一种改性壳聚糖微凝胶及其制备方法与应用
阅读说明：本技术 一种改性壳聚糖微凝胶及其制备方法与应用 (Modified chitosan microgel and preparation method and application thereof ) 是由 倪才华 张丽萍 桑欣欣 于 2020-12-08 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种改性壳聚糖微凝胶及其制备方法与应用,属于壳聚糖衍生物合成技术领域。本发明通过ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯的无规共聚物对壳聚糖改性,其无规共聚物结构单元中侧链悬挂的带负电荷的羧基与壳聚糖分子中带正电荷的氨基进行复合形成改性壳聚糖微凝胶,制备方法简单、安全可靠、容易控制；且所制得的改性壳聚糖微凝胶稳定性好、载药率高、无细胞毒性、生物相容性较好,可作为抗癌药物载体。此外,本发明采用的壳聚糖和ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯的无规共聚物都是可生物降解的聚合物,适合作为生物材料用于人体内。(The invention relates to a modified chitosan microgel and a preparation method and application thereof, belonging to the technical field of synthesis of chitosan derivatives. According to the invention, the chitosan is modified by the random copolymer of epsilon-caprolactone and 3-hydroxy adipic acid 3, 6-lactone, and the carboxyl with negative charge suspended on the side chain in the structural unit of the random copolymer is compounded with the amino with positive charge in the chitosan molecule to form the modified chitosan microgel, so that the preparation method is simple, safe, reliable and easy to control; the prepared modified chitosan microgel has good stability, high drug loading rate, no cytotoxicity and good biocompatibility, and can be used as an anticancer drug carrier. In addition, the chitosan and the random copolymer of epsilon-caprolactone and 3-hydroxy adipic acid 3, 6-lactone adopted by the invention are biodegradable polymers and are suitable for being used as biological materials in human bodies.)
技术领域
本发明涉及一种改性壳聚糖微凝胶及其制备方法与应用，属于壳聚糖衍生物合成技术领域。
背景技术
壳聚糖是由甲壳素脱乙酰基得到的一种天然的聚阳离子多糖，无毒、无刺激性、无致敏性、无致突变作用，具有良好的生物相容性和生物降解性，可溶于酸性水溶液。壳聚糖可以制备成水凝胶、壳聚糖薄膜、纳米胶束等多种形态，广泛用作医用材料。壳聚糖制备的水凝胶作为药物载体可以控制药物缓释、延长药物疗效、降低药物毒副作用，提高疏水性药物对细胞膜的通透性和药物的稳定性及改变给药途径，还可以大大加强制剂的靶向给药能力。壳聚糖来源广泛，具有制备技术成熟、工序简易、无味、耐热、价格便宜等优点，目前已被广泛用于医药等领域。
但是壳聚糖只能在酸性溶液中溶解，而单纯的壳聚糖难以制备成水凝胶且对于疏水性药物的载药率较低。因此需要对壳聚糖改性，使改性后的壳聚糖衍生物具有亲水和疏水的双亲性结构，或形成局部疏水性的微区域。Detchprohm等在2001年《MacromolecularChemistry and Physics》(大分子化学与物理)202期3560-3570页上发表的“Synthesis ofa Novel Chitin Derivative Having Oligo(ε-caprolactone)Side Chains in AqueousReaction Media”(在水为介质的条件下合成含有低聚己内酯侧链的壳聚糖衍生物)，该文提出由壳聚糖和己内酯单体，在以辛酸亚锡为催化剂，水为溶胀剂的条件下通过开环聚合制备壳聚糖-接枝-聚己内酯。在此基础上，本领域的研究者进行了一系列的改进和拓展研究，如中国专利公告号为CN 100384883 C的发明专利提供了一种制备壳聚糖-接枝-聚己内酯的方法，公告号为CN 101580556 B的发明专利提供了一种壳聚糖为主链的温度敏感两亲性接枝共聚物的制备方法，以及公布号为CN 111187416 A的发明专利提供了一种壳聚糖-g-聚ε-己内酯衍生物载药纳米胶束的制备方法和应用。这些专利都是采用ε-己内酯为单体对壳聚糖进行改进合成两亲性的壳聚糖衍生物的。ε-己内酯中含有内酯的环状结构，在催化剂的作用下可以开环聚合，形成疏水性的聚酯。聚酯是一种可生物降解的聚合物，适合作为生物材料用于人体内。但是现有技术中，在上述构思的基础上制备水凝胶时，常采用化学交联方法，以含醛基的小分子为交联剂，与壳聚糖的氨基通过化学键合形成水凝胶，如中国专利公告号为CN 106046398 A的发明专利公开的一种水凝胶及其制备方法，虽然可以在温和条件下制备生物相容性较好的壳聚糖水凝胶，但是制备步骤过于繁琐，且因为醛基物质的存在而无法完全保证水凝胶的生物安全性，此外，其载药率也有待提高。
聚电解质复合物是通过带有相反电荷的聚电解质混合而成，即聚阳离子和聚阴离子之间通过库仑力结合而形成的。聚电解质形成复合物后，在水溶液中具有一定的稳定性，由于微疏水区域的存在，可形成微凝胶。由此，本发明人得到启示，通过大量实验研究后，采用ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯的无规共聚物对壳聚糖进行改性形成微凝胶。3-羟基己二酸3,6-内酯分子中含有内酯的环状结构，在催化剂的作用下可以开环聚合，形成疏水性的聚酯。同时，3-羟基己二酸3,6-内酯开环聚合后，侧链含有游离的负电荷羧基，能够与壳聚糖中正电荷的氨基形成复合物微凝胶。由于单体ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯均含有6个碳原子，因此所得聚合物主链比较柔顺，且有一定的疏水性，有利于微凝胶的形成和载药率的提高。
发明内容
本发明的第一个目的在于提供一种改性壳聚糖微凝胶的制备方法。
本发明的第二个目的在于提供一种采用上述方法制备的改性壳聚糖微凝胶。
本发明的第三个目的在于提供一种上述改性壳聚糖微凝胶的应用。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
本发明的第一个方面提供了一种改性壳聚糖微凝胶的制备方法，步骤包括：
步骤1：ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯的无规共聚物的制备
在反应容器中加入甲苯、ε-己内酯、3-羟基己二酸3,6-内酯和催化剂，升温至85～95℃回流反应2～4h后，继续升温至105～110℃回流反应2～3h，冷却至室温，通过有机溶剂A沉淀得到ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯无规共聚物的粗产物，将该粗产物提纯即得到所述的ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯的无规共聚物，记为LC-HA；
其中，所添加的ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯的摩尔比为1:1～1:3；所添加的催化剂的用量为ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯总重量的0.5～1.0％。
步骤2：壳聚糖悬浮液的制备
配制浓度为0.02～0.04g/mL的壳聚糖的醋酸溶液(醋酸浓度为2wt％)，并在碱性条件下将壳聚糖沉淀，过滤出壳聚糖沉淀物，用去离子水反复洗涤至滤液呈中性后，用少量有机溶剂B浸泡、过滤，经真空干燥至恒重后研磨成粉末，然后用超纯水配制成浓度为1.0wt％的壳聚糖悬浮液。
步骤3：改性壳聚糖微凝胶的制备
将步骤1所制得的ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯的无规共聚物溶解于四氢呋喃或甲苯中，配置成浓度为1.0wt％的LC-HA溶液，于搅拌条件下滴加至步骤2所制得的壳聚糖悬浮液中，混合均匀后，转移至透析袋，经透析提纯得到所述的改性壳聚糖微凝胶；
其中，LC-HA溶液与壳聚糖悬浮液的体积比为1:3～1:6。
进一步地，在步骤1中，所述的催化剂为二氯化锡或辛酸亚锡中的一种。
进一步地，在步骤1中，所述甲苯用量为ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯总重量的3～5倍。
进一步地，在步骤1中，所述的提纯的方法是：将ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯无规共聚物粗产物溶于甲苯或四氢呋喃中并用有机溶剂A沉淀，如此循环溶解-沉淀三次，最后将沉淀物真空干燥。
更进一步地，所述的有机溶剂A为石油醚、乙醚、甲醇或乙醇中的一种。
进一步地，在步骤2中，所述的有机溶剂B为乙醇或异丙醇中的一种。
进一步地，在步骤3中，所述的透析袋的截留分子量为14000。
进一步地，在步骤3中，所述的透析提纯的条件为：透析时间72h，每隔8h更换透析液。
更进一步地，所述的透析液为去离子水。
本发明的第二个方面提供了一种由上述制备方法制成的改性壳聚糖微凝胶，所述的改性壳聚糖微凝胶的平均直径为175～230nm，载药率为14.2～18.5％。
本发明的第三个方面提供了一种上述改性壳聚糖微凝胶在抗癌药物载体中的应用。
由于采取以上技术方案，本发明相较于现有技术的优势和有益效果在于：
1、ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯的无规共聚物主链比较柔顺，且有一定的疏水性，用其对壳聚糖改性，所得产物具有双亲性，有利于稳定微凝胶的形成和载药率的提高；
2、通过无规共聚物结构单元中侧链悬挂的带负电荷的羧基与壳聚糖分子中带正电荷的氨基进行复合形成微凝胶，制备方法简单、安全可靠、容易控制；
3、壳聚糖和ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯的无规共聚物都是可生物降解的聚合物，适合作为生物材料用于人体内。
附图说明
图1为本发明实施例1中步骤1所制备的ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯无规共聚物的红外光谱图；
图2为本发明实施例1和实施例4所制得的改性壳聚糖微凝胶的透射电镜图，其中，图A、图B分别代表样品来自于实施例1和实施例4；
图3为本发明实施例1所制得的改性壳聚糖凝胶在不同质量浓度时的Hela细胞存活率。
具体实施方式
为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例与附图对本发明进行具体描述。
实施例1
一种改性壳聚糖微凝胶的制备方法，包括如下步骤：
步骤1：ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯的无规共聚物的制备
在带有回流装置的250mL三颈烧瓶中置入100mL甲苯，加入ε-己内酯5.7g，3-羟基己二酸3,6-内酯14.4g，辛酸亚锡0.1g，将烧瓶置于油浴锅中加热，升高温度至95℃，反应3h后继续升高温度至105℃再反应2h，冷却至室温，将反应液滴入到过量石油醚中沉淀后，经过滤得到ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯无规共聚物的粗产物，将粗产物循环用甲苯溶解和用石油醚沉淀三次，最后将沉淀物真空干燥，即得到所述的ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯无规共聚物，标记为LC-HA。
采用傅立叶红外光谱仪(FTLA2000-104，ABB BOMEN Corporation)对所制得的LC-HA进行红外光谱测定，设置扫描波长范围500～4000cm-1，分辨率为4cm-1。测定结果如图1所示，在3300～3530cm-1范围内出现的较大的宽峰，属于-OH和-COOH重叠的伸缩振动峰；2850cm-1左右处的弱小峰是亚甲基CH2的伸缩振动吸收峰；1740cm-1处是C＝O的伸缩振动峰，1710cm-1处是羧基中C＝O的伸缩振动峰；950cm-1处的吸收峰是OH...O的面外变形振动，可以确认羧基的存在。这些特征峰说明ε-己内酯与3-羟基己二酸3,6-内酯无规共聚物合成成功。
步骤2：壳聚糖悬浮液的制备
称取2g壳聚糖溶于100mL的浓度为2wt％的醋酸溶液中，搅拌均匀，将壳聚糖的醋酸溶液缓慢滴入过量的浓度为5wt％的氢氧化钠溶液中，磁力搅拌，滴加完继续搅拌2h，过滤出壳聚糖沉淀物，用去离子水反复洗涤壳聚糖沉淀物，直到滤液呈中性，最后一次过滤后的壳聚糖沉淀物用少量乙醇浸泡3h，再过滤，真空干燥至恒重，研磨成粉末，用超纯水配制成浓度为1.0wt％的壳聚糖悬浮液。
步骤3：改性壳聚糖微凝胶的制备
取2g步骤1所制得的LC-HA溶于200mL四氢呋喃中，配成浓度为1.0％(m/v，g/mL)的LC-HA溶液，从中取出10mL的LC-HA溶液，在磁力搅拌条件下，缓慢滴加到30mL壳聚糖悬浮液中，充分搅拌使其复合均匀，然后转入截留分子量为14000的透析袋中，置于去离子水中透析，透析时间72h，每隔8h更换透析袋中的去离子水，得到所述的改性壳聚糖微凝胶，将其冷冻干燥备用，样品标记为MCS-1。
实施例2
相较于实施例1的区别仅在于：步骤3中所添加的壳聚糖悬浮液为40mL，其余均同实施例1；实施例2得到的改性壳聚糖微凝胶标记为MCS-2。
实施例3
相较于实施例1的区别仅在于：步骤3中所添加的壳聚糖悬浮液为50mL，其余均同实施例1；实施例3得到的改性壳聚糖微凝胶标记为MCS-3。
实施例4
相较于实施例1的区别仅在于：步骤3中所添加的壳聚糖悬浮液为60mL，其余均同实施例1；实施例4得到的改性壳聚糖微凝胶标记为MCS-4。
性能测定
1、改性壳聚糖微凝胶的粒径测试
采用纳米粒度分析仪(ZetaPALS型，美国Brookharen公司)对实施例1～4所制得的改性壳聚糖微凝胶颗粒的粒径进行测试，样品浓度为0.15mg/mL，测试温度为25℃，结果见表1。
表1改性壳聚糖微凝胶的原料组成及性能
从表1可以看出，实施例1～4的微凝胶颗粒的平均直径，随着壳聚糖悬浮液含量的增加是持续增大的，这是因为随着壳聚糖组分的增加，复合物的亲水性增强，从而使得微凝胶的体积增大。
2、改性壳聚糖微凝胶的形貌观察
以实施例1和实施例4所制得的改性壳聚糖微凝胶样品为例，通过透射电子显微镜(JEM-2100型，日本JEOL公司)观察微凝胶的形貌。具体操作方法为：分别将实施例1和实施例4制成的改性壳聚糖微凝胶样品滴在铜网上，室温干燥后放入透射电子显微镜的样品室，设置加速电压100kV，于高真空状态下观察微凝胶的形貌，结果如图2所示，其中，图A、图B分别代表实施例1和实施例4所制得的改性壳聚糖微凝胶的透射电镜图。从图2可以看出，实施例1和实施例4的样品均呈现出较为规整的球形形貌，粒径分布也都比较均匀，这说明实施例1和实施例4所得到的改性壳聚糖微凝胶比较稳定。此外，实施例4样品的粒径较实施例1的较大，与纳米粒度仪分析结果所得规律也相符。
3、改性壳聚糖微凝胶的载药率测定
对实施例1～4所制得的改性壳聚糖微凝胶进行载药率的测定，具体方法为：
精密称取30mg喜树碱溶于5mL甲醇和5mL超纯水的混合溶剂中，调节pH＝12，将其逐滴添加到50mL浓度为1.2mg/mL的改性壳聚糖微凝胶的水溶液中，搅拌均匀后用0.1M盐酸缓慢调节pH至5，装入截留分子量为3500的透析袋中，在去离子水中透析12小时除去小分子物质，冷冻干燥得到载药微凝胶；再将载药微凝胶分散于甲醇中，磁力搅拌24h后离心，取上层清夜，在395nm处测定其吸光度，根据标准曲线计算所负载药物量，从而计算微凝胶的载药率(LR，％)。微凝胶的载药率计算公式如下式1所示：
式1中，WD为样品中负载药物的质量，mg；WS为样品的质量，mg。
实施例1～4的改性壳聚糖微凝胶的载药率的测定结果见表1。从表1可以看出，实施例1～4的微凝胶的载药率，随着壳聚糖悬浮液含量的增加呈持续下降状态，这是因为随着壳聚糖组分的增加，LC-HA组分相对减少，对于疏水性药物的载药率下降。
4、改性壳聚糖微凝胶的细胞毒性测定
以实施例1所制得的改性壳聚糖微凝胶为例，采用MTT法进行微凝胶的细胞毒性测定，具体操作如下：
取对数期生长的Hela细胞(人宫颈癌细胞)，经胰酶消化后，用胎牛血清(10wt％)的RPMI-1640培养基稀释成细胞悬浮液(浓度为6×104个/mL)，接种于96孔培养板，每孔接种100μL，在37℃、5％CO2培养箱中培养24h后弃去培养基。
分别设置阴性对照组、阳性对照组和实验组，在阴性对照组、阳性对照组和实验组的每孔分别加入100μL RPMI-1640完全培养基、含0.64wt％苯酚的RPMI-1640完全培养基、含不同浓度改性壳聚糖微凝胶的RPMI-1640完全培养基，每组设4个复孔，继续在37℃、5％CO2培养箱中培养24h后，每孔加入20μL MTT溶液，继续培养4h后，弃去培养板中的溶液，每孔加入150μL二甲亚砜溶液，用酶标仪(Infinite 200PRO NanoQuant型，瑞士Tecan公司)在570nm处测定吸光度(optical density，OD)，并计算细胞存活率(cell viability，％)。
式2中，实验组OD570nm表示实验组在570nm处的吸光度，阴性对照组OD570nm表示阴性对照组在570nm处的吸光度。
通过计算可知，在相同条件下阳性对照组的Hela细胞存活率为0，阴性对照组的Hela细胞存活率为100％，实验组(即实施例1所制得的改性壳聚糖微凝胶在不同质量浓度时)的Hela细胞存活率如图3所示。从图3中看出，在不同质量浓度的改性壳聚糖微凝胶溶液中，Hela细胞的存活率均大于90％，根据药典标准，说明本发明所制备的改性壳聚糖微凝胶无细胞毒性，具有较好的生物相容性。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，但本发明的保护范围并不局限于此。凡依本发明申请专利范围未违背本发明涉及原则所做的均等变化、简化与修饰，皆应属本发明的涵盖范围。
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