阅读说明：本技术 一种利用微生物转化生产7α-羟基-脱氢表雄酮的方法 (Method for producing 7 α -hydroxy-dehydroepiandrosterone by microbial transformation ) 是由 申雁冰 王敏 骆健美 邓铭倩 王喜波 王璐 李梦涵 夏梦雷 于 2019-12-24 设计创作，主要内容包括：本发明属于微生物甾体转化技术领域,公开了一种7α-OH-DHEA的生物合成方法。涉及生产菌株为蓝色犁头霉(Absidia coerulea),具体为蓝色犁头霉CGMCC 14124,生产原料为脱氢表雄酮(DHEA)。利用该菌种的选择性羟基化能力对DHEA进行生物转化,可以有效合成目标产物7α-OH-DHEA。底物DHEA的投料浓度高达5.5g/L时,目标产物的生成率达到了45.5％。该方法实现了绿色环保的生产,为该甾体药物的工业化生产提供了基础。(The invention belongs to the technical field of microbial steroid conversion, and discloses a biosynthesis method of 7 α -OH-DHEA, which relates to a production strain of Absidia coerulea (Absidia coerulea), specifically Absidia coerulea CGMCC14124, wherein a production raw material is Dehydroepiandrosterone (DHEA). The DHEA is biologically converted by utilizing the selective hydroxylation capacity of the strain, a target product 7 α -OH-DHEA can be effectively synthesized, when the feeding concentration of a substrate DHEA is up to 5.5g/L, the generation rate of the target product reaches 45.5%, the method realizes green and environment-friendly production, and provides a foundation for the industrial production of steroid medicines.)

一种利用微生物转化生产7α-羟基-脱氢表雄酮的方法

技术领域：

本发明涉及微生物甾体转化和工业真菌技术领域，具体涉及利用一株蓝色犁头霉通过转化DHEA生成7α-OH-DHEA，得到一种制备7α-OH-DHEA。

背景技术：

甾体类药物具有重要的生理活性，是仅次于抗生素的第二大类药物。脱氢表雄酮(DHEA)是自然界生物体内重要的活性物质，对生命代谢活动具有重要调节作用，其羟基化产物7α-OH-DHEA医学上用于控制体重，治疗阿尔茨海默症，具有广泛应用，且高效、低毒。是一种重要的甾体药物，市场需求量极大，应用价值极大。

目前工业上利用化学合成7α-OH-DHEA以醋酸脱氢表雄酮为原料，主要有两种：通过溴代、异构化、酯化、水解得到目标产物，工艺繁琐；通过过氧苯甲酰叔丁酯的自由基取代在7α位一步引入酰氧基，再经水解得到产物。二种方法在合成过程中涉及多种有机试剂，成本非常高，比如醋酸银价格昂贵，同时大量有机溶剂的使用造成环境污染，而且反应条件较为苛刻，反应收率也有限。解决这些问题是甾体工业大规模工业化的关键。

自20世纪50年代利用微生物首次合成甾体激素进入商业化以来，微生物转化已经广泛应用于许多载体药物或药物中间体合成。微生物转化较化学合成药物具有诸多优势：微生物能够产生许多化学结构独特的物质，化学合成途径难以获得；微生物生长周期短，易于调控能够大规模发酵实现工业化生产。现有报道转化DHEA7α羟基化的菌株主要有亚麻刺盘孢、总状毛霉和赤霉菌等，但存在投料浓度低、副产物多等问题，无法满足工业生产要求。蓝色犁头霉是目前甾体药物工业化生产中常见的菌株，且经ARTP诱变与ARTP-LiCl复合诱变选育获得的蓝色犁头霉AL-172具有生长速度快、繁殖周期短、催化效率高的特点。本专利采用高转化率的蓝色犁头霉菌株进行7α-OH-DHEA的生产，为该类甾体药物的合成提供了新途径，具有重要市场经济价值。

发明内容

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为了实现上述目的，本发明将提供一种高效生物转化生产7α-OH-DHEA工艺。具体为通过一株性能优异的蓝色犁头霉菌株，在高投料浓度条件下的进行DHEA7α羟基化的生物转化工艺。本发明的上述目的是通过以下技术方案来实现的：

一株性状优异的蓝色犁头霉菌株AL-172(Absidia coerulea)，其微生物保藏号CGMCC 14124；保藏时间2017年5月11日；保藏单位：中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心。应用上述菌株转化DHEA生成7α-OH-DHEA的方法，其步骤如下：

将蓝色犁头霉AL-172种子液以10％-15％接种量转接入发酵培养基，25-30℃，170-200r/min发酵培养5-8h后，先使用0.3-1.0g/L的DHEA进行诱导，待培养pH至3.8-4.2时，调节发酵液pH至5.6-6.0，同时向发酵培养基中投入浓度2-5g/L的DHEA，转化5-7h后，再次调节发酵液pH至5.4-6.0，补齐剩余底物使得总投料浓度达到3-8g/L，总转化周期48h，期间定时对取样。发酵液经有机溶剂萃取后，取上清液，高效液相色谱检测转化情况。

本发明所述的种子培养基成分如下(g/L)：玉米浆12，葡萄糖10.5，硫酸铵5，酵母膏2-3；水配制，pH6.5。发酵培养基成分如下(g/L)：玉米浆12，葡萄糖11，硫酸铵5，酵母膏2-3；去离子水配制，pH6.5。

所述种子液的培养条件如下：1ml孢子悬浮液接种于种子培养基，在26-30℃，转速170-220r/min的条件下进行培养至培养液pH达到3.8-4.4。

所述孢子悬浮液的制备方法如下：用无菌水将斜面菌丝洗下，将含有大量孢子的悬浮液倒入附有4层灭菌纱布并装有玻璃珠的三角瓶中，充分震荡，配置成浓度为3-10×10⁷个/ml的孢子悬浮液。

优选地，转化时，底物DHEA的终浓度为5-6g/L.

优选地，添加底物DHEA进行诱导时，添加量为0.4-0.6g/L。

有益效果：本发明解决了DHEA7α羟基化反应中低投料浓度问题，再底物DHEA的投料浓度高达5.5g/L时，目标产物的生成率达到了45.5％。该方法为该甾体药物的工业化生产提供了新途径。

附图说明：

图1蓝色犁头霉CGMCC14124生产7α-羟基-脱氢表雄酮示意图。

图2产物7α-羟基-脱氢表雄酮核磁共振H谱图。

图3高投料浓度(5.5g/L)条件下7α-羟基-脱氢表雄酮生产过程曲线。

具体实施方式

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为了使本专利的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，对本专利进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本专利，并不用于限定本发明。

实施例1蓝色犁头霉AL-172对高浓度DHEA的转化

(1)蓝色犁头霉孢子悬浮液的制备：无菌条件下用适量无菌水洗下斜面上菌丝，经含有孢子的悬浮液经4层纱布过滤后倒入盛有玻璃珠的三角瓶中，充分震荡，使孢子悬浮液混匀。

(2)种子培养：将蓝色犁头霉孢子悬浮液接种于种子培养基中，在27℃，转速200r/min条件下培养pH到4.1-4.2，制得蓝色犁头霉种子液。

所述种子培养基组分如下：玉米浆12g/L,葡萄糖10g/L,酵母膏2g/L,硫酸铵5g/L,水配制，pH6.5。

(3)发酵培养及转化：种子液以12％接种量接入发酵培养基，27℃，180r/min条件下培养发酵液pH至3.8，NaOH调节发酵液pH至5.6，向发酵培养基中一次性加入浓度5.5g/LDHEA,转化24h.所述发酵培养基组分如下：玉米浆12g/L,葡萄糖10g/L,酵母膏2g/L,硫酸铵5g/L,去离子水配制，pH6.5。

在本实施例中，DHEA投料浓度为2g/L,转化结束后，测得目标产物生产率为43％，副产物一种，易于后期分离，该菌株可以有效转化DHEA生成目标产物7α-OH-DHEA，说明利用该方法可以生产目标产物7α-OH-DHEA。

实施例2蓝色犁头霉AL-172对高浓度DHEA的转化

(1)种子培养

将蓝色犁头霉孢子悬浮液1ml接种于种子培养基中，在28℃，转速200r/min条件下培养pH到4.1-4.2，制得蓝色犁头霉种子液。

所述种子培养基组分如下：玉米浆12g/L,葡萄糖10g/L,酵母膏2g/L,硫酸铵5g/L,水配制，pH 6.5。孢子悬浮液如实施例1中所述。

(2)生物转化

当种子液pH为3.8时，种子液以12％接种量接入发酵培养基，28℃，180r/min发酵培养5h后，先用0.5g/L的DHEA进行诱导，待培养pH至3.6时，调节发酵液pH至5.6时，加入5g/L的底物DHEA，转化48h。

所述发酵培养基组分如下：玉米浆12g/L,葡萄糖10g/L,酵母膏2.5g/L,硫酸铵5g/L,水配制，pH6.5。

在本实施例中，底物DHEA投料总浓度为5.5g/L,菌株转化48h后，目标产物7α-OH-DHEA生成率达到43％。

实施例3蓝色犁头霉AL-172对高浓度DHEA的转化

(1)种子培养

将蓝色犁头霉孢子悬浮液1ml接种于种子培养基中，在28℃，转速200r/min条件下培养pH到4.1-4.2，制得蓝色犁头霉种子液。

所述种子培养基组分如下：玉米浆12g/L,葡萄糖10g/L,酵母膏2.5g/L,硫酸铵5g/L,水配制，pH 6.5。孢子悬浮液如实施例1中所述。

(2)生物转化

当种子液pH为3.8时，种子液以12％接种量接入发酵培养基，28℃，180r/min发酵培养5h后，先用0.5g/L的DHEA进行诱导，待培养pH至3.6时，调节发酵液pH至5.6时，加入3g/L的底物DHEA，转化6h后再次调节发酵液pH至5.6，添加2g/L的DHEA补齐剩余的底物，底物总添加量达到5.5g/L，转化持续48h。

所述发酵培养基组分如下：玉米浆12g/L,葡萄糖10g/L,酵母膏2g/L,硫酸铵5g/L,水配制，pH6.5。

在本实施例中，底物DHEA投料总浓度为5.5g/L,菌株转化48h后，目标产物7α-OH-DHEA生成率达到45.5％。

以上具体实施例对本发明做了进一步详述，但只是描述性的，不对本发明构成任何限制。本领域技术人员应理解的是，在不偏离本发明的精神和范围下可以对本发明的技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改或替换均落入本发明的保护范围。因此，本专利的保护范围应以所附权利要求为准。