一种利用单烯醇酮醋酸酯制备布瑞诺龙的方法
阅读说明：本技术 一种利用单烯醇酮醋酸酯制备布瑞诺龙的方法 (Method for preparing breynolone by using monoalcohol ketone acetate ) 是由 杨帆 盖祎 戴龙华 汤杰 汤天天 于 2020-11-19 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用单烯醇酮醋酸酯制备药物布瑞诺龙的方法,以单烯醇酮醋酸酯为原料,经氢化-水解、氧化、酶催化还原“四步反应三锅法”制备布瑞诺龙。本发明制备方法中,采用来自于天然产物的原料单烯醇酮醋酸酯,其5α-构型单一,反应过程中酶催化还原3-酮基的立体选择性高,制备方法中无需使用成本较高的化学试剂和催化剂,避免常见制备方法中产生许多废弃物、反应条件苛刻等的缺陷。本发明反应条件温和,操作简单方便,可以实现药物布瑞诺龙的高效、低成本制备。(The invention discloses a method for preparing medicine breynolone by using monoalcohol ketone acetate, which is used for preparing the breynolone by using monoalcohol ketone acetate as a raw material through a four-step reaction three-pot method of hydrogenation-hydrolysis, oxidation and enzyme catalytic reduction. In the preparation method, the monoalkenolone acetate serving as the raw material from a natural product is adopted, the 5 alpha-configuration is single, the stereoselectivity of the enzyme-catalyzed reduction of the 3-ketone group in the reaction process is high, and a chemical reagent and a catalyst with higher cost are not needed in the preparation method, so that the defects of generation of a plurality of wastes, harsh reaction conditions and the like in the common preparation method are avoided. The method has mild reaction conditions and simple and convenient operation, and can realize the high-efficiency and low-cost preparation of the medicine, namely the breynolone.)
技术领域
本发明属于有机化合物制备技术领域，涉及单烯醇酮醋酸酯制备药物布瑞诺龙的方法。
背景技术
产后抑郁症(postpartum depression，PPD)是女性于产褥期出现的明显精神综合症。2016年流行病学资料显示，全球PPD患者有3亿例，发达国家抑郁症患病率为7％～40％。PPD的病理生理学尚未完全了解，可能与许多因素有关，包括激素和遗传因素。在布瑞诺龙获得批准之前，未见专门批准用于PPD的治疗药物,多数选择抗抑郁药、激素、电休克和心理治疗。
布瑞诺龙，化学名为5α-孕甾烷-3α-羟基-20-酮，是FDA批准的首个也是唯一一种获得产后抑郁适应症的药物，是一种GABAA受体正性变构调节剂，可纠正产后GABAA受体系统紊乱，尤其是恢复GABAA受体和NMDA受体活性之间的平衡。
关于布瑞诺龙的合成，较为经典的合成方法(世界知识产权组织专利WO2009108804，中国发明专利文献CN103396467A)是以3β-羟基-5-孕甾烯-20-酮(简称：孕烯醇酮)为起始原料，利用H2/钯碳还原5,6-位双键，进而通过Mitsunobu反应，在三苯基膦、偶氮二甲酸二乙酯、三氟醋酸、苯甲酸钠存在下，将3β-构型进行反转，进而在甲醇中回流水解得到布瑞诺龙，该反应成本较高，反应过程中有许多废弃物产生，同时，5,6-位双键还原过程中总有一定比例的5β-立体异构体产生，分离纯化困难且导致总收率降低。而J.Med.Chem.,2005,48(16),5203报道的方法则利用三仲丁基硼氢化钾在-78℃条件下还原3-酮基制备3α-羟基，收率仅为63％。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用从剑麻提取硬质纤维下脚料中获得的天然5α-孕甾-16-烯-20-酮-3β-醇醋酸酯(简称：单烯醇酮醋酸酯)为原料制备布瑞诺龙的方法。本发明的制备方法中，以单烯醇酮醋酸酯为原料，经氢化-水解、氧化、酶催化还原“四步反应三锅法”制备布瑞诺龙。
本发明上述制备方法的反应过程如反应式(I)所示：
反应式(I)
本发明方法包括如下步骤：
(1)氢化反应：在有机溶剂中，单烯醇酮醋酸酯、氢气、催化剂在加热条件下进行氢化反应，然后在无机碱存在下进行水解反应，得5α-孕甾烷-3β-羟基-20-酮；反应过程如反应式(1)所示：
反应式(1)
(2)氧化反应：5α-孕甾烷-3β-羟基-20-酮溶于有机溶剂中，在氧化剂和催化剂存在下控温反应得5α-孕甾烷-3,20-二酮；反应过程如反应式(2)所示：
反应式(2)
(3)酶催化还原反应：5α-孕甾烷-3,20-二酮在有机溶剂、碱、羰基还原酶和辅酶存在下，经酶催化还原反应得目标产物布瑞诺龙；反应过程如反应式(3)所示：
反应式(3)
步骤(1)中，所述有机溶剂选自乙醇、甲醇、异丙醇、四氢呋喃、甲苯、醋酸乙酯等中的一种或几种；优选地，为乙醇。
步骤(1)中，所述催化剂选自钯/炭、钯/碳酸钙、钯/硫酸钡、活性镍、二氧化铂等中的一种或多种；优选地，为钯/炭。
步骤(1)中，所述单烯醇酮醋酸酯、氢气、催化剂、无机碱的质量比为1：(0.01-0.1)：(0.03-0.1)：(0.2-0.3)；优选地，为1：0.05：0.05：0.23。
步骤(1)中，所述氢化反应的温度为45-65℃；优选地，为50℃。
步骤(1)中，所述氢化反应的时间为6-12h；优选地，为8h。
步骤(1)中，所述无机碱选自碳酸钾、碳酸锂、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠、氢氧化钾、氢氧化钠等中的一种或多种；优选地，为碳酸钾。
步骤(1)中，所述水解反应的温度为25℃-78℃；优选地，为60℃。
步骤(1)中，所述水解反应的时间为2-5h；优选地，为3h。
步骤(2)中，所述有机溶剂选自二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮、甲苯、醋酸乙酯、2-甲基四氢呋喃等中的一种或几种；优选地，为二氯甲烷。
步骤(2)中，所述氧化剂选自次氯酸钠、三氧化二铬、PCC、PDC、重铬酸钠、重铬酸钾等中的一种或多种；优选地，为次氯酸钠。
步骤(2)中，所述催化剂选自四甲基哌啶氧化物(TEMPO)、4-羟基-四甲基哌啶氧化物、4-苄酰氧基-四甲基哌啶氧化物等中的一种或多种；优选地，为四甲基哌啶氧化物(TEMPO)。
步骤(2)中，所述5α-孕甾烷-3β-羟基-20-酮、氧化剂、催化剂的质量比为1：(3.5-4.5)：(0.03-0.05)；优选地，为1：3.75：0.03。
步骤(2)中，所述氧化反应的温度为0℃-25℃；优选地，为10℃。
步骤(2)中，所述氧化反应的时间为2-5h；优选地，为2.5h。
步骤(3)中，所述有机溶剂选自甲基叔丁基醚、醋酸乙酯、甲基异丁基酮、异丙醇、叔丁醇、甲醇等中的一种或多种；优选地，为甲基叔丁基醚。
步骤(3)中，所述无机碱选自氢氧化钠、氢氧化钾、碳酸钾、碳酸锂、碳酸钠、碳酸氢钾、碳酸氢钠等中的一种或多种；优选地，为氢氧化钠。
步骤(3)中，所述羰基还原酶为所述羰基还原酶RH，所述羰基还原酶RH的蛋白序列如SEQ ID NO.1所示：marlegkvaivtgaaqgmgaatarlfvhegarvvlgdvleekgralaaelgdaaiftpldvsdesswesavavavdrfggldilvnnagvmhwapiedldvarterlldvnvlgnllgakavvpimkkagrgvivnissvdglrgvnglaaytaskwavrgltkalayelgpagirvcsvhpggvdttlgnpgglvgddlqskyvgvplqrigesediaratlfvasdeasyisgaelavdggwsagtyypglpgtppalmpn。
步骤(3)中，所述辅酶选自NAD+、NADP+、NADH、NADPH中的一种或多种；优选地，NAD+。
步骤(3)中，所述5α-孕甾烷-3,20-二酮、碱、还原酶和辅酶的质量比为1：(0.12-0.15)：(0.4-1)：(0.0004-0.001)；优选地，为1：0.13：0.5：0.00045。
步骤(2)中，所述酶催化还原反应的温度为25℃-35℃；优选地，为30℃。
步骤(2)中，所述酶催化还原反应的时间为12-30h；优选地，为24h。
本发明的有益效果在于：
1)以从植物剑麻提取硬质纤维下脚料资源再利用获得的天然产物单烯醇酮醋酸酯为原料，其5α-构型单一，克服了现有方法中还原4-或5-位双键时存在立体异构体的缺陷，无需分离异构体操作并避免了分离造成的损失和成本提升。
2)酶催化还原3-酮基的反应立体选择性高，构型单一地获得3α-羟基结构，而无需使用成本较高的化学试剂和催化剂，避免了常见制备方法中产生许多废弃物、反应条件苛刻的缺陷。
本发明反应条件温和、操作简单方便，可以实现药物布瑞诺龙的高效、低成本、环境友好制备。
具体实施方式
结合以下具体实施例，对发明作进一步的详细说明。实施本发明的过程、条件、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公知常识，本发明没有特别限制内容。(实施例中展示的均为优化实验条件下获得的结果，具有潜在的应用价值)。
实施例1 5α-孕甾烷-3β-羟基-20-酮的制备
1L的加氢罐中加入单烯醇酮醋酸酯50g、乙醇500g、5％钯/碳2.5g，用氮气置换五次，搅拌升温至50±5℃，控制体系温度在50±5℃，压力0.005～0.01MPa，加氢反应6～12h，TLC检测反应终点。用氮气置换三次，过滤、乙醇漂洗，滤液加入11.5g碳酸钾和10g水，并升温至60±5℃保温反应2～5h，用10％稀盐酸调pH至中性，减压浓缩乙醇至大量结晶，冷至0±5℃析晶12～24h过滤、冰乙醇淋洗，固体置75℃热风偱环烘箱干燥6～12h，得白色结晶5α-孕甾烷-3β-羟基-20-酮42.2g，收率95％。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ3.63-3.57(m,1H),2.52(dd,J＝9.0,8.8Hz,1H),2.19-2.11(m,1H),2.11(s,3H),2.01-1.99(m,1H),1.83-1.63(m,5H),1.46-1.10(m,13H),1.03-0.88(m,2H),0.81(s,3H),0.72-0.65(m,1H),0.60(s,3H)。
实施例2 5α-孕甾烷-3,20-二酮的制备
500mL的三口瓶内加入水16g，搅拌下依次加入碳酸氢钠2g、二氯甲烷200g、上步加氢水解物5α-孕甾烷-3β-羟基-20-酮40g，搅拌全溶后降温，当反应液内温到10℃时加入四甲基哌啶氧化物(TEMPO)1.2g。均匀滴加10％次氯酸钠溶液150g，滴加时间控制在1～2h，滴加温度控制在6～15℃。滴加结束后在10～15℃保温反应2～5h，取样TLC分析原料反应完，反应结束后加入20％大苏打溶液30g淬灭反应，搅拌10分钟，静置分层(乳化层分至水相萃取)，水相用二氯甲烷萃取一次搅拌30分钟，静置分层，合并二氯甲烷有机相用饱和氯化钠溶液80g*3洗涤三次搅拌10分钟，静置分层。有机相减压条件下浓缩二氯甲烷至大量结晶后再用水夹带两次至二氯甲烷浓缩尽，加水200g水搅拌20分钟，抽滤、滤饼用热风偱环75℃干燥6～12h得淡黄色至类白色粉末5α-孕甾烷-3,20-二酮39.2g，收率99％。1H NMR(CDCl3,400MHz):δ2.56-2.51(m,1H),2.44-1.96(m,10H),1.74-1.13(m,13H),1.02(s,3H),1.00-0.89(m,1H),0.82-0.77(m,1H),0.63(s,3H)。
实施例3 5α-孕甾烷-3α-羟基-20-酮(布瑞诺龙)的制备
将BL21(DE3)/pET24a-RH菌种接种装有4mL LB培养基(酵母提取物5g/L，胰蛋白胨10g/L，氯化钠10g/L)的试管，37℃培养过夜，培养液接种装有1L TB培养基(酵母提取物24g/L，胰蛋白胨12g/L，三水合磷酸氢二钾16.4g/L，磷酸二氢钾2.3g/L，甘油5g/L)的三角瓶，37℃振荡培养至OD＝3.0时，加入0.2mM的异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导，并降温至25℃继续培养过夜。3500转/分离心20分钟收集沉淀，得到RH菌体，RH菌体加3倍体积的去离子水，超声破胞后8000rpm离心30min，取上清得到RH酶液。使用BL21(DE3)/pET24a-GDH菌种，按照同样的方法得到GDH酶液。
3L发酵罐中加入5α-孕甾烷-3,20-二酮100g，一水葡萄糖80g，磷酸二氢钾10g，甲基叔丁基醚210g，纯化水1000g，充分搅拌，升温至30℃，用氢氧化钠调节pH＝7.0，GDH酶液25g，RH酶液23g，烟酰胺腺嘌呤二核苷酸0.045g，反应过程中采用氢氧化钠溶液控制pH＝7.5±0.2，温度25～30℃，搅拌反应12～30小时。HPLC测定，底物转化率为97％。转化完成后，采用2000mL二氯甲烷分三次萃取转化液，得到的二氯甲烷料层用150g*3饱和食盐水洗涤三次、无水硫酸钠干燥、过滤，蒸干二氯甲烷后，加入240g甲醇重结晶，过滤、烘干得5α-孕甾烷-3α-羟基-20-酮89g，收率88.0％。1HNMR(CDCl3,400MHz):δ4.05(s,1H),2.53(dd,J＝9.1,8.2Hz,1H),2.17-2.11(m,1H),2.11(s,3H),2.02-1.99(m,1H),1.69-1.12(m,19H),1.01-0.93(m,1H),0.84-0.78(m,1H),0.78(s,3H),0.60(s,3H)。13C NMR(CDCl3,100MHz):δ209.82,66.46,63.84,56.77,54.19,44.27,39.09,39.07,36.10,35.84,35.48,32.19,31.95,31.54,28.98,28.44,24.37,22.76,20.79,13.47,11.18。HRMS(ESI):[M+Na]+(C21H34NaO2)计算值341.2457,实测值341.2449。
本发明的方法以易得的天然产物为原料高效制备了布瑞诺龙，产物立体选择性高，无需使用成本较高的化学试剂和催化剂，为进一步提升药物布瑞诺龙在保障人类健康中的作用提供了基础。
本发明的保护内容不局限于以上实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。
SEQUENCE LISTING
<110> 华东师范大学，上海格苓凯生物科技有限公司
<120> 一种利用单烯醇酮醋酸酯制备布瑞诺龙的方法
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 263
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Met Ala Arg Leu Glu Gly Lys Val Ala Ile Val Thr Gly Ala Ala Gln
1 5 10 15
Gly Met Gly Ala Ala Thr Ala Arg Leu Phe Val His Glu Gly Ala Arg
20 25 30
Val Val Leu Gly Asp Val Leu Glu Glu Lys Gly Arg Ala Leu Ala Ala
35 40 45
Glu Leu Gly Asp Ala Ala Ile Phe Thr Pro Leu Asp Val Ser Asp Glu
50 55 60
Ser Ser Trp Glu Ser Ala Val Ala Val Ala Val Asp Arg Phe Gly Gly
65 70 75 80
Leu Asp Ile Leu Val Asn Asn Ala Gly Val Met His Trp Ala Pro Ile
85 90 95
Glu Asp Leu Asp Val Ala Arg Thr Glu Arg Leu Leu Asp Val Asn Val
100 105 110
Leu Gly Asn Leu Leu Gly Ala Lys Ala Val Val Pro Ile Met Lys Lys
115 120 125
Ala Gly Arg Gly Val Ile Val Asn Ile Ser Ser Val Asp Gly Leu Arg
130 135 140
Gly Val Asn Gly Leu Ala Ala Tyr Thr Ala Ser Lys Trp Ala Val Arg
145 150 155 160
Gly Leu Thr Lys Ala Leu Ala Tyr Glu Leu Gly Pro Ala Gly Ile Arg
165 170 175
Val Cys Ser Val His Pro Gly Gly Val Asp Thr Thr Leu Gly Asn Pro
180 185 190
Gly Gly Leu Val Gly Asp Asp Leu Gln Ser Lys Tyr Val Gly Val Pro
195 200 205
Leu Gln Arg Ile Gly Glu Ser Glu Asp Ile Ala Arg Ala Thr Leu Phe
210 215 220
Val Ala Ser Asp Glu Ala Ser Tyr Ile Ser Gly Ala Glu Leu Ala Val
225 230 235 240
Asp Gly Gly Trp Ser Ala Gly Thr Tyr Tyr Pro Gly Leu Pro Gly Thr
245 250 255
Pro Pro Ala Leu Met Pro Asn
260
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