一种长循环的cbma构建的纳米载体及其制备方法
阅读说明：本技术 一种长循环的cbma构建的纳米载体及其制备方法 (Long-circulating nano-carrier constructed by CBMA (CBMA) and preparation method thereof ) 是由 原续波 韩星 邢慧珂 赵瑾 侯信 于 2019-09-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种长循环的CBMA构建的纳米载体及其制备方法,所述纳米载体是由CBMA单体和交联剂BIS通过原位自由基聚合构建而成纳米载体的网状壳层结构,总体呈球形,粒径和电位均一。其中CBMA具有优异的抗蛋白吸附能力,可改善相应纳米微囊在体内的血液循环时间；BIS赋予壳层的网状结构,可改善后期的药物释放性能,本发明还可通过改变交联剂的种类,以设计环境响应性的长循环纳米载体,符合具体实施环境对纳米载体的所需要求。本发明制备过程简便,反应温和,安全环保,成本较低,具有广阔的生物医用前景。(The invention discloses a long-circulating nano carrier constructed by CBMA (conjugated-binding-ligand) and a preparation method thereof, wherein the nano carrier is a net-shaped shell structure of the nano carrier constructed by CBMA monomers and a cross-linking agent BIS through in-situ free radical polymerization, and is spherical in overall shape and uniform in particle size and potential. The CBMA has excellent protein adsorption resistance, and can improve the blood circulation time of corresponding nanocapsules in vivo; the BIS endows the shell with a net structure, so that the later-stage drug release performance can be improved, and the invention can also design the long-circulating nano-carrier with environmental responsiveness by changing the type of the cross-linking agent, thereby meeting the requirements of the specific implementation environment on the nano-carrier. The preparation method has the advantages of simple and convenient preparation process, mild reaction, safety, environmental protection, lower cost and wide biomedical prospect.)
技术领域
本发明属于生物医用材料技术领域，涉及一种在体内长循环纳米载体的制备方法，以改善药物载体在体内的利用度问题。
背景技术
近些年来，纳米药物载体由于高曲率、尺寸小的特点，具有改善药物在体内的分布并且具有对肿瘤部位的高通透性和滞留效应(EPR效应)作用，已经受到了广泛的关注。然而，一旦应用于体内，长循环特性成为其应用的重要因素。一般地，在体内的循环时间越长，纳米载体越有足够的时间向病灶部位累积，从而更好地发挥其诊断或治疗作用。然而传统的纳米载体仍不足以满足我们对其长循环性能的要求。目前，两性离子的修饰已经成为一种有效的延长血液循环时间的方法。两性离子是一种分子链上同时带有正电荷和负电荷，但整体呈电中性的物质，其高电荷赋予两性离子强烈的水化作用，可有效抑制蛋白吸附，降低单核巨噬细胞系统的吞噬作用和网状内皮系统的清除作用，从而延长载体在体内的血液循环时间。目前，利用两性离子构建的药物载体在体内的半衰期一般可延长至8-20h。
其中，羧酸甜菜碱(CB)作为研究最多的两性离子之一，已被证明其具有优异的抗蛋白吸附能力，可延长相应载体在体内的血液循环时间。Peng Zhang等人研究发现(Zhang,Peng,et al."Zwitterionic gel encapsulation promotes protein stability,enhances pharmacokinetics,and reduces immunogenicity."Proceedings of theNational Academy of Sciences 112.39(2015):12046-12051)，利用丙烯酸化的羧酸甜菜碱(CBAA)制备的纳米载体，其体内的半衰期可延长至10h。Priyesh Jain等人(Jain,Priyesh,et al."Zwitterionic hydrogels based on a degradable disulfidecarboxybetaine cross-linker."Langmuir 35.5(2018): 1864-1871)利用多步有机反应制备了羧酸甜菜碱的交联剂，并利用CBAA制备纳米载体，发现其在血液中的半衰期达到了20h。另外，Weifeng Lin等人(Lin,Weifeng,et al. "Biocompatible long-circulatingstar carboxybetaine polymers."Journal of Materials Chemistry B 3.3(2015):440-448)利用甲基丙烯酸化的羧基甜菜碱(CBMA)修饰β-环糊精，制得的纳米载体在体内的半衰期达到了22h。然而，在环糊精的CBMA修饰过程中，ATRP 反应所引入的小分子如催化剂CuBr等，不利于纳米载体的生物相容性。至此，利用羧酸甜菜碱制得的纳米载体仍存在半衰期较短，以及制备过程繁琐、易引入小分子有毒成分等问题，限制了其在生物医用领域的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供一种长循环的CBMA构建的纳米载体及其制备方法，解决目前药物载体的循环时间较短、生物利用度较差等问题。
本发明的技术目的通过以下技术方案予以实现。
一种长循环的CBMA构建的纳米载体，由单体甲基丙烯酸化的羧基甜菜碱(CBMA，即3-[[2-(甲基丙烯酰氯)乙基]二甲基铵]丙酸酯)通过原位自由基聚合方法，在以蛋白为核的外层构建聚CBMA网状壳层。纳米载体形貌为球状、粒径均一，纳米载体粒径在 10-25nm，包载前的蛋白粒径在2-4nm，增加的粒径部分为聚CBMA构建的网状壳层。
本发明利用聚CBMA构建的球状壳层，赋予纳米载体长循环特性，其在体内的半衰期长达22h，高于目前两性离子构建的纳米载体的半衰期值；本发明在制备方法上明显优于其他延长血液循环时间的策略，整个过程安全无毒，符合生物医用载体在体内应用的设计初衷，即本发明的纳米载体在制备功能性长循环药物载体中的应用。
上述纳米载体的制备方法，按照下述步骤进行：
步骤1，向蛋白溶液中加入单体和交联剂，在持续搅拌作用下，将单体和交联剂吸附到蛋白周围，形成球形网状壳层前体；单体为N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐(APM) 和3-[[2-(甲基丙烯酰氯)乙基]二甲基铵]丙酸酯(CBMA)，N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐和3-[[2-(甲基丙烯酰氯)乙基]二甲基铵]丙酸酯的摩尔比为1：(10—1000)；交联剂为N,N’-亚甲双丙烯酰胺(BIS)，蛋白与交联剂的摩尔比为1：(100-10000)；蛋白与单体(即两种单体之和)摩尔比为1：(100—10000)；
在步骤1中，N-(3-氨基丙基)甲基丙烯酸盐和3-[[2-(甲基丙烯酰氯)乙基]二甲基铵]丙酸酯的摩尔比为1：(100—600)。
在步骤1中，蛋白为西妥昔单抗或者牛血清白蛋白。
在步骤1中，蛋白与交联剂的摩尔比为1：(2000—6000)。
在步骤1中，蛋白与单体(即两种单体之和)摩尔比为1：(2000—6000)。
在步骤1中，选择蛋白溶液为蛋白的水溶液，向其中加入均匀分散单体的水溶液，均匀分散交联剂的二甲基亚砜溶液。
步骤2，向步骤1的反应体系中加入催化剂和引发剂，通过原位聚合法以蛋白为核的外层构建聚CBMA网状壳层；催化剂为N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)，引发剂为过硫酸铵(APS)，步骤1中蛋白、催化剂、引发剂的摩尔比为1：(100—1000)：(100— 1000)
在步骤2中，向步骤1的反应体系中加入均匀分散催化剂和引发剂的水溶液。
在步骤2中，选择在4—5摄氏度下进行原位聚合，反应时间为1—3小时，优选1.5—2小时。
在步骤2中，步骤1中蛋白、催化剂、引发剂的摩尔比为1：(300—600)：(300—600)。
本专利提出一种利用聚CBMA构建长循环纳米载体的方法，本发明中使用非羧酸甜菜碱类的交联剂，所制得纳米载体的半衰期延长至22h。此方法采用原位自由基聚合方式，利用聚CBMA在药物周围构建球形网状壳层结构，赋予纳米载体长循环的特性。此发明制备方法简便、一步到位，整个反应过程在水相中进行，反应条件温和、周期较短，过程无毒无害、安全环保，符合生物医用药物载体的设计理念。另外，本发明可通过调整加入的功能化单体和环境响应性交联剂，构建符合实际需求的功能性长循环药物载体。
与现有技术相比，本发明的技术方案通过原位自由基聚合方法制备了形貌为球形，粒径均一的纳米载体，此壳层为CBMA与交联剂BIS的聚合网络，其中CBMA具有优异的抗蛋白吸附能力，可改善相应纳米微囊在体内的血液循环时间；BIS赋予壳层的网状结构，可改善后期的药物释放性能，本发明还可通过改变交联剂的种类，以设计环境响应性的长循环纳米载体，符合具体实施环境对纳米载体的所需要求。本发明制备过程简便，反应温和，安全环保，成本较低，具有广阔的生物医用前景。
附图说明
图1是本发明聚CBMA构建的球状纳米载体的透射电镜照片。
图2是本发明聚CBMA构建的球状纳米载体的粒径分布测试结果图。
图3是本发明聚CBMA构建的球状纳米载体的凝胶电泳测试结果图。
图4是本发明聚CBMA构建的球状纳米载体的血液循环时间测试结果图。
图5是本发明聚CBMA构建的球状纳米载体的红外光谱图。
具体实施方式
下面结合附图及实施例对本说明做进一步说明。
实施例1
取含1mg牛血清白蛋白(BSA，经FITC标记)的溶液，以牛血清蛋白与APM摩尔比为1:30的比例加入APM。搅拌混合均匀后，加入两性离子单体CBMA和交联剂BIS，摩尔比为BSA:CBMA：BIS＝1:2000：300，在持续搅拌作用下，将CBMA单体和BIS 交联剂通过氢键和静电吸附作用募集到蛋白表面，构建网状壳层的前体。充分混合均匀后，加入催化剂TEMED和APS，摩尔比分别为BSA:TEMED:APS＝1:300:300。此体系在4℃下反应1.5h，便制得聚CBMA构建的球状纳米载体，记为CBMA2-NC。取500μ L该样品(即制备后分散有CBMA2-NC的溶液)，通过尾静脉注射进SD大鼠体内，在不同的时间点经眼眶处取血，测定纳米载体在SD大鼠体内的血液循环时间。
实施例2
取含1mg牛血清白蛋白(BSA，经FITC标记)的溶液，以牛血清蛋白与APM摩尔比为1:30的比例加入APM。搅拌混合均匀后，加入两性离子单体CBMA和交联剂BIS，摩尔比为BSA:CBMA：BIS＝1:3000：300，在持续搅拌作用下，将CBMA单体和BIS 交联剂通过氢键和静电吸附作用募集到蛋白表面，构建网状壳层的前体。充分混合均匀后，加入催化剂TEMED和APS，摩尔比分别为BSA:TEMED:APS＝1:300:300。此体系在4℃下反应1.5h，便制得聚CBMA构建的球状纳米载体，记为CBMA3-NC。取500μ L该样品，通过尾静脉注射进SD大鼠体内，在不同的时间点经眼眶处取血，测定纳米载体在SD大鼠体内的血液循环时间。
实施例3
取含1mg牛血清白蛋白(BSA，经FITC标记)的溶液，以牛血清蛋白与APM摩尔比为1:30的比例加入APM。搅拌混合均匀后，加入两性离子单体CBMA和交联剂BIS，摩尔比为BSA:CBMA：BIS＝1:4000：300，在持续搅拌作用下，将CBMA单体和BIS 交联剂通过氢键和静电吸附作用募集到蛋白表面，构建网状壳层的前体。充分混合均匀后，加入催化剂TEMED和APS，摩尔比分别为BSA:TEMED:APS＝1:300:300。此体系在4℃下反应1.5h，便制得聚CBMA构建的球状纳米载体，记为CBMA4-NC。取500μ L该样品，通过尾静脉注射进SD大鼠体内，在不同的时间点经眼眶处取血，测定纳米载体在SD大鼠体内的血液循环时间。
实施例4
取含1mg牛血清白蛋白(BSA，经FITC标记)的溶液，以牛血清蛋白与APM摩尔比为1:30的比例加入APM。搅拌混合均匀后，加入两性离子单体CBMA和交联剂BIS，摩尔比为BSA:CBMA：BIS＝1:6000：300，在持续搅拌作用下，将CBMA单体和BIS 交联剂通过氢键和静电吸附作用募集到蛋白表面，构建网状壳层的前体。充分混合均匀后，加入催化剂TEMED和APS，摩尔比分别为BSA:TEMED:APS＝1:300:300。此体系在4℃下反应1.5h，便制得聚CBMA构建的球状纳米载体，记为CBMA6-NC。取500μ L该样品，通过尾静脉注射进SD大鼠体内，在不同的时间点经眼眶处取血，测定纳米载体在SD大鼠体内的血液循环时间。
实施例5
取含1mg牛血清白蛋白(BSA，经FITC标记)的溶液，以牛血清蛋白与APM摩尔比为1:30的比例加入APM。搅拌混合均匀后，加入两性离子单体CBMA和交联剂BIS，摩尔比为BSA:CBMA：BIS＝1:9000：300，在持续搅拌作用下，将CBMA单体和BIS 交联剂通过氢键和静电吸附作用募集到蛋白表面，构建网状壳层的前体。充分混合均匀后，加入催化剂TEMED和APS，摩尔比分别为BSA:TEMED:APS＝1:300:300。此体系在4℃下反应1.5h，便制得聚CBMA构建的球状纳米载体，记为CBMA9-NC。取500μ L该样品，通过尾静脉注射进SD大鼠体内，在不同的时间点经眼眶处取血，测定纳米载体在SD大鼠体内的血液循环时间。
图1是聚CBMA构建的纳米载体的透射电镜图。将样品滴至铜网上，用磷酸钨进行染色后，采用日本电子光学公司生产的透射电子显微镜进行形貌观察。观测结果如图1，黑色部位为纳米载体，呈光滑的球形，粒径较均一，为10-25nm。
图2是纳米载体的粒径分布图。取100微升样品，采用美国Brookhaven仪器公司生产的激光粒度仪/zeta电位仪进行测试。结果显示，纳米载体的粒径集中在20nm左右。
图3是纳米载体的凝胶电泳图。采用1×TAE缓冲液配置琼脂糖凝胶，在电压为150V，电流为40mV下进行测试，之后在365nm紫外凝胶成像系统下观察图像。如图3所示，未包载的蛋白在电泳作用下，移向正极，条带偏离孔洞。而制得的纳米载体由于呈微弱电中性，条带留在孔洞中。电镜、粒径分布及其凝胶电泳的结果表明成功制得了纳米载体。
图4为聚CBMA构建的纳米载体在体内的血液循环时间数据图。通过尾静脉注射500μL纳米载体后，在不同的时间点经眼眶处取血500μL，在3000rpm下离心10min，取上层血清，经酶标仪测定FITC的荧光强度(代表纳米载体的量)，利用不同时间点下的荧光强度得到纳米载体的血液循环时间曲线。如图5所示，BSA为对照组，CBMA—NC 为本发明制备的纳米载体，与未进行聚CBMA构建的纳米载体相比，经聚CBMA构建的纳米载体在体内的循环时间明显得到了提高，半衰期为22h。从而成功的证明了聚 CBMA构建的纳米载体的长循环特性。
图5CBMA构建的纳米载体的红外谱图，将CBMA构建的纳米载体体系经冻干得到固体，与溴化钾混合进行压片，所制得样品经傅里叶变换红外光谱仪测试得到红外光谱图。如图所示，3436cm-1处为pCBMA中正电荷季铵部分的特征吸收峰；1734cm-1、 1587cm-1、1386cm-1处为pCBMA中负电部位羧酸根(—COO-)的特征吸收峰，2960cm-1处为pCBMA中甲基丙烯酸酯的甲基(-CH3)特征吸收峰。
根据本发明内容进行工艺参数的调整，均可实现CBMA构建的纳米载体的制备，经测试表现出与本发明基本一致的性能，CBMA具有优异的抗蛋白吸附能力，可改善相应纳米微囊在体内的血液循环时间；BIS赋予壳层的网状结构，可改善后期的药物释放性能。以上对本发明做了示例性的描述，应该说明的是，在不脱离本发明的核心的情况下，任何简单的变形、修改或者其他本领域技术人员能够不花费创造性劳动的等同替换均落入本发明的保护范围。
- 上一篇：一种医用注射器针头装配设备
- 下一篇：肠溶致孔剂及其制备方法和肠溶胶囊