具体实施方式

下文将结合附图和具体实施例来进一步阐述本发明。应当理解的是，这些实施例仅用于解释和说明本发明中的技术方案，而并非旨在限制本发明的范围。此外，除非另有说明，下列实施例中所使用的材料、试剂、仪器等均可通过商业手段获得；具体制备方法与测试方法都为本领域常规方法。

本发明构建、合成肿瘤锚定型诊疗一体化的步骤如下：

叔丁氧羰基-芴甲氧羰基-赖氨酸在含三氟乙酸的二氯甲烷溶液中脱保护后与3-(2-呋喃)丙酸反应得到化合物1，化合物1利用与N-羟基琥珀酰亚胺和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐活化羧基后与环肽cRGD反应，得到化合物2，化合物2，在含有哌啶的N,N-二甲基甲酰胺溶液中脱保护得到化合物3，化合物3与Cy 7 SE反应，得到锚定型分子探针f-CR。

环肽cRGD与Cy 7 SE反应，得到对照组探针CR。

利用上述新型锚定型分子探针进行长时间荧光活体成像的方法，包括以下步骤，首先将亚甲基蓝（MB）预先瘤内注射，随后将新型锚定型分子探针f-CR和对照组CR的水溶液尾静脉注射入荷瘤小鼠的体内，麻醉状态下观察不同时间点活体荧光，光声成像效果。

利用上述将新型锚定型分子探针f–CR和对照组CR的水溶液，分别与肿瘤细胞共孵育并在不同时间点观察肿瘤细胞内荧光强度。

利用上述将新型锚定型分子探针f–CR和对照组CR的水溶液，分别与肿瘤细胞共孵育48 h后观察肿瘤细胞的凋亡情况。

利用上述新型锚定型分子探针进行体内肿瘤抑制实验的方法，包括以下步骤，首先将亚甲基蓝预先瘤内注射，随后将所述新型锚定型分子探针f-CR和对照组CR的水溶液尾静脉注射入荷瘤小鼠的体内，1 h后给予光照连续观察记录肿瘤抑制情况。

（1）新型肿瘤锚定型诊疗一体化探针的活体荧光成像：

将MB（浓度：0.1 μM，体积：50 μL）瘤内注射0.5小时后，将上述获得的实验组探针f–CR和对照组探针CR分别溶于PBS溶液中（浓度：100 μM，体积：200 μL），以尾静脉注射的方式将探针注入荷瘤（4T1小鼠乳腺癌）的BALB/c雌鼠体内，随后置于小动物活体光学成像系统/IVIS Spectrum(PerkinElmer)，并于1小时后给予肿瘤部位光照（660 nm 50 mW/cm² 3min），实时观察成像效果，最终通活体成像分析软件计算小鼠的肿瘤部位在不同时间点的荧光强度。

（2）新型肿瘤锚定型诊疗一体化探针的活体光声成像：

将MB（浓度：0.1 μM，体积：50 μL）瘤内注射0.5小时后，将上述获得的实验组探针f–CR和对照组探针CR分别溶于PBS溶液中（浓度：100 μM，体积：200 μL），以尾静脉注射的方式将探针注入荷瘤（4T1小鼠乳腺癌）的BALB/c雌鼠体内，同时打开小动物光声断层扫描成像系统，待光声成像仪水浴池中的水温达37℃时，放入麻醉好的小鼠，扫描小鼠的肿瘤部位图像。并于1小时后给予肿瘤部位光照（660 nm，50 mW/cm²，3 min），实时观察成像效果，最终通活体成像分析软件计算小鼠的肿瘤部位在不同时间点的荧光强度。之后将获得的光声成像数据使用MSOT InSight/inVision分析软件进行重建分析。

（3）新型肿瘤锚定型诊疗一体化探针的肿瘤抑制实验：

将左右双侧背部荷瘤（4T1小鼠乳腺癌）的BALB/c雌性小鼠（肿瘤体积约20 mm³）随机分成3组（n＝5）：尾静脉注射PBS（10 mM, 200 μL）的小鼠左侧肿瘤（第1组，简写PBS），660nm激光照射处理的右侧肿瘤（第2组，简写PBS+660 nm）；仅尾静脉注射CR（200 μM, 200 μL）并预先瘤内注射MB（浓度：0.1 μM，体积：50 μL）左侧肿瘤（第3组，简写CR+MB），右侧肿瘤预先瘤内注射MB（浓度：0.1 μM，体积：50 μL）并660 nm激光照射处理的小鼠（第4组，简写CR+MB+660 nm）；尾静脉注射f–CR（200 μM, 200 μL）并预先瘤内注射MB（浓度：0.1 μM，体积：50μL）左侧肿瘤（第3组，简写f–CR+MB），右侧肿瘤预先瘤内注射MB（浓度：0.1 μM，体积：50 μL）并660 nm激光照射处理的小鼠（第4组，简写f–CR+MB+660 nm）。治疗后，每隔一天记录小鼠肿瘤体积变化并绘制小鼠存活率曲线。

实施例1：新型肿瘤锚定型诊疗一体化探针CR和f–CR合成

合成化合物1：Boc-Lys (Fmoc)-OH (0.5 g, 1.07 mmol)溶解于二氯甲烷10 mL同时加入三氟乙酸2 mL在室温下搅拌10 min脱去BOC，随后收集产物，随后加入3-(2-呋喃)丙酸(0.2 g, 1.43 mmol)、1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(0.82 g, 1.43mmol)和N-羟基琥珀酰亚胺(0.2 g, 1.71 mmol)于室温搅拌4 h后加入N,N-二异丙基乙胺(5 μL) 继续反应3 h。反应结束后用乙酸乙酯萃取三次再浓缩，随后通过硅胶柱洗脱得到纯产物化合物1（0.56 g, 80%）。C₂₈H₃₀N₂O₆ ([M+H]⁺): 489.2021, found ESI-MS: m/z489.2031；

化合物2合成：cRGD (10 mg, 16.57 μmol) and 1 (19.47 mg, 33.13 μmol)溶解于DMF(5 mL)在0℃搅拌10 min随后同时缓慢加入DIPEA (2 μL)。室温反应两小时后收集产物利用制备型HPLC分离产物得到产物化合物2 C₅₅H₆₉N₁₁O₁₂ ([M-H]^-): 1076.5190, foundESI-MS: m/z 1076.5187；

化合物3合成：化合物2 (10 mg, 9.29 μmol) 溶解于 DMF/二乙胺 (6 mL, 5:1,v/v) 溶液中室温反应1 h。浓缩粗产物后利用制备型HPLC分离产物得到产物化合物3。C₄₀H₅₉N₁₁O₁₀ ([M-H]^-): 852.4374, found ESI-MS: m/z 852.4370；

化合物f–CR合成：化合物3 (5 mg, 5.86 μmol), Cy7-SE (4.24 mg, 5.86 μmol)溶解于DMF（2 mL）中在0℃搅拌10 min同时滴加到反应体系中，恢复室温继续反应2 h后利用制备型HPLC分离样品得到终产物。C₇₅H₉₉N₁₃O₁₇S₂ ([M-H]^-): 1516.6651, found ESI-MS:m/z 1516.6664。

对照组化合物CR合成 cRGD (5 mg, 8.27 μmol), Cy7-SE (5.99 mg, 8.27 μmol)溶解于DMF (2 mL)缓慢加入DIPEA于0℃搅拌10 min随后恢复室温继续搅拌2 h收集粗产物，利用制备型HPLC分离得到对照组产物。C₆₂H₈₁N₁₁O₁₄S₂ ([M-H]^-): 1266.5339, foundESI-MS: m/z 1266.5321。

上述反应示意图以及涉及各部产物的化学结构式如图1中的所示。

实施例2：新型肿瘤锚定型诊疗一体化探针的物理化学性质

将实施例1中制得的对照组探针CR和实验组探针f–CR用超纯水稀释至浓度为10 μM（可完全溶解），并使用紫外可见近红外分光光度计及荧光分光光度计测其紫外可见近红外光谱及荧光光谱。如图2（a）（b）所示，结果表明，探针CR和f–CR的最大吸收在747 nm，最大发射在789 nm；同时对照组探针没有发现组装，没有纳米结构，而实验组探针则发现组装成纳米结构，尺寸大于为7.2±0.9 nm左右，如图2（c）（d）。

将实施例1中制得的对照组探针CR和实验组探针f–CR用超纯水稀释至浓度为10 μM，加入定制序列RNA（5`-ACAUCGGGAUAGCGAAGUUGAGAGAGAGGGAG-3`）5 μM，MB 10 μM 混合后于4℃振荡，给予660 nm光照（50 mW/cm²，10分钟）或者不光照（避光），将反应液直接用RNA非变性凝胶电泳分离，如图3b可以发现实验组探针f–CR在加入RNA，MB，并给予光照后能明显的标记上RNA，其他组则没有明显的Cy7的红色荧光。另外将对照组探针CR和实验组探针f–CR加入培养基（HyClone DMEM高糖液体培养基含10%FBS）中，浓度为10 μM，加入MB 0.1 μM，分别加入到4T1细胞中培养6h后，给予660 nm光照（50 mW/cm²，10分钟）或者不光照（避光），随后再用商用RNA染料SYTO™ RNASelect™ green fluorescent cell stain（ThermoFisher）分别染色如图3d，在探针的共定位实验中发现在实验组（f–CR+MB+660 nm）共定位率要大于其他各组；随后通过Trizol法提取出细胞内的总RNA，并通过荧光定量发现实验组（f–CR+MB+660 nm）的荧光强度远大于其他组如图3e；随后通过细胞质&细胞核总提试剂盒提取出细胞质RNA并通过RNA非变性胶分析发现实验组（f–CR+MB+660 nm）具有明显的红色荧光，其他组则没有明显的荧光产生如图3f。

对照组探针CR和实验组探针f–CR加入培养基（HyClone DMEM高糖液体培养基含10%FBS）中，浓度为10 μM，加入MB 0.1 μM，分别加入到4T1细胞中培养6h后，给予660 nm光照（50 mW/cm²，10分钟）或者不光照（避光）观察材料在细胞内滞留的情况，发现实验组（f–CR+MB+660 nm）滞留实验远远大于其它各组如图4a和4b；随后考察探针在小鼠肿瘤内的滞留实验，对照组探针CR和实验组探针f–CR用PBS至浓度为100 Μm 200 μL，提前0.5h将MB（PBS，0.1 μM 50 μL）瘤内注射到小鼠肿瘤内，随后给予尾静脉注射CR或f–CR，在1 h后给予660 nm光照（50 mW/cm²，3分钟）或者不光照（避光），通过IVIS观察探针在个时间点肿瘤内代谢情况如图4c，4d和4e，发现实验组（f–CR+MB+660 nm）在体内的滞留时间远大于其他各组。

对照组探针CR和实验组探针f–CR用PBS至浓度为100 μΜ 200 μL，提前0.5h将MB（PBS，0.1 μM 50 μL）瘤内注射到小鼠肿瘤内，随后给予尾静脉注射CR或f–CR，在1 h后给予660 nm光照（50 mW/cm²，3分钟）或者不光照（避光），同时通过光声成像系统考察各时间点的光声信号变化情况，光声成像数据使用MSOT InSight/inVision分析软件进行重建分析，发现相较于其他组，实验组（f–CR+MB+660 nm）具有长时间的光声信号，图5a和5b；与上述相同的实验方法，在探针注射12 h后将分别将小鼠各主要脏器取出，并将肿瘤组织冰冻切片图5c，所有脏器组织匀浆定量荧光强度图5d，发现实验组（f–CR+MB+660 nm）在肿瘤内的富集量要远大于其他各组。

对照组探针CR和实验组探针f–CR用培养基（HyClone DMEM高糖液体培养基含10%FBS）稀释至浓度为100，50，20，10，1，0.1 μM，加入MB 0.1 μM，分别加入到4T1细胞中培养12h后，发现CR和f–CR均没有明显的毒性如图6a，相同实验条件在给予660 nm光照（50 mW/cm²，3分钟）后继续培养48 h，发现实验组（f–CR+MB+660 nm）展现出一定的细胞毒性如图6b；同时通过Live-dead试剂和细胞明场的形态可以看出实验组（f–CR+MB+660 nm）展现出使得肿瘤细胞凋亡能力。

利用商用GFP-mRNA 2 μM，对照组探针CR和实验组探针f–CR用PBS稀释至浓度为10μM，加入MB 0.1 μM，分别于4℃常规振荡，同时给予660 nm光照（50 mW/cm²，3分钟）或者不光照（避光），随后将各混合溶液通过脂质体转染试剂盒转染至细胞内继续培养24 h，在细胞共聚焦图片下实验组（f–CR+MB+660 nm）展现出GFP在细胞内表达明显下降图6d，收集细胞通过流式细胞仪分析实验组（f–CR+MB+660 nm）展现出GFP表达量的下降如图6e。

肿瘤抑制实验，对照组探针CR和实验组探针f–CR用PBS至浓度为200 μΜ 200 μL，提前0.5h将MB（PBS，0.1 μM 50 μL）瘤内注射到小鼠肿瘤内，随后给予尾静脉注射CR或f–CR，在1 h后给予660 nm光照（50 mW/cm²，3分钟）或者不光照（避光），随后每天量取肿瘤尺寸如图7a，第十三天处死小鼠如图7b，并取下肿瘤如图7c发现，实验组（f–CR+MB+660 nm）具有良好的肿瘤抑制能力，同时相同条件下在第一天取小鼠肿瘤，进行H&E，Tunnel和Caspase-3的免疫组化和免疫荧光分析得到，实验组（f–CR+MB+660 nm）探针能够引起肿瘤组织发生凋亡坏死。

本发明锚定型分子探针利用红光介导的生物交联，用于提高分子在肿瘤组织的滞留时间和抑制肿瘤生长。通过IVIS观察探针在个时间点肿瘤内代谢情况，发现实验组（f–CR+MB+660 nm）在体内的滞留时间远大于其他各组。