具体实施方式

除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本公开所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管与本文所述相似或等同的任何方法和材料可以用于本公开的测试的实践中，但是本文描述了优选的材料和方法。在描述和要求保护本公开时，将使用以下术语。

还应当理解，本文所使用的术语仅用于描述特定实施方式的目的，而不意在限制。

除非上下文中另有明确说明，否则单数形式“一”，“一个”和“该”包括其复数形式。

如在本说明书和权利要求中所使用的，开放式过渡词语“包含”、“包括”、“具有”、“含有”及其变体要求存在指定成分/步骤并允许其它成分/步骤的存在。这些短语也应理解为公开了仅允许指定成分/步骤和不可避免的杂质，并排除其它成分/步骤的封闭式短语“由...组成”或“基本上由...组成”。

本申请的说明书和权利要求书中的数值应理解为包括当保留到相同的有效数时数值相同的值，以及与所限定的数值的差距小于本申请中所描述的常规测量技术会产生的实验误差的值。

本文所公开的所有范围都包括引入的端点值，并可以单独组合。贯穿本公开内容，本公开的各个方面可以以范围格式呈现。应当理解，范围格式的描述仅为了方便和简明，并且不应当解释为是对本公开的范围的硬性限制。因此，范围的描述应当被认为已经明确公开了所有可能的子范围以及该范围内的单独数值。例如，诸如从1至6的范围的描述应当被认为已经明确公开了子范围，例如从1至3、从1至4、从1至5、从2至4、从2至6、从3到6等，以及在所述范围内的单独数值，例如1、2、2.7、3、4、5、5.3和6。无论范围的宽度，上述均适用。

术语“约”可以用于包括在不改变值的基本功能的情况下能够变化的任意数值。当与范围联用时，“约”也公开了由两个端点的绝对值所限定的范围。例如，“从约2至约4”也公开了“从2至4”的范围。术语“约”还可以指给定值±10％。

术语“同一性”指的是一对序列(核苷酸或氨基酸)之间的相似性程度。同一性是通过将相同的残基数除以残基的总数，并且将商乘以100以获得百分比从而进行测定的。评价同一性时缺口不计算在内。因此，完全相同的序列的两个拷贝具有100％的同一性，但是具有缺失、添加或置换的序列可能具有较低程度的同一性。本领域技术人员将认识到有几种计算机程序可以用于确定序列的同一性，例如那些采用诸如BLAST之类的算法的程序。BLAST核苷酸搜索是使用NBLAST程序进行的，并且BLAST蛋白质搜索是利用BLASTP程序进行的，其中使用了各程序的默认参数。

两个不同的序列可以彼此不同，而不影响由该序列编码的蛋白质的整体功能。在这方面，本领域公知的是化学上相似的氨基酸可以相互取代，通常功能不会发生改变。相关性质可以包括酸性/碱性、极性/非极性、电荷、疏水性和化学结构。例如，碱性残基Lys和Arg被认为是化学上相似的，并且经常互相取代，其他例子如酸性残基Asp和Glu、羟基残基Ser和Thr、芳香族残基Tyr、Phe和Trp以及非极性残基Ala、Val、Ile、Leu和Met。这些置换被认为是“保守的”。相似地，核苷酸密码子和可接受的变化在本领域中也是已知的。例如，密码子ACT、ACC、ACA和ACG都编码氨基酸苏氨酸，即第三个核苷酸可以在不改变所得到的氨基酸的情况下进行变化。相似性是通过将相似的残基数除以残基的总数，并且将商乘以100以获得百分比从而进行测定的。注意，相似性和同一性测量的是不同的性质。

如本文所用，术语“对照”或“参考”可互换使用，并且是指用作比较标准的值(例如，健康受试者中DKK2表达水平)。

如本文中使用的“对象/受试者(subject)”或“患者”可以是人或非人哺乳动物。非人哺乳动物包括例如家畜和宠物，例如羊、牛、猪、犬、猫和鼠哺乳动物。优选地，受试者是人。

如本文所用，术语“化合物”包括大分子化合物(例如，抗体)和小分子化合物。

如本文所用，术语“活化/激活(activation)”是指在充分的细胞表面部分连接后诱导明显的生物化学或形态学变化的细胞状态。在T细胞的语境中，这种活化是指已经被充分刺激以诱导细胞增殖的T细胞的状态。T细胞的活化还可以诱导细胞因子产生及调节或细胞溶解效应物功能的发挥。在其它细胞的语境中，该术语推断特定物理化学过程的上调或下调。术语“活化的T细胞”表示目前正在进行细胞分裂、细胞因子产生、调节或细胞溶解效应物功能的发挥，和/或最近经历了“活化”过程的T细胞。

如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”可互换使用，并且是指由通过肽键共价连接的氨基酸残基组成的化合物。蛋白质或肽必须含有至少两个氨基酸，并且没有限制可构成蛋白质或肽序列的氨基酸的最大数目。多肽包括包含通过肽键彼此连接的两个或更多个氨基酸的任何肽或蛋白质。如本文所用，该术语是指短链(其在本领域中通常也称为例如肽、寡肽和寡聚体)以及较长链(其在本领域中通常称为蛋白质，其存在很多类型)二者。“多肽”包括例如生物活性片段、基本上同源的多肽、寡肽、同源二聚体、异源二聚体、多肽变体、修饰的多肽、衍生物、类似物、融合蛋白等。多肽包括天然肽、重组肽、合成肽或其组合。

本文所用的术语“免疫治疗剂”意在包括调节患者免疫系统的任何药剂。“免疫疗法”是指改变患者免疫系统的治疗。

在本公开的上下文中使用的术语“治疗”意在包括用于疾病或病症的治疗性治疗以及预防性或抑制性措施。因此，例如，术语治疗包括在疾病或病症发作之前或之后施用药剂，从而预防或消除疾病或病症的所有征兆。作为另一个实例，在疾病的临床表现后施用药剂以对抗疾病的症状包括疾病的“治疗”。这包括预防癌症。

“DKK蛋白”是指含有一个或多个富含半胱氨酸的结构域的DKK蛋白家族的蛋白质。DKK蛋白家族包括DKK1、DKK2、DKK3和DKK4，以及在序列水平、结构或功能上与这些蛋白质中的一种或多种足够相关的任何其它蛋白质。这种蛋白家族描述于例如Krupnik等人(1999)Gene 238:301中。此定义也包括DKK蛋白的等位基因变体和突变体，例如本文所述的那些。

非人(例如，鼠)抗体的“人源化”形式是嵌合免疫球蛋白，嵌合免疫球蛋白的免疫球蛋白链或片段(例如Fv、Fab、Fab’、F(ab’)2或抗体的其它抗原结合子序列)，其包含源自非人免疫球蛋白的最小序列。大多数情况下，人源化抗体是人免疫球蛋白(受体抗体)，其中来自受体的互补决定区(CDR)的残基被具有期望的特异性、亲和力和容量(capacity)的来自非人物种(供体抗体)例如小鼠、大鼠或兔的CDR的残基替换。在一些情况下，人免疫球蛋白的Fv框架区(FR)残基被相应的非人残基替换。另外，人源化抗体可以包括在受体抗体以及在输入的CDR和框架序列中均未发现的残基。进行这些修饰以进一步改善和优化抗体性能。一般而言，人源化抗体将包括基本上所有至少一个并且通常两个可变域，其中所有或基本上所有CDR区对应于非人免疫球蛋白的那些并且所有或基本上所有FR区是人免疫球蛋白序列的那些。人源化抗体最佳地还将包括免疫球蛋白恒定区(Fc)的至少部分，通常人免疫球蛋白的Fc。对于进一步的细节，参见Jones等人,Nature,321:522-525,1986；Reichmann等人,Nature,332:323-329,1988；Presta,Curr.Op.Struct.Biol.,2:593-596,1992。

本文所用的术语“癌症”包括任何恶性肿瘤，包括但不限于癌、肉瘤。癌症起因于细胞的不受控制和/或异常的分裂，然后侵入并破坏周围组织。如本文所用，“增殖”是指经历有丝分裂的细胞。如本文所用，“转移”是指恶性肿瘤从其起源处向远处扩散。癌细胞可通过血流、通过淋巴系统、穿过体腔或其任何组合转移。

如本文所用，术语“药物组合物”是指在本公开中有用的至少一种化合物与其它化学组分例如载体、稳定剂、稀释剂、分散剂、悬浮剂、增稠剂和/或赋形剂的混合物。药物组合物有助于将该化合物施用至生物体。本领域中存在施用化合物的多种技术，包括但不限于：静脉内、经口(oral)、气雾剂、肠胃外、眼部、肺部和局部施用。

术语“药学上可接受的载体”包括药学上可接受的盐、药学上可接受的材料、组合物或载体，例如液体或固体填充剂、稀释剂、赋形剂、溶剂或封装材料，其涉及在受试者内携带或输送本公开的(一种或多种)化合物或携带或输送本公开的(一种或多种)化合物至受试者，使得其可以执行其预期功能。通常，此类化合物从身体的一个器官或部分携带或输送至身体的另一器官或部分。每种盐或载体在与制剂的其它成分相容的意义上必须是“可接受的”，并且不对受试者有害。可以用作药学上可接受的载体的材料的一些实例包括：糖，例如乳糖、葡萄糖和蔗糖；淀粉，例如玉米淀粉和马铃薯淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠、乙基纤维素和乙酸纤维素；粉末黄蓍胶；麦芽；明胶；滑石；赋形剂，例如可可脂和栓剂蜡类；油，例如花生油、棉籽油、红花油、芝麻油、橄榄油、玉米油和大豆油；二醇类，例如丙二醇；多元醇，例如甘油、山梨醇、甘露醇和聚乙二醇；酯类，例如油酸乙酯和月桂酸乙酯；琼脂；缓冲剂，例如氢氧化镁和氢氧化铝；藻酸；无热原水；等渗盐水；林格氏溶液；乙醇；磷酸盐缓冲溶液；稀释剂；造粒剂；润滑剂；粘合剂；崩解剂；润湿剂；乳化剂；着色剂；脱模剂；涂层剂；甜味剂；调味剂；加香剂；防腐剂；抗氧化剂；增塑剂；胶凝剂；增稠剂；硬化剂；定型剂；悬浮剂；表面活性剂；保湿剂；载体；稳定剂；和在药物制剂中使用的其它无毒的相容性物质，或其任何组合。如本文所用，“药学上可接受的载体”还包括与化合物的活性相容并且对于受试者是生理上可接受的任何和所有的包衣、抗菌剂和抗真菌剂，以及吸收延迟剂等。补充性活性化合物也可以掺入组合物中。

术语“抗体”是免疫系统用来识别靶抗原的蛋白质。抗体的基本功能单位是免疫球蛋白单体。单体由形成Y形蛋白质的两个相同的重链和两个相同的轻链构成。每条轻链由一个恒定域(constant domain)和一个可变域(variable domain)组成。对于轻链，恒定域也可以被称为“恒定区(constant region)”，而可变域也可以被称为“可变区(variableregion)”。每条重链由一个可变域和三个或四个恒定域组成。对于重链，恒定域一起被称为“恒定区”，而可变域也可以被称为“可变区”。Y的臂被称为片段，抗原结合(Fab)区，每个臂被称为Fab片段。每个Fab片段由来自重链的一个恒定域和一个可变域、以及来自轻链的一个恒定域和一个可变域组成。Y的基部称为Fc区，由来自每个重链的两个或三个恒定域组成。在Fab区中的重链和轻链的可变域是抗体的结合抗原(如本公开中的DKK2)的部分。更具体地，可变域的互补决定区(CDR)结合它们的抗原(如DKK2)。在每个可变域的氨基酸序列中，有非连续的三个CDR。术语“完整”在本文中用于指包含Fab区和Fc区的抗体。

本文所用的“抗体重链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中的较大者，并且其通常决定抗体所属的类别。

本文所用的“抗体轻链”是指以其天然存在的构象存在于抗体分子中的两种类型多肽链中的较小者。κ和λ轻链是指两种主要的抗体轻链同种型。

本文使用的术语“抗原”或“Ag”定义为引发免疫应答的分子。这种免疫应答可涉及抗体产生，或特异性免疫活性细胞的活化，或涉及二者。技术人员将理解，任何大分子，包括实际上所有的蛋白质或肽，可以用作抗原。此外，抗原可以衍生自重组或基因组DNA。技术人员将理解，包含编码引发免疫应答的蛋白质的核苷酸序列或部分核苷酸序列的任何DNA因此编码如本文所使用的术语“抗原”。此外，本领域技术人员将理解，抗原不需要仅由基因的全长核苷酸序列编码。明显的是，本公开包括但不限于使用多于一个基因的部分核苷酸序列，并且这些核苷酸序列以各种组合排列以引发期望的免疫应答。此外，技术人员将理解，抗原根本不需要由“基因”编码。明显的是，抗原可以是合成的或可以源自生物学样品。这样的生物学样品可以包括但不限于组织样品、肿瘤样品、细胞或生物流体。

免疫系统在激活和抑制之间达到平衡。逃避免疫监视是肿瘤形成的先决条件之一。肿瘤逃避免疫监视的方法之一是产生升高量的免疫抑制分子。多年来已经确定了越来越多的免疫抑制分子和机理。已经表明这些免疫抑制分子的中和在治疗各种恶性肿瘤中是有效的。

本公开涉及抑制自然杀伤(NK)细胞和CD8⁺细胞毒性T淋巴细胞(CTL)活性的DKK2的发现。DKK2是一种分泌蛋白，其能够抑制β-联蛋白介导的Wnt信号传导，改变非β-联蛋白介导的Wnt活性，并且还可以具有Wnt非依赖性功能。DKK2在许多组织中表达，并在人结肠直肠癌、胃肠癌、肝癌、肾癌和胰腺癌中上调。下面描述的实验证据表明抗DKK2抗体是用于治疗其中表达DKK2的癌症的关键免疫调节剂。因此DKK2是治疗这些癌症的有希望的靶标。

在一些实施方式中，抗DKK2抗体可以是人源化的，其中修饰抗体的特定序列或区域以增加与在人中天然产生的抗体的相似性。例如，在本公开中，抗体或其片段可以包括非人哺乳动物scFv。在一个实施方式中，抗原结合结构域部分是人源化的。

可以使用本领域已知的各种技术产生人源化抗体，包括但不限于CDR-移植(参见，例如，欧洲专利号EP 239,400；国际公布号WO 91/09967；和美国专利号5,225,539、5,530,101和5,585,089，其中每个均通过引用以其全部并入本文)、覆盖(veneering)或表面重建(resurfacing)(参见，例如，欧洲专利号592,106和EP 519,596；Padlan,1991,MolecularImmunology,28(4/5):489-498；Studnicka等人,1994,Protein Engineering,7(6):805-814；和oguska等人,1994,PNAS,91:969-973，其中每个均通过引用以其全部并入本文)、链改组(chain shuffling)(参见，例如，美国专利号5,565,332，其通过引用以其全部并入本文)、和在如下中公开的技术，例如，美国专利申请公布号US2005/0042664、美国专利申请公布号US2005/0048617、美国专利号6,407,213、美国专利号5,766,886、国际公布号WO9317105、Tan等人,J.Immunol.,169:1119-25(2002),Caldas等人,Protein Eng.,13(5):353-60(2000),Morea等人,Methods,20(3):267-79(2000),Baca等人,J.Biol.Chem.,272(16):10678-84(1997),Roguska等人,Protein Eng.,9(10):895-904(1996),Couto等人,Cancer Res.,55(23Supp):5973s-5977s(1995),Couto等人,Cancer Res.,55(8):1717-22(1995),Sandhu J S,Gene,150(2):409-10(1994)以及Pedersen等人,J.Mol.Biol.,235(3):959-73(1994)，其中每个均通过引用以其全部并入本文。通常，框架区中的框架残基将被置换为来自CDR供体抗体的相应的残基以变更、优选地改进抗原结合。通过本领域熟知的方法鉴定这些框架置换，例如，通过对CDR和框架残基的相互作用进行建模以鉴定对抗原结合重要的框架残基以及通过序列比较以鉴定在特定位置处不寻常的框架残基(参见，例如，Queen等人,U.S.Pat.No.5,585,089；和Riechmann等人,1988,Nature,332:323，其通过引用以其全部并入本文)。

人源化抗体具有从非人来源引入其中的一个或多个氨基酸残基。这些非人氨基酸残基通常被称为“输入”残基，其通常取自“输入”可变域。因此，人源化抗体包括来自非人免疫球蛋白分子的一个或多个CDR和来自人的框架区。抗体的人源化是本领域熟知的，并且可以基本上遵循Winter与合作者的方法进行(Jones等人,Nature,321:522-525(1986)；Riechmann等人,Nature,332:323-327(1988)；Verhoeyen等人,Science,239:1534-1536(1988))，这通过将啮齿动物CDR或CDR序列置换为相应的人抗体序列，即CDR-移植(EP 239,400；PCT公布号WO 91/09967；和美国专利号4,816,567；6,331,415；5,225,539；5,530,101；5,585,089；6,548,640，其内容通过引用以其全部并入本文)。在这样的人源化嵌合抗体中，大幅小于完整人可变域已经被置换为来自非人物种的相应的序列。实际上，人源化抗体通常是其中一些CDR残基和可能的一些框架(FR)残基被置换为来自啮齿动物抗体中的类似位点的残基的人抗体。抗体的人源化也可以通过覆盖或表面重建(EP 592,106；EP 519,596；Padlan,1991,Molecular Immunology,28(4/5):489-498；Studnicka等,ProteinEngineering,7(6):805-814(1994)；以及Roguska等,PNAS,91:969-973(1994))或链改组(美国专利号5,565,332)实现，其内容通过引用以其全部并入本文。

用于制备人源化抗体的人可变域(轻链可变域和重链可变域二者)的选择是为了降低抗原性。根据所谓的“最佳拟合”方法，啮齿动物抗体的可变域的序列针对已知的人可变域序列的整个文库进行筛选。最接近于啮齿动物的人序列然后被接受为用于人源化抗体的人框架(FR)(Sims等人,J.Immunol.,151:2296(1993)；Chothia等人,J.Mol.Biol.,196:901(1987)，其内容通过引用以其全部并入本文)。另一种方法使用源自特定的轻链或重链亚组的所有人抗体的共有序列的特定框架。相同的框架可以用于数种不同的人源化抗体(Carter等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89:4285(1992)；Presta等人,J.Immunol.,151:2623(1993)，其内容通过引用以其全部并入本文)。

抗体可以被人源化，同时保留对靶抗原的高亲和力以及其它有利的生物学性质。根据本公开的一个方面，人源化抗体通过使用亲本和人源化序列的三维模型分析亲本序列和各种概念性人源化产物的方法来制备。三维免疫球蛋白模型普遍可用并且是本领域技术人员熟悉的。图解和展示选择的候选免疫球蛋白序列的可能的三维构象结构的计算机程序是可获得的。检查这些展示允许对残基在候选免疫球蛋白序列的功能中的可能作用的分析，即，对影响候选免疫球蛋白结合靶抗原的能力的残基的分析。以此方式，FR残基可以从受体和输入序列选择和组合，使得能够实现期望的抗体特性，比如对靶抗原的增加的亲和力。一般而言，CDR残基直接地和最实质性地参与影响抗原结合。

人源化抗体保留与原始抗体相似的抗原特异性。然而，使用某些人源化方法时，可以使用“定向进化”的方法增加抗体对靶抗原的结合亲和力和/或特异性，如由Wu等人,J.Mol.Biol.,294:151(1999)描述的，其内容通过引用以其全部并入本文。

本公开的抗体可以通过本领域已知的任何方法评估免疫特异性结合。可使用的免疫测定包括但不限于使用以下技术的竞争性和非竞争性测定系统：例如，蛋白质印迹、放射免疫测定、ELISA(酶联免疫吸附测定)、“夹心”免疫测定、免疫沉淀测定、沉淀素反应、凝胶扩散沉淀素反应、免疫扩散测定、凝集测定、补体固定测定、免疫放射测定、荧光免疫测定、蛋白A免疫测定，仅举几个例子。此类测定是常规的并且是本领域熟知的(参见，例如，Current Protocols in Molecular Biology,(Ausubel等人,编),Greene PublishingAssociates and Wiley-Interscience,New York,2002)。

在一些实施方式中，本公开涉及一种特异性地结合人DKK2蛋白的抗体，其包含含有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及含有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：

(a)CDRH1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(b)CDRH2具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

(c)CDRH3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

(d)CDRL1具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

(e)CDRL2具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；且

(f)CDRL3具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗体的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRLH2、CDRL3分别具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗体的CDRH1、CDRH2、CDRH3、CDRL1、CDRLH2、CDRL3分别具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:6、SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列，且所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列，且所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，且所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区包含SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，且所述抗体的重链可变区包含SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列，且所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区具有SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列，且所述抗体的重链可变区具有SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗体的轻链可变区和/或重链可变区是单链可变片段(scFv)、F(ab’)₂片段、Fab或Fab’片段、双价抗体、三价抗体、四价抗体或单克隆抗体的部分。

scFv包括轻链可变区和重链可变区，通常通过连接基团接合在一起，该连接基团通常的长度为约10至约25个氨基酸(虽然它不必一定在此范围内)。一个可变域的N-末端被连接到其它可变域的C末端。如果期望的话，所述scFv可以被PEG化(用聚乙二醇)，以增加其大小，像赛妥珠单抗(certolizumab pegol)那样。两个scFv可以利用另一连接基团接合在一起，以产生串联scFv。

如果轻链可变区和重链可变区通过短的连接基团接合在一起以形成scFv，那么这两个可变域不能折叠在一起，scFv将发生二聚化以形成二价抗体。甚至更短的连接基团可导致形成三聚体(即，三价抗体)和四聚体(即，四价抗体)。

完整单克隆抗体由两条重链和两条轻链形成。再次，每条轻链和每条重链均包含可变域。每条轻链与重链结合。两条重链在铰链区接合在一起。如果去除铰链区以下的重链恒定区，则产生了包含总共四个可变域的F(ab’)₂片段。该F(ab’)₂片段可以被分成两个Fab’片段。Fab’片段包含来自铰链区的巯基。当去除铰链区以上的重链恒定区时，形成Fab片段，其不包含来自铰链区的巯基。然而，所有这些片段都包含轻链可变区和重链可变区。

在一些实施方式中，本公开的抗体是由上述具有可变区/域的轻链和重链与人恒定区组合形成的完整单克隆抗体。重链恒定区可以是任何人类同种型，包括IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM，优选地IgG4。人轻链恒定区可以是κ或λ同种型，优选地κ同种型。在一些实施方式中，重链恒定区是IgG4同种型，且轻链恒定区是κ同种型。

在一些实施方式中，所述抗体的轻链包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链具有SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗体的重链包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的重链包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的重链包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的重链具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的重链具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，所述抗体的轻链包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列或与SEQID NO:9所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列，且所述抗体的重链包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列，且所述抗体的重链包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列或与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链包含SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列，且所述抗体的重链包含SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链包含SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，且所述抗体的重链包含SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链具有SEQID NO:9所示的氨基酸序列，且所述抗体的重链具有SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，所述抗体的轻链具有SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，且所述抗体的重链具有SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

在一个方面，本公开考虑本公开的抗体可以与治疗剂组合使用，所述治疗剂例如抗肿瘤剂，包括但不限于化学治疗剂、免疫治疗剂、抗细胞增殖剂或其任何组合。例如，以下非限制性示例性类别的任何常规化学治疗剂包括在本公开中：烷化剂；亚硝基脲；抗代谢物；抗肿瘤抗生素；植物生物碱；紫杉烷；激素药；和混合式(miscellaneous)药剂。

烷化剂是这样命名的，因为它们能够在细胞中存在的条件下向许多电负性基团添加烷基，从而干扰DNA复制以阻止癌细胞繁殖。大多数烷化剂是细胞周期非特异性的。在具体方面，它们通过交联DNA双螺旋链中的鸟嘌呤碱基来停止肿瘤生长。非限制性实例包括白消安、卡铂、苯丁酸氮芥、顺铂、环磷酰胺、达卡巴嗪、异环磷酰胺、盐酸氮芥、盐酸美沙拉秦、丙卡巴肼、塞替派和尿嘧啶芥。

抗代谢物阻止在细胞周期的合成(S)期期间将碱基并入DNA，从而阻止正常发育和分裂。抗代谢物的非限制性实例包括例如5-氟尿嘧啶、6-巯基嘌呤、卡培他滨、阿糖胞苷、氟尿苷、氟达拉滨、吉西他滨、甲氨蝶呤和硫鸟嘌呤的药物。

抗肿瘤抗生素通常通过干扰细胞分裂所需的酶或通过改变细胞周围的膜来阻止细胞分裂。此类中包括蒽环类，例如多柔比星，其通过破坏DNA的结构并终止其功能来阻止细胞分裂。这些药剂是细胞周期非特异性的。抗肿瘤抗生素的非限制性实例包括阿克拉霉素、放线菌素、安定霉素、重氮丝氨酸、博莱霉素、松节霉素、加利车霉素、卡霉素、卡莫西霉素、卡西林素、色霉素、更生霉素、柔红霉素、地柔红霉素、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸、多柔比星、表柔比星、阿霉素、伊达比星、马赛洛霉素、丝裂霉素、米托蒽醌、霉酚酸、诺加霉素、橄榄霉素、培霉素、紫菜霉素、嘌呤霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链脲菌素、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁、佐柔比星。

植物生物碱抑制或停止有丝分裂或抑制阻止细胞产生细胞生长所需的蛋白质的酶。常用的植物生物碱包括长春花碱、长春新碱、长春地辛和长春瑞滨。然而，本公开不应被解释为仅限于这些植物生物碱。

紫杉烷影响在细胞功能中是重要的称为微管的细胞结构。在正常的细胞生长中，当细胞开始分裂时形成微管，但是一旦细胞停止分裂，则微管被分解或破坏。紫杉烷阻止微管分解，使得癌细胞变得如此被微管堵塞，以致它们不能生长和分裂。非限制性的示例性紫杉烷包括紫杉醇和多西紫杉醇。

激素剂和类激素药物用于某些类型的癌症，包括例如白血病、淋巴瘤和多发性骨髓瘤。它们常常与其它类型的化学疗法药物一起使用以增强其有效性。性激素用于改变雌性或雄性激素的作用或产生，并用于减缓乳腺癌、前列腺癌和子宫内膜癌的生长。抑制这些激素的产生(芳香酶抑制剂)或作用(他莫昔芬)通常可用作治疗的辅助。一些其它肿瘤也是激素依赖性的。他莫昔芬是激素剂的非限制性实例，其干扰促进乳腺癌细胞生长的雌激素的活性。

混合式药剂包括化学治疗剂，例如博莱霉素、羟基脲、L-天冬酰胺酶和丙卡巴肼。

化学治疗剂的其它实例包括但不限于以下及其药学上可接受的盐、酸和衍生物：氮芥例如苯丁酸氮芥、氯氮平、氯磷酰胺、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥、盐酸氮芥氧化物、美法仑、新恩比兴、苯芥胆甾醇、泼尼氮芥、曲洛磷胺、尿嘧啶芥子；亚硝基脲例如卡莫司汀、氯卓卡星、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；嘌呤类似物例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、硫柳宁、硫鸟嘌呤；嘧啶类似物例如阿扎他滨、阿扎胞苷、6-氮尿嘧啶、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、脱氧氟尿苷、依诺他滨、氟尿苷、5-FU；雄激素例如卡鲁斯特、丙酸色丙酸托烷酯、表薄甾烷醇、美雄烷、睾内酯；抗肾上腺药例如氨鲁米特、米托坦、曲洛司坦；叶酸补充剂例如亚叶酸；醋葡醛内酯；醛磷酰胺糖苷；氨基乙酰丙酸；安吖啶；贝伐单抗；比生群；依达曲沙；地磷酰胺(defofamine)；地美可辛；地吖醌；依洛尼塞；依利醋铵(elliptiniumacetate)；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明；米托胍腙；米托蒽醌；莫匹达莫；硝唑兰；喷司他丁；苯来美特；吡柔比星；鬼臼酸；2-乙基肼；丙卡巴肼；[email protected]雷佐生；西佐呋喃；锗螺胺；丝裂酸；三唑酮；2,2′,2″-三氯三乙胺；氨基甲酸乙酯；长春地辛；达卡巴嗪；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；哌泊溴烷；gacytosine；阿糖胞苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替哌；紫杉烷，例如太平洋紫杉醇(TAXOLO,Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton,N.J.)和多西他赛(TAXOTERE,Rhone-Poulenc Rorer,Antony,France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨；6-硫鸟嘌呤；巯基嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物例如顺铂和卡铂；长春花碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；丝裂霉素C；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨；诺维本；诺安托；替尼泊苷；道诺霉素；氨基蝶呤；塞罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；视黄酸；埃斯波霉素；和卡培他滨。

抗细胞增殖剂可以进一步定义为凋亡诱导剂或细胞毒性剂。凋亡诱导剂可以是颗粒酶、Bcl-2家族成员、细胞色素C、半胱天冬酶或其组合。示例性颗粒酶包括颗粒酶A、颗粒酶B、颗粒酶C、颗粒酶D、颗粒酶E、颗粒酶F、颗粒酶G、颗粒酶H、颗粒酶I、颗粒酶J、颗粒酶K、颗粒酶L、颗粒酶M、颗粒酶N或其组合。在其它具体方面，Bcl-2家族成员是例如Bax、Bak、Bcl-Xs、Bad、Bid、Bik、Hrk、Bok或其组合。

在另外的方面，半胱天冬酶为半胱天冬酶-1、半胱天冬酶-2、半胱天冬酶-3、半胱天冬酶-4、半胱天冬酶-5、半胱天冬酶-6、半胱天冬酶-7、半胱天冬酶-8、半胱天冬酶-9、半胱天冬酶-10、半胱天冬酶-11、半胱天冬酶12、半胱天冬酶-13、半胱天冬酶-14或其组合。在具体方面，细胞毒性剂是TNF-α、白树毒素、灵杆菌素、核糖体抑制蛋白(RIP)、假单胞菌外毒素、艰难梭菌毒素B(Clostridium difficile Toxin B)、幽门螺杆菌VacA、小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolitica)YopT、紫色杆菌素(Violacein)、二亚乙基三胺五乙酸、伊洛福芬(irofulven)、白喉毒素、米托洁林(mitogillin)、蓖麻毒素、肉毒杆菌毒素、霍乱毒素、皂草素6或其组合。

免疫治疗剂可以是但不限于白细胞介素-2或其它细胞因子，程序性细胞死亡蛋白1(PD-1)信号传导的抑制剂，例如结合PD-1的单克隆抗体，易普利姆玛。免疫治疗剂还可以阻断细胞毒性T淋巴细胞相关抗原A-4(CTLA-4)信号传导，并且其还可以涉及癌症疫苗和基于树突状细胞的疗法。

免疫治疗剂还可以是通过细胞因子治疗或通过过继细胞疗法和/或通过造血干细胞移植转移外源细胞而被活化和扩增的NK细胞。适合于过继细胞疗法的NK细胞可以源自不同来源，包括自体NK细胞的离体扩增，来自外周血的未刺激或扩增的同种异体NK细胞，来自外周血和脐带血的CD34+造血祖细胞，和NK细胞系。表达嵌合抗原受体或细胞因子的遗传修饰的NK细胞也包括在本公开中。用于本公开的另一种免疫治疗剂是基于过继T细胞疗法(ACT)的药剂，其中向患者施用肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL)。施用的T细胞可以被遗传工程化以表达肿瘤特异性抗原受体，例如以非主要组织相容性(MHC)限制的方式识别细胞表面抗原的嵌合抗原受体(CAR)；或者它们可以是传统的αβTCR，其识别由MHC分子呈递的细胞内抗原的表位。

在一些实施方式中，本公开涉及一种DNA分子，其编码本公开所述的抗体的重链和/或轻链。在一些实施方式中，本公开涉及一种DNA分子，其编码SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本公开涉及一种DNA分子，其编码SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本公开涉及一种DNA分子，其编码SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本公开涉及一种DNA分子，其编码SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本公开涉及一种DNA分子，其编码SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列和SEQID NO:11所示的氨基酸序列。在一些实施方式中，本公开涉及一种DNA分子，其编码SEQ IDNO:13所示的氨基酸序列和SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列。

在一些实施方式中，本公开涉及一种药物组合物，其包含本公开所述的抗体以及药学上可接受的载体。

在一些实施方式中，药物组合物包括药学上可接受的载体。该载体充当用于递送抗体的媒介。药学上可接受的载体的实例包括抗体可以溶解或悬浮于其中的液体载体(如水、油和醇类)。

药物组合物还可以包括赋形剂。具体的赋形剂包括缓冲剂、表面活性剂、防腐剂、填充剂、聚合物和稳定剂，它们可与所述抗体一起使用。缓冲剂用于控制组合物的pH值。表面活性剂用于稳定蛋白质、抑制蛋白质聚集、抑制蛋白质吸附到表面上，并协助蛋白质重折叠。示例性的表面活性剂包括吐温80、吐温20、Brij 35、Triton X-10、PluronicF127和十二烷基硫酸钠。防腐剂用于抑制微生物生长。防腐剂的实例包括苯甲醇、间甲酚和苯酚。在冻干过程中使用填充剂，从而增加体积。亲水性聚合物(如葡聚糖、羟乙基淀粉、聚乙二醇、明胶)可用于稳定蛋白质。具有非极性部分的聚合物(如聚乙二醇聚合物)也可以用作表面活性剂。蛋白稳定剂可包括多元醇类、糖类、氨基酸类、胺类和盐类。合适的糖类包括蔗糖和海藻糖。氨基酸类包括组氨酸、精氨酸、甘氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、赖氨酸、谷氨酸，以及它们的混合物。如人血清白蛋白之类的蛋白质也可以竞争性地吸附到表面上，并且降低抗体的聚集。应当注意的是，特定的分子可用于多种目的。例如，组氨酸可作为缓冲剂和抗氧化剂。甘氨酸可以用作缓冲剂和填充剂。

在一个实施方式中，可以以0.01-50mg/kg/天的剂量向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以0.1-40mg/kg/天的剂量向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以1-30mg/kg/天的剂量向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以10-20mg/kg/天的剂量向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。

在一个实施方式中，可以以介于1-14天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于1-10天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于1-7天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于1-5天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于1-3天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于2-14天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于2-10天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于2-7天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于2-5天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于2-3天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于3-14天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于3-10天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于3-7天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于3-5天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于5-14天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于5-10天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于5-7天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于7-14天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以介于7-10天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。

在一个实施方式中，可以以0.01-50mg/kg/天的剂量和介于1-14天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以0.1-40mg/kg/天的剂量和介于1-14天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以1-30mg/kg/天的剂量和介于1-14天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。在一个实施方式中，可以以10-20mg/kg/天的剂量和介于1-14天之间的间隔向受试者施用本公开的抗体或药物组合物。

本公开的药物组合物中活性成分、药学上可接受的载体和任何另外的成分的相对量将根据所治疗的对象的身份、大小和状况而变化，并且还取决于施用组合物的途径而变化。举例来说，组合物可以包含在0.1％与100％(w/w)之间的活性成分。

本公开的抗体或药物组合物可适当地开发用于吸入、经口、直肠、阴道、肠胃外、局部、经皮、肺部、鼻内、颊部(buccal)、眼部、鞘内、静脉内或其它施用途径。其它考虑的制剂包括设计的纳米颗粒(projected nanoparticle)、脂质体制品、含有活性成分的重新封装的红细胞，和基于免疫的制剂。施用途径对于本领域技术人员是明显的，并且取决于许多因素，包括所治疗的疾病的类型和严重性、所治疗的兽类或人类患者的类型和年龄等。

本公开的抗体或药物组合物的制剂可以通过药理学领域已知的或以后开发的任何方法制备。通常，这种制备方法包括使活性成分与载体或一种或多种其它辅助成分组合的步骤，然后如果必要或期望，将产品成形或包装成期望的单剂量或多剂量单位。

如本文所用，“单位剂量”是包含预定量的活性成分的药物组合物的离散量。活性成分的量通常等于将施用至受试者的活性成分的剂量或这种剂量的合宜分数，例如这样剂量的一半或三分之一。单位剂型可用于单个日剂量(single daily dose)或多个日剂量(multiple daily doses)之一(例如，每天约1至4次或更多次)。当使用多个日剂量时，对于每个剂量，单位剂型可以相同或不同。

尽管本公开的抗体或药物组合物的描述主要涉及适合于对人进行伦理施用的抗体或药物组合物，但是本领域技术人员应当理解，这样的抗体或药物组合物通常适于施用至各种动物。对适于施用至人的抗体或药物组合物修饰以使该抗体或药物组合物适于施用至各种动物是众所周知的，且普通技术的兽医药理学家可以仅使用普通(如果有的话)实验来设计和进行这种修饰。考虑施用本公开的抗体或药物组合物的对象包括但不限于人和其它灵长类动物、哺乳动物，包括商业上相关的哺乳动物，例如牛、猪、马、绵羊、猫和狗。

在一个实施方式中，使用一种或多种药学上可接受的赋形剂或载体来配制药物组合物。在一个实施方式中，药物组合物包含治疗有效量的人源化的抗DKK2抗体和药学上可接受的载体。可用的药学上可接受的载体包括但不限于甘油、水、盐水、乙醇和其它药学上可接受的盐溶液，例如磷酸盐和有机酸盐。这些和其它药学上可接受的载体的实例描述于Remington’s Pharmaceutical Sciences,1991,Mack Publication Co.,New Jersey中。

载体可以是溶剂或分散介质，包含例如水、乙醇、多元醇(例如甘油、丙二醇和液体聚乙二醇等)、它们适当的混合物以及植物油。恰当的流动性可以被维持，例如通过使用包衣例如卵磷脂，通过在分散体的情况下维持所需的颗粒尺寸，以及通过使用表面活性剂。阻止微生物的作用可以通过各种抗细菌剂以及抗真菌剂，例如对羟苯甲酸酯、三氯叔丁醇、苯酚、抗坏血酸、硫柳汞等等来实现。在许多情况下，优选在组合物中包含等渗剂，例如糖、氯化钠或多元醇例如甘露醇和山梨醇。可注射的组合物的延长吸收可以通过将延迟吸收的试剂例如单硬脂酸铝或明胶包括在组合物中而实现。

制剂可以与常规赋形剂，即适合于经口、胃肠外、鼻部、静脉内、皮下、肠内或本领域已知的任何其它合适的施用方式的药学上可接受的有机或无机载体物质的混合物一起使用。可以将药物制品灭菌，并且如果期望的话，与助剂混合，所述助剂例如润滑剂、防腐剂、稳定剂、润湿剂、乳化剂、用于影响渗透压的盐、缓冲剂、着色剂、调味剂和/或芳香物质等。它们也可以根据期望与其它活性剂例如其它止痛剂组合。

本公开的组合物可包含占组合物总重量约0.005％至2.0％的防腐剂。防腐剂用于防止在暴露于环境中的污染物的情况下的腐败。根据本公开可用的防腐剂的实例包括但不限于选自苄醇、山梨酸、对羟基苯甲酸酯、亚胺脲及其组合的那些。特别优选的防腐剂是约0.5％至2.0％的苄醇和0.05％至0.5％的山梨酸的组合。

组合物优选包含抑制化合物降解的抗氧化剂和螯合剂。对于一些化合物，优选的抗氧化剂是BHT、BHA、α-生育酚和抗坏血酸，其优选范围为组合物总重量的约0.01％至0.3％(按重量计)，更优选组合物总重量的0.03％至0.1％(按重量计)范围内的BHT。优选地，螯合剂以组合物总重量的0.01％至0.5％(按重量计)的量存在。特别优选的螯合剂包括按组合物总重量计约0.01-0.20％(按重量计)，更优选0.02-0.10％(按重量计)范围的乙二胺四乙酸盐(例如乙二胺四乙酸二钠)和柠檬酸。螯合剂可用于螯合组合物中可能对制剂的保存期限有害的金属离子。虽然BHT和乙二胺四乙酸二钠分别是对于一些化合物而言特别优选的抗氧化剂和螯合剂，但是如本领域技术人员已知的，其它合适和等效的抗氧化剂和螯合剂因此可能被替代。

施用方案可影响有效量的构成。例如，治疗制剂可在与癌症相关的外科手术之前或之后，或在患者被诊断患有癌症之后不久施用至患者。此外，可以每天施用或者顺序地施用若干分开的剂量(divided dosages)以及交错剂量(staggered dosages)，或者剂量可以连续地输注、或者可以是单次快速静脉注射(bolus injection)。此外，治疗制剂的剂量可按比例地增加或减少，如治疗或预防情况的紧急情况所指示的。

向患者，优选哺乳动物，更优选人施用本公开的抗体或组合物可以使用已知的程序，以有效治疗患者癌症的剂量和时间进行。实现治疗效果所需的治疗化合物的有效量可以根据以下因素而变化：例如所使用的具体化合物的活性；施用时间；化合物的排泄速率；治疗的持续时间；其它药物，与该化合物组合使用的化合物或材料；所治疗患者的疾病或病症的状态、年龄、性别、体重、状况、一般健康和在先病史，以及医学领域中熟知的类似因素。可对剂量方案加以调节，以提供最优治疗应答。例如，可每日施用若干分开的剂量或可按治疗情形紧迫程度所指示的成比例减少剂量。本公开的治疗化合物的有效剂量范围的非限制性实例为约0.01至50mg/kg体重/每天。本领域普通技术人员将能够研究相关因素并且在不进行过度实验的情况下确定治疗化合物的有效量。

治疗化合物可以以每天若干次的频率施用至动物，或者可以更低频率地施用，例如每天一次，每周一次，每两周一次，每月一次或甚至更低频率，例如每几个月一次或甚至每年一次或更少。应当理解，在非限制性实例中，可以每天，每隔一天，每2天，每3天，每4天或每5天施用每天给药化合物的量。例如，对于每隔一天的施用，可以在周一开始5mg/天的剂量，在周三施用第一后续的5mg/天剂量，在周五施用第二后续的5mg/天剂量，等等。剂量的频率对于本领域技术人员是明显的，并且取决于许多因素，例如但不限于所治疗的疾病的类型和严重性，以及动物的类型和年龄。本公开的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变以获得能够有效实现对于特定患者、组合物和施用模式而言期望的治疗应答、而不对患者具有毒性的活性成分的量。具有本领域普通技术的医生，例如医师或兽医，可以容易地确定和开出所需的药物组合物的有效量。例如，医师或兽医可以以低于实现期望疗效需要的水平开始在药物组合物中采用的本公开的抗体的剂量，且逐步增加剂量直至实现期望的效果。

在具体实施方式中，特别有利的是以剂量单位形式配制化合物以易于施用和剂量均匀性。如本文所用的剂量单位形式指适宜作为待治疗患者的单一剂量的物理上分离的单位；每个单位含有与所需药物载剂相组合的经计算产生期望治疗效应的预先确定量的治疗化合物。本公开的剂量单位形式由以下因素决定并直接取决于以下因素：(a)治疗化合物的独特特征和要实现的特定治疗效果，以及(b)混配/配制这样的用于治疗患者的癌症的治疗化合物领域固有的限制。

本领域技术人员将认识到，尽管可以使用多于一种途径用于施用，但是特定途径可以提供比另一种途径更直接和更有效的反应。

本公开的抗体或组合物的施用途径包括吸入、经口、鼻部、直肠、肠胃外、舌下、经皮、经粘膜(例如，舌下、舌部、(经)颊部、(经)尿道、阴道(例如，经阴道和阴道内)、(经)鼻部和(经)直肠)、膀胱内、肺内、十二指肠内、胃内、鞘内、皮下、肌肉内、皮肤内、动脉内、静脉内、支气管内、吸入和局部施用。合适的组合物和剂型包括例如片剂、胶囊、囊剂、丸剂、软胶囊(gel cap)、含片、分散体、悬浮液、溶液、糖浆、颗粒、珠粒、经皮贴剂、凝胶、粉末、弹丸剂、浆剂、锭剂、乳霜、糊剂、膏剂、洗剂、盘剂、栓剂、用于鼻或口服给药的液体喷雾剂、用于吸入的干粉或气雾化制剂、用于膀胱内给药的组合物和制剂等。应当理解，可用于本公开的制剂和组合物不限于本文所述的具体制剂和组合物。

本公开的药物组合物的控释(controlled-release)或持续释放(sustained-release)制剂可以使用常规技术制备。在一些情况下，待使用的剂型可以作为一种或多种活性成分的缓释(slow-release)或控释而提供，其中使用例如羟丙基甲基纤维素、其它聚合物基质、凝胶、可渗透膜、渗透系统、多层包衣、微粒、脂质体或微球体或其组合，以提供不同比例的期望的释放曲线。本领域普通技术人员已知的合适的控释制剂，包括本文所述的那些，可以容易地选择用于本公开的药物组合物。因此，适合于经口施用的单一单位剂型，例如适于控释的片剂、胶囊、软胶囊和囊剂，包括在本公开中。

大多数控释药品都具有相对其非控释相应物改进药物疗法的共同目标。理想的是，在医学治疗中最佳设计的控释制品的使用的特征为：采用最少量的药物物质在最短的时间内治愈或控制病况。控释制剂的优点包括延长药物活性、减少给药频率和增加患者顺应性。此外，控释制剂可用于影响作用开始的时间或其它特征，例如药物的血液水平，因此可影响副作用的发生。

在一些实施方式中，本公开涉及一种治疗有此需要的受试者的癌症或者刺激或增强有此需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所述的抗体或药物组合物。

在一些实施方式中，本公开涉及一种治疗有此需要的受试者的癌症或者刺激或增强有此需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的本公开所述的抗体或药物组合物，其中以0.01-50mg/kg/天的剂量和介于1-14天之间的间隔向所述受试者施用本公开所述的抗体或药物组合物。

在一些实施方式中，本公开涉及本公开所述的抗体或药物组合物在制造用于治疗有此需要的受试者的癌症或者用于刺激或增强有此需要的受试者的免疫应答的药物中的用途。

在第一方面，本公开涉及一种特异性地结合人DKK2蛋白的抗体，其包含含有互补决定区CDRH1、CDRH2和CDRH3的重链可变区以及含有互补决定区CDRL1、CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中：

(a)CDRH1具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；

(b)CDRH2具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的氨基酸序列；

(c)CDRH3具有SEQ ID NO:4所示的氨基酸序列；

(d)CDRL1具有SEQ ID NO:5所示的氨基酸序列；

(e)CDRL2具有SEQ ID NO:6所示的氨基酸序列；且

(f)CDRL3具有SEQ ID NO:7所示的氨基酸序列。

在第二方面，本公开涉及如第一方面所述的抗体，其中所述重链可变区包含SEQID NO:10或SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列。

在第三方面，本公开涉及如第一方面或第二方面所述的抗体，其中所述轻链可变区包含SEQ ID NO:8或SEQ ID NO:12所示的氨基酸序列。

在第四方面，本公开涉及如第一方面至第三方面中任一项所述的抗体，其中所述抗体的重链包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列。

在第五方面，本公开涉及如第一方面至第四方面中任一项所述的抗体，其中所述抗体的轻链包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列，或者与SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:13所示的氨基酸序列具有至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％或至少99.5％的序列同一性的氨基酸序列。

在第六方面，本公开涉及如第一方面至第五方面中任一项所述的抗体，其中所述重链可变区和/或所述轻链可变区是单链可变片段scFv、F(ab’)₂片段、Fab或Fab’片段、双价抗体、三价抗体、四价抗体或单克隆抗体的部分。

在第七方面，本公开涉及一种药物组合物，其包含如第一方面至第六方面中任一项所述的抗体以及药学上可接受的载体。

在第八方面，本公开涉及一种DNA分子，其编码如第一方面至第六方面中任一项所述的抗体的重链和/或轻链。

在第九方面，本公开涉及一种治疗有此需要的受试者的癌症或者刺激或增强有此需要的受试者的免疫应答的方法，所述方法包括向所述受试者施用有效量的如第一方面至第六方面中任一项所述的抗体或第七方面所述的药物组合物。

在第十方面，本公开涉及如第九方面所述的方法，其中以0.01-50mg/kg/天的剂量和介于1-14天之间的间隔向所述受试者施用如第一方面至第六方面中任一项所述的抗体或第七方面所述的药物组合物。

在第十一方面，本公开涉及如第一方面至第六方面中任一项所述的抗体或第七方面所述的药物组合物在制造用于治疗有此需要的受试者的癌症或者用于刺激或增强有此需要的受试者的免疫应答的药物中的用途。

本公开将进一步在以下非限制性的工作实施例中进行说明。应当理解，这些实施例仅用于解释本公开而不是用于限制在本文中所引用的材料、条件、工艺参数等。除非另有说明，否则所有比例都是基于重量计算的。

实施例

5F8获自京天成生物技术(北京)有限公司，M-751、M-755和M-763是以M-747作为亲本抗体，通过本领域公知的用于抗体人源化的常规实验操作(例如，改变IgG子类、再次人源化、改变信号肽、氨基酸点突变和/或上述的组合)获得的。5F8、M-747、M-751、M-755和M-763的CDRH1、CDRH2和CDRH3，CDRL1、CDRL2和CDRL3，VH(重链可变区)，VL(轻链可变区)，HC(全长重链)以及LC(全长轻链)的氨基酸序列以及与SEQ ID NO的对应关系如下表1所示。

表1

实施例1：抗体的制备

抗体材料是由中国仓鼠卵巢(CHO)悬浮细胞系产生的。基本上如ThermoFisher(目录号A29133，文件部分号A29518)所述，遵循ExpiCHO-STM“最大滴定度”方法。使用ExpiFectamine将含有LC或HC编码区的pcDNA3.4表达载体以6x10⁶的VCD共转染到CHO-S细胞中。在32℃、5％CO₂和85％湿度，摇动速度为500RPM(3mm轨道)或130RPM(19mm轨道)的条件下，表达持续时间为10-12天。通过以下方式产生所有澄清的上清液：将细胞以3000g沉淀20分钟，然后进行0.22μm过滤。使用Mab Select SuRe蛋白A树脂从澄清的上清液中纯化抗体。使用具有精氨酸洗涤和pH 3.5的乙酸盐洗脱的磷酸钠，氯化钠缓冲系统。将蛋白A洗脱液用tris中和，并将缓冲液更换为20mM磷酸钠，150mM NaCl，pH 7.4。

实施例2：结合亲和力试验

利用酶联免疫吸附测定(ELISA)来评估与亲本抗体(M-747)相比，候选抗体(M-751、M-755和M-763)与人DKK2蛋白的结合亲和力。将人DKK2蛋白(R&D系统，目录号：6628-DK-010)在50ul 1xPBS缓冲液中以每孔1ng蛋白包被在384孔板中。然后将经包被的板密封，在4℃下孵育过夜。然后将板用60ul/孔的1x PBS缓冲液洗涤两次，随后使用3％BSA-PBST封闭，每孔50ul，密封并在37℃下孵育2小时。洗涤两次后，将50ul用1％BSA-PBST稀释至图中所示浓度的一抗添加到板的每个孔中，然后在37℃下孵育2小时。两次洗涤后，将50ul用1％BSA-PBST以1:5000稀释的二抗山羊抗人IgG-Fc HRP标记抗体(Bethyl Laboratories，目录号：A80-104P)添加到板的每个孔中，然后在37℃下孵育1小时。两次洗涤后，在室温下将80ul SuperSignal^TM West Pico PLUS化学发光底物(Thermo Scientific，目录号：34580)添加到每个孔中。在EnVision多模式读板器上使用470nm读取板。重复测定三轮。在每轮中一式三份地测试每个变体。图1中所示的是来自三轮之一的代表性数据。条(bars)表示平均值±SEM。

实施例3：使用稳定细胞系产生的材料通过候选抗体的DSF评估构象稳定性

使用CHO稳定转染系统产生抗体：使用Lipofectamine 3000(Invitrogen L3000-015)，按照制造商推荐的程序，将带有抗体重链编码序列的表达质粒pDL5(GenScript)和带有抗体轻链编码序列的表达质粒pDL2(GenScript)与辅助质粒pDL4一起共转染到CHO-K1宿主细胞中。将被转染的细胞在无选择压力的培养基中孵育1天，然后在含有20mg/L嘌呤霉素的培养基中孵育6天。将回收的细胞在生产培养基中培养，以允许分泌的抗体在消耗的培养基(spent media)中积累。

小规模纯化：使用Protein-A柱(Nab Protein A Plus旋转柱，ThermoScientific，目录号89952)，按照制造商的流程，将消耗的培养基在通过离心澄清后进行抗体纯化。然后通过高容量内毒素去除柱(Thermo Scientific，目录号88274)对纯化的抗体进行内毒素去除。使用E-Toxate试剂盒(Sigma-Aldrich，目录号ET0100、ET0200和ET0300)测试了去除步骤后的内毒素水平，并证实其低于0.1EU/mL。抗体浓度通过OD280测量。

DSF评估：对纯化的候选抗体进行差示扫描荧光(DSF)分析，以确定其相对构象稳定性(表2)。与亲本分子M-747相比，所有候选抗体均显示出提高的稳定性。

表2.与亲本抗体相比，候选抗体的DSF。更高的WSS值指示更好的热稳定性。

实施例4：使用稳定细胞系产生的材料评估候选抗体在动物模型中的功效

使用同基因肿瘤模型在C57BL/6雌性小鼠(Envigo)中评估稳定细胞系产生的候选抗体(参见实施例3产生和纯化部分)的体内活性。多克隆人IgG(BioXCell，目录号BE0092)被用作阴性对照。5F8被用作阳性对照。将上述获得的抗体对肿瘤生长和免疫细胞激活的作用与阳性组和阴性组进行比较。与亲本分子M-747相比，M-751和M-755表现出更强的肿瘤抑制和免疫激活作用。

肿瘤移植：在小鼠的右腋窝(外侧)皮下接种小鼠结肠癌细胞系MC38(Kerafast，目录号ENH204)。通过使用卡尺在二维上进行测量来监测肿瘤体积，并使用公式V＝0.5a×b²以mm³表示体积，其中a和b分别是肿瘤的长径和短径。然后在接种后第10天，当平均肿瘤体积达到200mm³时，将动物随机分组(n＝5)进行处理。在第10天、第13天和第16天，以12.5mg/kg腹膜内(IP)注射抗人DKK2抗体(图2)。在第17天，处死小鼠并称重肿瘤(图3)。

图2示出了在用候选抗体(M-751、M-755或M-763)、亲本抗体(M-747)或对照(人多克隆IgG或5F8)处理的组中，在注射后第10天、第13天和第16天测量的肿瘤体积。结果表示为平均值±SEM。通过比较平均肿瘤大小，M-751处理和M-755处理展示出比M-747更强的肿瘤生长控制。

图3示出了在用候选抗体(M-751、M-755或M-763)、亲本抗体(M-747)或对照(人多克隆IgG或5F8)处理的组中，在注射后第17天的平均终点肿瘤重量。结果表示为平均值±SEM。通过比较平均肿瘤重量，M-751处理和M-755处理展示出比M-747更强的肿瘤生长控制。

肿瘤浸润白细胞的制备：将收集的肿瘤用剪刀和手术刀刀片切碎，并用消化缓冲液(RPMI 1640培养基，5％FBS，1％青霉素/链霉素，25mM HEPES和300U胶原酶(SigmaC0130))在摇床上于37℃下孵育2小时。将分散的细胞通过70微米的细胞滤器过滤，以消除团块和碎屑。在500g和4℃下离心5分钟后，将细胞沉淀重悬在红细胞裂解缓冲液(SigmaR7757)中，并在室温下孵育5分钟以去除红细胞。将细胞再次沉淀，重悬，于37％下在0.05％胰蛋白酶/EDTA中孵育5分钟，然后用1μg/ml I型DNase(Sigma，D4263)进行DNA消化5分钟。通过添加FBS至5％来停止胰蛋白酶消化，并通过40-μm细胞滤器再次过滤细胞。最后，将细胞再次沉淀，并以2×10⁷的浓度重悬于PBS中。

流式细胞术：将单细胞悬液中的细胞用2％PFA(Santa Cruz，sc-281692)固定。用流式细胞术染色缓冲液(eBioscience，00-4222-26)洗涤后，在黑暗中于冰上用细胞表面标记物抗体对细胞染色1小时。为了对细胞内蛋白染色，将细胞洗涤并重悬于透化缓冲液(BD，554723)中，然后在黑暗中于冰上在透化缓冲液中用抗体染色1h。然后将细胞沉淀并重悬在流式细胞术染色缓冲液中以进行流式细胞术分析。图4、图5和图6示出了来自不同处理组的颗粒酶B、IFNγ和CD69的几何平均值。数据以平均值±SEM表示。通过单因素方差分析来分析统计学显著性。*:p<0.05；***:P<0.0005；****:p<0.0001。实施例5：使用补料分批产生的材料时，M-751、M-755与亲本分子的可开发性的比较

补料分批生产：将M-747、M-751和M-755的稳定库解冻并扩展(expanded)，以在补料分批设置下产生更具代表性的材料(与短暂的(transient)(实施例2)和实验室规模的材料(实施例3和实施例4)相比)，以用于非临床和临床开发中供进一步分析。将来自每种分子的稳定库扩展到摇瓶中，并在培养基M1(CD FortiCHO+4mM谷氨酰胺+5μg/mL杀稻瘟素+10μg/mL嘌呤霉素)中传代约2周，然后接种用于补料分批培养。补料分批接种后，将细胞直接在摇瓶中以约10x10⁶个细胞/mL的密度稀释到培养基M2(ActiPro+4mM谷氨酰胺+1X GS补充剂)中，第0天的初始工作容积为200mL。在InFors HT恒温箱(37.0℃，85％湿度，5％CO₂、110RPM，50mm轨道摆度)中孵育补料分批培养物。在第1、3、5、7和9天将补料培养基添加到补料分批培养物中。将葡萄糖添加到培养物中以使其水平保持在>3g/L，将GlutaMAX添加到培养物中以将谷氨酰胺水平保持在>2mM。在第2天，当细胞密度达到约20x10⁶个细胞/mL时，将培养温度调节至32℃。在第10天收获补料分批培养物。通过Cedex Bio分析仪测量来自收获的培养物的上清液的滴度。通过一步蛋白A层析法纯化补料分批培养物的上清液。

SEC分析：以以下方式测试样品：在不调节pH的情况下直接以蛋白A洗脱物的形式，或使用1M乙酸钠中和至pH5.5，或对于保持低pH持续表中所示的时间段的条件，用1M乙酸调节至pH3.7(表3)。使用配制缓冲液(20mM组氨酸，250mM山梨糖醇和0.2％泊洛沙姆188)将样品稀释至10mg/mL，以用于注射。在开始样品设置之前，用Milli-Q水以0.5mL/min的流速洗涤柱不少于60分钟，然后用流动相平衡系统，直到达到稳定的基线和反压或至少40分钟。每个样品注射两次。最多十次样品注射后，注射括号内的参考标准品。使用Empower进行色谱图的积分。如下计算％主峰、％HMW(高分子量)和％LMW(低分子量)：

％HMW＝(HMW峰面积的总和)/(总峰面积)*100％

％主峰＝(主峰面积)/(总峰面积)*100％

％LMW＝(LMW峰面积的总和)/(总峰面积)*100％

数据表示为两次注射的平均值。

表3.M-751、M-755与M-747的稳定性评估。在各种处理条件下通过SEC分析样品。与亲本分子M-747相比，M-751和M-755二者在所有条件下均显示出更小的％HMW。

SDS-PAGE分析：以以下方式测试样品：在不调节pH的情况下直接以蛋白A洗脱物的形式，或使用1M乙酸钠中和至pH5.5。上样之前，将样品用Milli-Q水稀释至1mg/mL，与上样缓冲液(EZ Biolab，LS003)以4:1混合，并在100℃下孵育10分钟，然后以10,000rpm离心5分钟。将预染色的蛋白质标记物(Tanon，180-6003)和样品以每孔5μl上样至凝胶(Tanon，180-8008)。电泳在80V下运行10分钟，然后在160V下运行，直到染料前沿跑出凝胶。然后将凝胶用染色溶液(Tanon，180-7001)染色60分钟，并用Milli-Q水洗涤3次，然后成像(图7)。亲本分子M-747显示出重链异质性，而M-751和M-755(进行了序列优化)均显示出典型的IgG谱。一些重链和轻链片段(用*表示)在M-751和M-755洗脱物中被观察到，但在pH调节后减少了。

自缔合结合常数：在高浓度下，不期望的溶液性质例如自缔合可对制剂开发提出重大挑战。除了潜在的制造和递送挑战外，自缔合物质还可影响生物活性和药代动力学特性。测量了与亲本分子M-747相比M-751和M-755的自缔合结合常数。结果显示，M-751和M-755彼此相似，两者的性能均优于M-747(表4)。

使用forteBIO Octet技术(Octet RED96)测量自缔合结合常数。将抗体用醋酸盐pH5.5缓冲液稀释至150ug/mL，然后加样至样品板(forteBIO，Greiner，PN655209)。ProA生物传感器(forteBIO)被用于捕获抗体。使用基本动力学在以下设置下进行测量：基线60/负载900/基线60/缔合300/解离300。计算目标抗原的缔合(Kon)和解离(Kdis)速率常数，并用于得出解离常数(KD)。所有计算均使用forteBIO提供的软件进行。

表4.计算了M-751、M-755与M-747的自缔合结合常数。M-751和M-755均显示出较低的自缔合亲和力，而亲本分子M-747则显示出形成稳定的自聚集体的较高趋势。

尽管具体的实施方式已被描述，然而对于申请人或其它本领技术人员而言，可能存在或目前无法预见上述实施方式的替代、修改、变化、改进和实质等效物。因此，提交的所附的权利要求以及可能被修改的权利要求旨在涵盖所有这样的替代、修改、变化、改进和实质等效物。

序列表

<110> 杭州奕安济世生物药业有限公司

<120> 抗DKK2抗体、包含该抗DKK2抗体的组合物及其用途

<130> D-CF200154

<160> 28

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 6

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 1

Thr Asn Tyr Trp Met Asn

1 5

<210> 2

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 2

Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 3

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 3

Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Leu Gln

1 5 10 15

Gly

<210> 4

<211> 13

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 4

Glu Gly Arg Leu Gly Leu Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr

1 5 10

<210> 5

<211> 17

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 5

Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu

1 5 10 15

Ala

<210> 6

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 6

Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser

1 5

<210> 7

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 7

Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr

1 5

<210> 8

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 8

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

85 90 95

His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile

100 105 110

Lys Arg

<210> 9

<211> 242

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 9

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser

20 25 30

Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser

35 40 45

Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr

50 55 60

Gln Gln Lys Pro Gly Lys Val Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser

65 70 75 80

Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly

85 90 95

Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Val Ala

100 105 110

Thr Tyr Phe Cys Gln Gln His Tyr Ile Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly

115 120 125

Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe

130 135 140

Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val

145 150 155 160

Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp

165 170 175

Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr

180 185 190

Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr

195 200 205

Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val

210 215 220

Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly

225 230 235 240

Glu Cys

<210> 10

<211> 122

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 10

Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser

1 5 10 15

Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met

35 40 45

Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr Arg Leu Asn Gln Lys Phe

50 55 60

Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Ala Arg Glu Gly Arg Leu Gly Leu Arg Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp

100 105 110

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 11

<211> 471

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 11

Met Asp Met Arg Val Pro Ala Gln Leu Leu Gly Leu Leu Leu Leu Trp

1 5 10 15

Leu Arg Gly Ala Arg Cys Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

20 25 30

Val Lys Lys Pro Gly Ser Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Gln Gly Leu Glu Trp Met Gly Met Ile His Pro Ser Asp Ser Glu Thr

65 70 75 80

Arg Leu Asn Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Ile Thr Val Asp Lys

85 90 95

Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Glu Gly Arg Leu Gly Leu Arg Ser

115 120 125

Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

130 135 140

Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Cys Ser Arg

145 150 155 160

Ser Thr Ser Glu Ser Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr

165 170 175

Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser

180 185 190

Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser

195 200 205

Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Lys Thr

210 215 220

Tyr Thr Cys Asn Val Asp His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys

225 230 235 240

Arg Val Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

245 250 255

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

260 265 270

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

275 280 285

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

290 295 300

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

305 310 315 320

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

325 330 335

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

340 345 350

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

355 360 365

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

370 375 380

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

385 390 395 400

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

405 410 415

Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

420 425 430

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

435 440 445

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

450 455 460

Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

465 470

<210> 12

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 12

Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly

1 5 10 15

Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys

35 40 45

Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln

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Lys Arg

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<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 13

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Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ser Ser

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Gln Ser Leu Leu Asn Ser Ser Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr

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Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Phe Ala Ser

65 70 75 80

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100 105 110

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Glu Cys

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<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 14

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<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 15

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<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 16

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<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 17

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<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 18

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Ala

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<210> 22

<211> 114

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 22

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<211> 471

<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 23

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<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 25

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<212> PRT

<213> 人工序列()

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<211> 471

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<400> 27

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275 280 285

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<212> PRT

<213> 人工序列()

<400> 28

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210 215 220

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225 230 235 240

Glu Cys