一种卤化酶重组表达载体制备方法及其应用
阅读说明：本技术 一种卤化酶重组表达载体制备方法及其应用 (Preparation method and application of halogenase recombinant expression vector ) 是由 王苗 李昱良 刘建国 王倩 任群利 胡欢 李小兰 于 2021-01-07 设计创作，主要内容包括：本发明以链霉菌Streptomyces sp.FJS31-2基因组为模板,特异引物扩增卤化酶片段,TA克隆,T载体通用引物进行菌液PCR鉴定,abx H/T质粒BglⅡ和HindⅢ限制性内切酶切鉴定并胶回收目的片段,连接相同酶切并去磷酸化处理的质粒载体,连接产物室温过夜连接,转化克隆菌株JM109感受态细胞。进行特异引物菌液PCR鉴定,扩增出目的条带的阳性克隆提质粒限制性内切酶酶切鉴定,切出载体片段和插入的目的条带。测序验证的阳性菌转化表达菌株BL21(DE3)Rosetta感受态细胞,特异引物菌液PCR鉴定。在不同温度下进行IPTG诱导表达,蛋白样品处理,SDS-PAGE蛋白质电泳分析,可见很明显的诱导蛋白条带,卤化酶大小为65KD。(The invention uses streptomycete Streptomyces Taking an sp.FJS31-2 genome as a template, amplifying a halogenase fragment by using a specific primer, cloning TA, carrying out bacteria liquid PCR identification by using a T carrier general primer, carrying out restriction enzyme digestion identification on abx H/T plasmids Bgl II and Hind III, recovering a target fragment by glue, connecting plasmid carriers which are subjected to the same enzyme digestion and dephosphorylation treatment, connecting a connecting product at room temperature overnight, and transforming a clone strain JM109 competent cell. Carrying out PCR identification on specific primer bacterial liquid, amplifying positive clone of a target band, carrying out restriction enzyme digestion identification on plasmid, cutting out a vector fragment and an inserted target band. And (3) transforming expression strain BL21(DE3) Rosetta competent cells by positive bacteria verified by sequencing, and carrying out PCR identification on specific primer bacteria liquid.IPTG induced expression, protein sample treatment and SDS-PAGE protein electrophoresis analysis are carried out at different temperatures, a very obvious induced protein band can be seen, and the size of the halogenase is 65 KD.)
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体为一种卤化酶重组表达载体制备方法及其应用。
背景技术
卤化物是含有卤素原子氟、氯、溴或碘的一类有机化合物。大多数卤化物具有重要的生物活性，许多临床上使用的抗生素和抗肿瘤药物都是微生物来源的卤化物，如具有抗菌活性的氯霉素、万古霉素，具有抗肿瘤活性的蝴蝶霉素、C-1027等。2014年批准上市的4个新型抗生素中3个为卤化物，分别为Dalvance、Oritavanci、Sivextro.
卤化物中的卤素原子对卤化物的生理活性有重要的影响，不但可以有效提高化合物的相关活性，并可延长半衰期，增加生物利用度。传统的卤化物挖掘主要依靠纯培养的方法，此方法的发现重复率高且不具有定向性。
利用微生物也是卤化物发现的重要来源。
发明内容
本发明的目的在于上述背景技术基础上，利用微生物技术，提供一种卤化酶异源表达载体及其构建。
为达到上述目的，采用的技术方案为：
所述卤化酶序列如SEQ ID NO.1所示；
1).根据链霉菌Streptomyces 31-2基因组测序结果设计编码基因的完全编码区扩增引物，Halo编码基因上下游引物分别加入了限制性内切酶BglⅡ和HindIII识别位点，引物HaloER的序列为：5'-CCCAAGCTTCGGCATGGCGGTCTTCATGT-3'，引物HaloEF的序列为：5'-GGAAGATCTATGGACACGACAGACACAGGCG-3'；
2).HaloEF/ER卤化酶特异引物以Streptomyces sp.FJS31-2基因组DNA为模板扩增，PCR产物纯化，TA克隆，通用引物M13F/M13R进行PCR验证，测序验证阳性克隆，菌株Halo-T用限制性酶BglⅡ和HindⅢ双酶切，双酶切片段连接相应酶切并去磷酸化处理的表达载体pET-32a，室温反应6h，转化JM109感受态细胞，特异引物菌液PCR鉴定及质粒酶切鉴定，测序鉴定，得到原核表达质粒载体pET-halo；最后得到阳性克隆菌质粒转化BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，特异引物菌液PCR鉴定，确定阳性克隆菌；
3).取阳性克隆菌pET-halo的质粒和pET32a质粒100ng，转化大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，转化子过夜培养、T7启动子引物菌液PCR鉴定后，得到重组质粒的基因工程菌pET-haloBL21和pET32aBL21；
4).取前述2种基因工程菌各50μL，分别接种于5mL浓度为100ng/μL氨苄西林的LB液体培养基中220r/min，37℃培养3h后分别接种100mL浓度为100ng/μL氨苄西林的LB液体培养基中220r/min，37℃培养至OD600＝0.3时，取5mL上述培养物分装至50mL无菌离心管，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，置于恒温摇床诱导6h；取1mL诱导后培养物，4000r/min离心5min，菌体沉淀加入100μL的5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，置于99℃金属浴中裂解10min，12000r/min，室温离心10min，上清液即为菌体总蛋白裂解液；
5).分别取10μL总蛋白裂解液上样，10％的SDS-PAGE凝胶电泳，考马斯亮蓝R250染色6h后，甲醇-冰醋酸脱色液脱色6h，结果显示为目标卤化酶蛋白。
研究表明，卤化物的生物合成基因成簇(Gene cluster)存在于微生物的基因组中，其中的卤化酶基因负责化合物的卤化修饰，在卤化酶催化的卤化作用在抗生素生物合成途径中起着重要作用，可极大提高代谢产物的抑菌活性。卤化酶是能够赋予次生代谢产物活性的一种重要后期修饰酶，具有底物特异性，很可能催化合成新的卤化产物。以卤化酶基因为探针，可以发现与之偶联的天然生物合成基因簇，为卤化物的发现提供基础。
本申请以链霉菌Streptomyces sp.FJS31-2基因组为模板，特异引物扩增卤化酶abx H目的片段，TA克隆，T载体通用引物M13F/M13R引物进行菌液PCR鉴定，abx H/T质粒BglⅡ和HindⅢ限制性内切酶切鉴定并胶回收1300bp目的片段，连接相同酶切并去磷酸化处理的质粒载体pET32a，连接产物室温过夜连接，转化克隆菌株JM109感受态细胞。命名为pET-abxH-J。pET-abxH-J进行特异引物菌液PCR鉴定，可以扩增出对应的目的条带1300bp(图1)，扩增出目的条带的阳性克隆提质粒限制性内切酶酶切鉴定，可以切出载体片段5900bp和插入的目的条带1300bp。测序验证的阳性菌转化表达菌株BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，特异引物菌液PCR鉴定(图2)，分别命名为pET-abxH R，在不同温度下(18℃、28℃、37℃)进行IPTG诱导表达，蛋白样品处理，SDS-PAGE蛋白质电泳分析，可见很明显的诱导蛋白条带(图3)，卤化酶大小为65KD。
附图说明
图1为本申请pET-abxH-J连接转化JM109感受态细胞特异引物鉴定。
图2为本申请pET-abxH J连接转化BL21(DE3)Rosetta感受态细胞特异引物鉴定。
图3为本申请pET-abxH R诱导表达蛋白质电泳分析。
具体实施方式
下面结合本发明的具体实施例，对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述。若涉及附图，附图中的相同数字表示相同或同种要素。所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部。基于本发明中的实施例，本领域技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
本发明所述卤化酶序列如SEQ ID NO.1所示。
图1为本申请pET-abxH-J连接转化JM109感受态细胞特异引物鉴定。其中1/2/3/7/8/16/20可以扩增出Halo目的基因的1300bp，为阳性克隆。
图2为本申请pET-abxH J连接转化BL21(DE3)Rosetta感受态细胞特异引物鉴定。其中除了8以外，其余全部是阳性克隆。
图3为本申请pET-abxH R诱导表达蛋白质电泳分析。BSA是牛血清白蛋白，分子量为66.430kDa，与鉴定的卤化酶基因65kDa，大小相差不大，作为Maker。1为没有加入IPTG的pET-abxH R菌株，2、3和4为加了IPTG分别在18℃、28℃、37℃下培养的pET-abxH R菌株。
链霉菌Streptomyces sp.FJS31-2(菌保号：CGMCC 4.7321)基因组全长约11.6Mb,其产生一系列卤化产物，其中包含一个卤化酶II型PKS类产物zunyimycin生物合成基因簇全长15462bp。对其生物合成基因簇进行系列分析，其中有后修饰卤化酶基因。
本申请利用primer5.0等生物软件，根据链霉菌Streptomyces 31-2基因组测序结果设计编码基因的完全编码区扩增引物，Halo编码基因上下游引物分别加入了限制性内切酶BglⅡ和HindIII识别位点，HaloEF/ER卤化酶特异引物以Streptomyces sp.FJS31-2基因组DNA为模板扩增，PCR产物纯化，TA克隆，通用引物M13F/M13R进行PCR验证，测序验证阳性克隆，菌株Halo-T用限制性酶BglⅡ和HindⅢ双酶切，双酶切片段连接相应酶切并去磷酸化处理的表达载体pET-32a，室温反应6h，转化JM109感受态细胞，特异引物菌液PCR鉴定及质粒酶切鉴定，测序鉴定，经测序验证后的原核表达质粒载体命名为pET-halo。最后得到的阳性克隆菌质粒转化BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，特异引物菌液PCR鉴定，确定阳性克隆菌。
目的基因克隆或菌液PCR鉴定：
20μL反应体系：
PCR反应条件为：
取阳性克隆菌pET-halo的质粒和pET32a质粒100ng，转化大肠杆菌BL21(DE3)Rosetta感受态细胞，转化子过夜培养、T7启动子引物菌液PCR鉴定后，将含重组质粒的基因工程菌命名分别为pET-haloBL21和pET32aBL21。取前述2种基因工程菌各50μL，分别接种于5mL含终浓度为100ng/μL氨苄西林的LB液体培养基中220r/min，37℃培养3h后分别接种100mL含终浓度为100ng/μL氨苄西林的LB液体培养基中220r/min，37℃培养至OD600＝0.3时，取5mL上述培养物分装至50mL无菌离心管，加入终浓度为1.0mmol/L的IPTG，置于18℃、28℃、37℃恒温摇床诱导6h。取1mL诱导后培养物，4 000r/min离心5min，菌体沉淀加入100μL的5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，置于99℃金属浴中裂解10min，12 000r/min，室温离心10min，上清即为菌体总蛋白裂解液。分别取10μL总蛋白裂解液上样，10％的SDS-PAGE凝胶电泳。考马斯亮蓝R250染色6h后，甲醇-冰醋酸脱色液脱色6h，结果显示在三种不同温度下，卤化酶蛋白表达无过大差异。
蛋白样品处理步骤
(1)诱导的菌体取1mL于12000rpm，离心3min，弃去上清；
(2)每管分别加入1mL去离子水，吹打混匀，12000rpm，离心3min，弃去上清；
(3)每管加入50μL去离子水，吹打混匀，再加入20μL 5×SDS-PAGE电泳上样缓冲液，99℃金属浴裂解10min；
(4)取出离心管，12000rpm，离心10min，即得总蛋白裂解液样品。
SDS-PAGE蛋白质电泳分析步骤
(1)分别取10μL总蛋白裂解液，10μL蛋白质分子标准点样，10％的SDS-PAGE凝胶电泳分析，50V电泳30min之后100V电泳2h，根据实际情况调整时间；
(2)剥胶之后放置于盛有考马斯亮蓝R250的蛋白染色液中，脱色摇床振荡染色2-6h；
(3)考马斯亮蓝蛋白脱色液脱色6h，双色红外激光成像系统曝光显色，判断蛋白质表达与否。
表1引物序列及用途
对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。不应将权利要求中的任何附图标记视为限制所涉及的权利要求。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。
序列表
<110> 遵义医科大学
<120> 一种卤化酶重组表达载体制备方法及其应用
<141> 2021-01-07
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3
<212> PRT
<213> Streptomyces sp.FJ31-2
<400> 1
<210> 2
<211> 1251
<212> DNA
<213> Streptomyces sp.FJ31-2
<400> 2
gtgacacact caatggacac gacagacaca ggcgaccccg gtacctccta cgacgtcgtt 60
gtgatcggcg gcggccccgc cggctcgagc accgcggccc agctggcccg ggccggccac 120
cgggtgctgg tgctggagcg ggagaagttc ccccgctacc acatcggcga gtccctcatc 180
cccggctgcc tcgacctggt cagggacctg ggcctgtggg accggctgga aggcctcggc 240
ttcaccaaga agtacggcgg caccctgctg tggggcgcca ccgagggcac ctgggacttc 300
cggttcgccg acggcagcga ctacgagtac tccttccagg tgcgccgcgc cgacttcgac 360
aaggacgtgg agttcgacgg cgaccgcgcc accggcctgg tctacaccgt caagggctcg 420
gacgagcccg tacgggtctc ctcccgcttc ctcgtcgacg cctccggaca gcagcggctc 480
ctcggccgcc ggctcgggct cgtcgactgg cacgaggacc tgcgcaatgt cgcggtgtgg 540
agctacttcc agggctgcga cttcatcgag ggcgagaacc gggccggcga cgtggtcgtg 600
gagaacatgt ggcaggagga ccagcctccc ggctggttct ggttcatccc gctgcacgac 660
ggcacggtca gcatcggcta tgtcacccgc accgctctgc tgcagcgctc cggtctgacc 720
ccggaccagc tgttcgaaca gcagctggcc gcctcggacg aggtcaagcg gctcacccgg 780
aacgccacca ggaccagcgc ctaccgcacc ctgcgcgact ggagctatga gtgcacccgc 840
ttccatggcc ccggctgggc cgtggtcggc gacgccgcgg cctttgtcga cccgctgttc 900
tccaccggcg tcaccctggc catgcgcggt gcgcgggacc tggcccccgc ggtcgaccag 960
gcgctgcgcg acccgggcca ggaggccgat ctgctcaagg cgtacgagga cgggtaccgc 1020
gaattcctcg gccacgtcct gaccttcgtg cgcttcttct acaacatcaa gatgcacaag 1080
gaacagtact gggagggcgc ccagaccatc gtcgacccgc agaagctcca ggcgccgaag 1140
atcgacttcg cggtcctgct ggccggcatg accggcatcc ggcccacgcc cgagatgcag 1200
gcggacgcca gggccaagac caacgacatc cactcccgct tcgcgacatg a 1251
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