

·黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus subsp.aureus NBRC 12732)

使用99.5％乙醇分别制备10mg/mL异黄腐酚溶液及其2倍程度稀释浓度的溶液。接下来灭菌、溶解后，向于50±1℃下保存的规定的培养基(如下述表2所示)中以1/99(异黄腐酚溶液体积/培养基溶液体积)的量添加各溶液，充分混合后，分注至培养皿，使其固化制作琼脂平板培养基。

接下来，向上述琼脂平板培养基中涂抹经前培养的试验菌液，以下述表2所记载的规定的培养条件进行培养后，以微生物的发育得到阻止的最低浓度作为最小发育阻止浓度(MIC)。所得结果示于下述表3。

＜培养条件＞

[表2]

[表3]

明确了异黄腐酚阻止上述各种微生物的发育，具有抗菌作用即微生物增殖抑制作用。

工业实用性

本发明的微生物增殖抑制剂、饮料的微生物污染防止方法及饮料在饮食品领域有用。