本发明公开了一种天然代糖酵母抽提物组合物、其制备方法及应用。该天然代糖酵母抽提物组合物的原料包括主料和辅料,主料由酵母抽提物和天然甜味剂组成,按照重量份计,酵母抽提物为55~80份,天然甜味剂为选自赤藓糖醇、甜菊糖苷、罗汉果甜苷、索马甜和甘草酸二钾组成的组中的两种或多种,天然甜味剂为2~45份。本发明的天然代糖酵母抽提物组合物以酵母抽提物为主,因其富含小分子肽及多种功能因子,能够明显掩盖赤藓糖醇、甜菊糖苷、罗汉果甜苷、索马甜、甘草酸二钾等甜味剂本身带有的甘草味、苦味、清凉味等后味,同时增加甜度,使整体甜感更趋于蔗糖甜感,更加柔和协调。