一种药物载体及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种药物载体及其制备方法与应用 (Drug carrier and preparation method and application thereof ) 是由 冯龙宝 蓝咏 刘玉 邓立 于 2019-11-29 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种药物载体,所述药物载体包含由己内酯或聚己内酯与2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯和N-羟甲基丙烯酰胺聚合而成的片段。本发明将制备的药物载体的LCST约为37℃,接近人体生理温度,药物载体为生物相容性良好的温敏性载体,可用于体内智能药物传递领域。本发明还公开了所述药物载体的制备方法,该制备方法能够成功实现该药物载体的制备；本发明还公开了一种药物组合物,所述药物组合物为将化疗药物和荧光染料与所述药物载体相结合,可以实现集化疗与光热治疗于一体。本发明还公开了所述药物组合物的制备方法。本发明还公开了所述药物组合物在制备预防、诊断或治疗肿瘤药物中的应用。(The invention discloses a drug carrier, which comprises a fragment polymerized by caprolactone or polycaprolactone, 2-methyl-2-acrylic acid-2- (2-methoxyethoxy) ethyl ester and N-hydroxymethyl acrylamide. The LCST of the prepared drug carrier is about 37 ℃, the LCST is close to the physiological temperature of a human body, and the drug carrier is a temperature-sensitive carrier with good biocompatibility and can be used in the field of in-vivo intelligent drug delivery. The invention also discloses a preparation method of the drug carrier, which can successfully realize the preparation of the drug carrier; the invention also discloses a pharmaceutical composition, which combines chemotherapy drugs, fluorescent dye and the drug carrier and can realize the integration of chemotherapy and photothermal therapy. The invention also discloses a preparation method of the pharmaceutical composition. The invention also discloses application of the pharmaceutical composition in preparing a medicament for preventing, diagnosing or treating tumors.)
技术领域
本发明涉及一种高分子材料和医学工程领域，尤其涉及一种药物载体及其制备方法与应用。
背景技术
鼻咽癌是一种全球相对罕发但高发于东南亚和中国南方地区的恶性肿瘤，尤其是在中国广东省，年发病率约20～50/100000，为此有“广东瘤”之称。男性发病率是女性的2～3倍，发病年龄由10多岁开始逐渐上升，45～60岁为高发峰年龄段。2012年，全球鼻咽癌新发病例数有86700例，死亡例数有50800例，其中约40％发生在中国。目前，虽然临床上已有诸多用于鼻咽癌的诊疗技术和方法，但仍然不能完全满足临床的需要。在药物化疗方面，鼻咽癌常用的化疗手段是5-氟尿嘧啶联合顺铂，虽然提高了患者的生存率，但同时也给患者带来身心上的巨大痛苦，主要原因是肿瘤多药耐药使药物进入肿瘤细胞的效率不高，耐药后患者仍需接受化疗，造成化疗药物对正常组织或器官造成巨大损害，严重影响化疗效果及患者生存。构建有效的药物输送体系对于肿瘤化疗具有十分重要的意义。利用纳米药物载体，将药物分子吸附到载体表面或装载在载体内部，并在一定的刺激条件下控制药物分子在肿瘤部位的释放。这种给药方式能有效避免药物过早释放从而提高作用浓度，同时也减少了药物运输过程的毒副作用，将极大促进化疗药物在肿瘤治疗中的应用。
发明内容
本发明的目的在于克服现有技术存在的不足之处而提供一种药物载体及其制备方法与应用。
为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种药物载体，所述药物载体由聚己内酯链段、2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯链段和N-羟甲基丙烯酰胺链段组成的嵌段共聚物。
聚己内酯(PCL)是一种具有良好生物相容性和生物降解性的疏水性脂肪族聚酯，它可以作为一种疏水性嵌段与亲水性嵌段在水溶液中自组装形成核－壳结构胶束，可以将疏水性药物包裹在疏水性PCL内核中，可以快速有效的在人体内发生药物传递与细胞靶向。在生理环境下，PCL可以在酶的水解作用下降解，基于PCL以上优良性质，含有PCL嵌段的聚合物己经被应用在药物传递的载体、组织支架和纳米晶体成像等领域。
2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)是一种含有低聚(乙二醇)侧链的温度响应性的单体，作为一种聚乙二醇类似物，其具有良好的水溶性和生物相容性。羟甲基丙烯酰胺(HMAM)是一种水溶性良好的单体，包含羟基和酰胺基团。其最低临界溶解温度(LCST)为26℃。当温度高于共聚物的LCST时，聚合物的亲水性和疏水性发生变化，分子构象的变化导致共聚物链将发生相位分离，交联和重新排列，可应用于组织工程、药物输送和缓释。
N-羟甲基丙烯酰胺(HMAM)是一种具有良好溶解性的单体，其包含羟基和酰胺基团。羟基基团可以转化为其他基团，从而进一步合成特点功能和结构的聚合物。酰胺基团类似于蛋白质分子中的氨基酸结构使得聚合物更好的应用在人体中，通过加入HMAM不仅可以调节嵌段共聚物p(MEO2MA-co-HMAM)的最低临界温度(LCST)，而且含有的酰胺基团使得聚合物更好的应用在人体中。
本发明将制备的药物载体为聚己内酯与单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯和单体N-羟甲基丙烯酰胺聚合形成的共聚物，聚己内酯为药物载体提供疏水基团，单体2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯和单体N-羟甲基丙烯酰胺聚合后形成亲水基团，可实现疏水性药物的负载，其LCST约为37℃，接近人体生理温度，药物载体为生物相容性良好的温敏性载体，可用于体内智能药物传递领域。
优选地，所述聚己内酯的聚合度为20～40，所述药物载体的数均分子量为25000～40000。
优选地，所述2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯和N-羟甲基丙烯酰胺的摩尔之比为：2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯：N-羟甲基丙烯酰胺＝80～90:10～20；2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯和N-羟甲基丙烯酰胺聚合的聚合度为120～180。通过改变聚合物的聚合度和2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯和N-羟甲基丙烯酰胺的摩尔比，可以实现将LCST调节至37℃。
优选地，所述己内酯的物质的量或聚己内酯中的己内酯的物质的量与2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯和N-羟甲基丙烯酰胺的物质的量之和的比为：己内酯或聚己内酯中的己内酯：2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯和N-羟甲基丙烯酰胺之和＝1：6～8。采用上述配比时，可以将疏水链段和亲水链段控制在一定数量范围内，更有利于药物的负载和运输，可实现定位、定时的作用。
本发明的目的还在于提供一种所述药物载体的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：
(1)PCL-Br的制备：
(a)将ε-己内酯和甲苯混合均匀，加入α溴代异丁酸羟丁酯和辛酸亚锡的甲苯溶液，装于密封容器中；
(b)将密封容器置于液氮中冷冻5～15min，对密封容器抽真空5～15min，向密封容器内通入氮气后，解冻；
(c)重复步骤(b)2～4次，结束后将密封容器置于在105～115℃下反应10～14h；反应结束后，将步骤(d)所得反应液滴加入***中，过滤，取固体，得PCL-Br；
(2)在PCL-Br中加入CuCl、三[2-(二甲氨基)乙基]胺、2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯和N-羟甲基丙烯酰胺和DMF，装于密封容器中；
(3)密封容器置于液氮中冷冻5～15min，对密封容器抽真空5～15min，向密封容器内通入氮气后，解冻；
(4)重复步骤(3)2～4次，结束后将密封容器置于在55～65℃下反应10～14h；反应结束后，加入四氢呋喃溶解反应物，经过中性Al2O3的层析柱，然后浓缩，将浓缩液中滴加入***中，过滤，取固体，得所述药物载体。
利用开环反应和原子转移自由基聚合的方法合成具有温度响应的聚己内酯-b-2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯-co-N-羟甲基丙烯酰胺嵌段共聚物(PCL-b-(MEO2MA-co-HMAM))药物载体，能够实现疏水性药物的定点和定时递送缓释。优选地，所述ε-己内酯、α溴代异丁酸羟丁酯和辛酸亚锡的摩尔比为1:1:1。
本发明的目的还在于提供一种用于药物组合物，所述组合物包含上述所述药物载体，还包含化疗药物和/或荧光染料。
所述化疗药物和荧光染料优选为疏水性的化疗药物和荧光染料。优选地，所述组合物包含所述药物载体、化疗药物和荧光染料。将化疗药物和荧光染料与所述药物载体相结合，通过近红外光引发纳米载药复合物在病变区域的光热化疗协同作用，以期增加病灶区域的药物浓度以及提高药物作用时间；可以实现集化疗与光热治疗于一体的化疗和治疗药物的制备。药物组合物为核壳结构，内核层由疏水性PCL片段形成，外壳层由亲水性p(MEO2MA-co-HMAM)片段形成，疏水的化疗药物和荧光染料被包裹于内核层中。
优选地，所述药物组合物包含以下重量份的组分：药物载体5～20份、化疗药物1～5份和荧光染料1～5份。
优选地，所述化疗药物为5-氟尿嘧啶、阿霉素、顺铂、卡铂、紫杉醇、多西他赛和柔红霉素中的至少一种；和/或所述荧光染料为吲哚菁绿。
吲哚菁绿具有较强的近红外光发热效应，是为数不多的被美国FDA批准应用临床的荧光染料，具有优秀的生物相容性，因此结合吲哚菁绿的近红外光响应控制释放系统在应用中可以获得更理想的释放效率。同时，近红外光产生的光热效应不仅能用于控制释放，而且也能用于肿瘤热治疗，并与化疗起到协同治疗的效果。本发明通过光热化疗协同作用实现药物的定点和定时递送缓释，提高药物的长循环和蓄积作用，因此药物使用量比常规化疗药物少，治疗效果比常规化疗更佳。
本发明的目的还在于提供所述药物组合物的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：将化疗药物用溶剂溶解，加入所述药物载体和荧光染料，超声混合均匀，透析过滤，即得所述药物组合物。
上述制备方法中，所述溶剂优选为三氯甲烷，所述透析过滤时所用透析袋的分子量优选为5000D；所述超声混合的时间优选为10～20min。
本发明的目的还在于提供所述药物组合物在制备预防、诊断或***药物中的应用。优选地，所述肿瘤为鼻咽癌。
本发明的有益效果在于：本发明提供了一种药物载体，本发明将制备的药物载体为三嵌段共聚物，其LCST约为37℃，接近人体生理温度，药物载体为生物相容性良好的温敏性载体，可用于体内智能药物传递领域。本发明还提供了所述药物载体的制备方法，该制备方法能够成功实现该药物载体的制备；本发明还提供了一种用于光热化疗和治疗的药物组合物，所述药物组合物为将化疗药物和荧光染料与所述药物载体相结合，可以实现集化疗与光热治疗于一体。本发明还提供了所述药物组合物的制备方法；本发明还提供了所述药物组合物在制备预防、诊断或***药物中的应用。
附图说明
图1为实施例1中纳米载药复合物的粒径测定图；
图2为实施例4中纳米载药复合物的粒径测定图；
图3为实施例5中纳米载药复合物的粒径测定图；
图4为实施例1、实施例4和实施例5所述药物组合物中5-氟尿嘧啶的释放曲线图；
图5为实施例1、实施例4和实施例5所述药物组合物CNE2的细胞抑制率；
图6为实施例1中制备的药物载体水溶液(1mg/mL)在不同温度下测得的紫外透光率。
具体实施方式
为更好的说明本发明的目的、技术方案和优点，下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。
实施例1
本实施例为用于鼻咽癌光热化疗协同的药物组合物的一种实施例，本实施例所述药物组合物包含以下重量份的组分：药物载体5份、5-氟尿嘧啶1份和吲哚菁绿1份。
本实施例所述药物载体为聚己内酯-b-2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯-co-N-羟甲基丙烯酰胺嵌段共聚物(PCL-b-(MEO2MA-co-HMAM))，制备方法包括以下步骤：
(1)PCL-Br的制备：
(a)将茄形瓶放在烘箱中彻底干燥，以除去水蒸气，然后向茄形瓶中加入5.0gε-CL和10mL无水甲苯，振荡，使其均匀溶解；再加入0.12gα溴代异丁酸羟丁酯(HBBIB)和2滴辛酸亚锡(Sn(Oct)2)(2mL)的甲苯溶液；
(b)将茄形瓶置于液氮中冷冻10min冻实，抽真空10min，充入氮气后，解冻；完全解冻后，擦干茄形瓶外壁；
(c)重复以上过程2次，结束后，将茄形瓶放入110℃油浴中，加热反应12h；反应结束后，以***为沉淀剂，在不断搅拌下向***中滴加反应产物，滴完后，静置使沉淀完全，最后抽滤洗涤，真空干燥后得到白色粉末状固体，即得PCL-Br；
(2)称取1.0g PCL-Br置于干燥的茄形瓶中，加入0.012g CuCl作为催化剂，0.046g三[2-(二甲氨基)乙基]胺(ME6TREN)作为配体，1.0g 2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯(MEO2MA)和0.095g N-羟甲基丙烯酰胺(HMAM)作为单体，用3mL无水DMF溶解，混合均匀；
(3)置于液氮中冷冻10min，对密封容器抽真空10min，向密封容器内通入氮气后，完全解冻后，擦干茄形瓶外壁；
(4)重复步骤(3)2次后，置于60℃油浴中反应12h，反应结束后，用适量四氢呋喃溶解反应物，然后将溶液经过中性Al2O3的层析柱以除去体系中的铜催化剂等杂质，反应产物的溶液经旋蒸浓缩后缓慢滴入十倍体积的冰***中沉淀，将沉淀物抽滤洗涤后置于真空烘箱中干燥，即可得到白色固体产物PCL-b-p(MEO2MA-co-HMAM)。
本实施例所述药物组合物的制备方法包括以下步骤：将20mg 5-氟尿嘧啶、50mgPCL-b-p(MEO2MA-co-HMAM)共聚物和20mg吲哚菁绿溶解于5mL三氯甲烷中，混匀后超声10min，水浴至70℃并真空旋转蒸发直至三氯甲烷挥发完；冷却至室温后，超声探头作用15min使其分散，并采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，过滤后再超滤离心去除沉淀，对上层绿色透明的水溶液进行冷冻干燥20h即得粉状固体；对所述药物组合物用四氢呋喃溶解，然后进行透析，6h换水一次，透析袋的分子量为5000D；透析后再冷冻干燥即得纳米载药复合物。
对本实施例所述药物组合物采用动态激光光散射仪测定粒子的粒径分布，实验结果如图1所示，多分散性为0.203，平均粒径为203nm，粒子呈球形，分散比较均匀。
实施例2
本实施例为用于鼻咽癌光热化疗协同的药物组合物的一种实施例，本实施例所述药物组合物包含以下重量份的组分：药物载体17份、5-氟尿嘧啶4份、吲哚菁绿3.5份。
本实施例所述药物载体的制备方法同实施例1。
所述药物组合物的制备方法包括以下步骤：将4mg 5-氟尿嘧啶、17mg PCL-b-p(MEO2MA-co-HMAM)共聚物和3.5mg吲哚菁绿溶解于5mL三氯甲烷中，混匀后超声10min，水浴至70℃并真空旋转蒸发直至三氯甲烷挥发完；冷却至室温后，超声探头作用15min使其分散，并采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，过滤后再超滤离心去除沉淀，对上层绿色透明的水溶液进行冷冻干燥20h即得粉状固体；对光热化疗协同纳米载药复合物溶液进行透析，6h换水一次，透析袋的分子量为5000D；透析后再冷冻干燥即得纳米载药复合物。
实施例3
本实施例为用于鼻咽癌光热化疗协同的药物组合物的一种实施例，本实施例所述药物组合物包含以下重量份的组分：药物载体20份、5-氟尿嘧啶5份、吲哚菁绿5份。
本实施例所述药物载体的制备方法同实施例1。
所述药物组合物的制备方法包括以下步骤：将5mg 5-氟尿嘧啶、20mg PCL-b-p(MEO2MA-co-HMAM)共聚物和5mg吲哚菁绿溶解于5mL三氯甲烷中，混匀后超声10min，水浴至70℃并真空旋转蒸发直至三氯甲烷挥发完；冷却至室温后，超声探头作用15min使其分散，并采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，过滤后再超滤离心去除沉淀，对上层绿色透明的水溶液进行冷冻干燥20h即得粉状固体；对光热化疗协同纳米载药复合物溶液进行透析，6h换水一次，透析袋的分子量为5000D；透析后再冷冻干燥即得纳米载药复合物。
实施例4
本实施例为一种用于化疗的药物组合物，所述药物组合物包含药物载体5重量份和5-氟尿嘧啶2重量份。
本实施例所述药物载体的制备方法同实施例1。
所述药物组合物的制备方法包括以下步骤：将20mg 5-氟尿嘧啶和50mg PCL-b-p(MEO2MA-co-HMAM)共聚物溶解于5mL三氯甲烷中，混匀后超声10min，水浴至70℃并真空旋转蒸发直至三氯甲烷挥发完；冷却至室温后，超声探头作用15min使其分散，并采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，过滤后再超滤离心去除沉淀，对上层绿色透明的水溶液进行冷冻干燥20h即得粉状固体，即为所述药物组合物。
采用动态激光光散射仪测定粒子的粒径分布，实验结果如图2所示，多分散性为0.136，平均粒径为115.9nm，粒子呈球形，分散比较均匀。
实施例5
本实施例为一种用于热疗的药物组合物，所述药物组合物包含药物载体5重量份和吲哚菁绿2重量份。
本实施例所述药物载体的制备方法同实施例1。
本实施例所述药物组合物的制备方法包括以下步骤：将50mg PCL-b-p(MEO2MA-co-HMAM)共聚物和20mg吲哚菁绿溶解于5mL三氯甲烷中，混匀后超声10min，水浴至70℃并真空旋转蒸发直至三氯甲烷挥发完；冷却至室温后，超声探头作用15min使其分散，并采用孔径为0.22μm的滤膜进行过滤，过滤后再超滤离心去除沉淀，对上层绿色透明的水溶液进行冷冻干燥20h即得粉状固体，即为所述药物组合物。
采用动态激光光散射仪测定粒子的粒径分布，实验结果如图3所示，多分散性为0.147，平均粒径为157.2nm，粒子呈球形，分散比较均匀。
实施例6
将实施例1分为三组，各取5mL所述药物组合物密封在透析袋中，放入50mL的离心管中，加入50mL PBS(0.1M，pH 7.4)缓冲溶液进行释药实验，第一组条件为37℃水浴(实施例1+37℃水浴)，第二组为45℃水浴(实施例1+45℃水浴)，第三组分别在1h、7h和13h施加5分钟808nm近红外激光辐照(实施例1+laser)，摇床转速为150rpm。每隔一段时间用移液枪取出2mL透析液测试，为了保持释放体系溶液总体积不变，再立即向其中补加2mL新鲜的PBS缓冲溶液。待释药24h后，通过紫外-可见光分光光度仪来测定药物释放量，实验结果如图4所示，第三组(实施例1+laser)所述药物组合物中5-氟尿嘧啶累计释放率高于第二组(实施例1+45℃水浴)和第一组(实施例1+37℃水浴)，说明定时所述光热化疗协同纳米材料在定时激光辐照的药物释放性能良好，且优于水浴加热和常温条件。
通过对鼻咽癌细胞CNE2的MTT实验来测定实施例1、实施例4和实施例5所述药物组合物的细胞毒性，将CNE2细胞接种到96孔细胞培养板上，使得每孔上含有5000个细胞，每个孔体积为200μL，将细胞放置在37℃的含有5％的CO2的200μLDMEM培养基培育24小时，使细胞贴壁生长。实施例1和实施例5所述药物组合物培育2小时后照射808nm近红外光5分钟。用浓度范围为10-1000μg/mL的纳米复合物溶液再培养24小时，同时加入与样品相同体积的DMSO作为空白对照组。将500mg的MTT溶于100mL的磷酸缓冲溶液，经过滤除菌在零下20℃避光保存配制出的MTT溶液，加入20μL的MTT溶液继续培育4小时，吸出培养液，将其溶解于150mL的DMSO中，将孔板放在摇床上震荡1个小时使细胞均匀。使用酶标仪在波长450nm处测量各孔的吸光度，测出纳米复合物的吸光度和空白对照组的吸光度。纳米复合物对于CNE2细胞的细胞活性可以通过公式得出：
细胞活性(％)＝(实验组的吸光度值/空白组的吸光度值)*100％
鼻咽癌细胞CNE2的细胞活性随实施例1、实施例4和实施例5所述药物组合物的浓度的变化曲线如图5所示。从图5可以看出，实施例1所述药物组合物对CNE2的细胞抑制作用显著高于实施例4和实施例5所述药物组合物，说明外加近红外激光的热化疗的体外治疗作用优于化疗治疗(实施例4)和热疗治疗(实施例5)。
实施例7
测试实施例1制得的药物载体(聚己内酯-b-2-甲基-2-丙烯酸-2-(2-甲氧基乙氧基)乙酯-co-N-羟甲基丙烯酰胺嵌段共聚物(PCL-b-(MEO2MA-co-HMAM)))水溶液(1mg/mL)在不同温度下测得的紫外透光率，取透光率变化区间切线中点为临界相转变温度LCST。测试结果见图6。从图6可以看出，临界相转变温度LCST约为37℃。
最后所应当说明的是，以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非对本发明保护范围的限制，尽管参照较佳实施例对本发明作了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的实质和范围。