具体实施方式

下面结合具体实施例和附图对本发明的技术方案做进一步说明，但应该理解本发明的保护范围并不受具体实施例的限制。

实施例1

3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯(羟基酪醇羟丁酸酯)，其结构如式Ⅰ所示：

制备方法一：

S1、β-苄氧基丁酸的合成(5)

称取巴豆酸(1)(2.55g,29.7mmol)于150ml圆底烧瓶中，加入苯甲醇(3)(30ml)，再加入醋酸汞(9.63g,30mmol)，常温搅拌过夜，将烧瓶放入低温冷凝槽冷却至0℃，在5-10min内加入30ml的3N氢氧化钠，然后加入30ml 0.5M(0.57g)硼氢化钠的3N氢氧化钠水溶液，保持溶液在0℃3-10min。取出室温搅拌1-2h，过滤得滤液，75ml乙醚萃取3-4次以除去过量的苯甲醇。取水层用10％盐酸酸化至pH2，有大量白色固体析出，过滤得β-苄氧基丁酸(5)，白色固体，4.32g，产率75％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.40–7.28(m,5H),4.58(dd,J＝33.0,11.6Hz,2H),4.30–4.19(m,1H),3.93–3.18(m,1H),3.55(d,J＝5.5Hz,1H),1.44(d,J＝5.9Hz,3H).β-苄氧基丁酸的¹H NMR谱图如图6所示。

S2、3,4-二苄氧基苯乙醇的合成(6)

称取3,4-二羟基苯乙醇(2)(1g,6.49mmol)和碳酸钾(3.59g,25.9mmol)于50ml圆底烧瓶中，加入无水丙酮(20ml)溶解，再加入溴化苄(4)(1.62ml,13.62mmol)，于70℃搅拌回流4-5h,TLC检测反应完全，滤除碳酸钾，浓缩，拌样，柱层析(DCM:EA＝20:1)得3,4-二苄氧基苯乙醇(6)，白色固体1.86g，产率86％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45–7.43(m,4H),7.39–7.26(m,6H),6.88d,J＝8.1Hz,1H),6.81(d,J＝2.0Hz,1H),6.73(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),5.15(s,2H),5.13(s,2H),3.77(q,J＝6.3Hz,2H),2.75(t,J＝6.4Hz,2H).3,4-二苄氧基苯乙醇的¹H NMR谱图如图7所示。

S3、3-苄氧基-3’,4’-二苄氧基-丁酸苯乙酯的合成(7)

称取β-苄氧基丁酸(5)(1.24g,6.4mmol)于100ml圆底烧瓶，加入THF(45ml)溶解，再加入3,4-二苄氧基苯乙醇(6)(1.34g,4mmol)，EDCI(1.53g,8mmol)，DMAP(50mg)于30℃油浴搅拌反应3-4h，TLC检测，3-苄氧基丁酸消失，停止反应。浓缩，加入EA溶解洗涤2-3次，将所得溶液浓缩，拌样，柱层析(PE：DCM＝1:1)得3-苄氧基-3’,4’-二苄氧基-丁酸苯乙酯(7)，粉红色油状物823mg，产率40％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.47–7.39(m,4H),7.38–7.26(m,10H),7.25–7.23(m,1H),6.85(d,J＝8.2Hz,1H),6.80(d,J＝1.9Hz,1H),6.71(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),5.12(s,2H),5.11(s,2H),4.49(dd,J＝33.0,11.6Hz,2H),4.28–4.17(m,2H),4.02–3.92(m,1H),2.81(t,J＝7.1Hz,2H),2.61(dd,J＝15.0,7.3Hz,1H),2.39(dd,J＝15.0,5.7Hz,1H),1.22(d,J＝6.2Hz,3H).3-苄氧基-3’,4’-二苄氧基-丁酸苯乙酯的¹H NMR谱图如图8所示。

S4、3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯的合成I(8)

称取3-苄氧基-3’,4’-二苄氧基-丁酸苯乙酯(7)(2g,3.92mmol)于100ml圆底烧瓶，加入无水甲醇(40ml)溶解，再加入10％Pd/C(200mg)，室温下通氢气(氢气的压力为一个大气压)搅拌反应16h，过滤，浓缩，柱层析(DCM:MeOH＝80:1)得3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯(8)，无色至淡黄色油状物762mg，产率80％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.76(d,J＝8.0Hz,1H),6.70(d,J＝1.8Hz,1H),6.69–6.51(m,2H),6.33(s,1H),4.32–4.23(m,2H),4.23–4.14(m,1H),3.42(s,1H),2.79(t,J＝6.8Hz,2H),2.48–2.37(m,2H),1.20(d,J＝6.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.88,143.92,142.69,130.17,121.04,115.95,115.52,65.51,64.71,42.89,34.25,22.31.HRMS(ESI):calcd for C12H16NaO5+[M+Na]+,263.0890；found 263.0891.3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯的¹H NMR谱图如图11所示。3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯的13C NMR谱图如图12所示。3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯的HRMS(ESI)谱图如图13所示。

制备方法二：

S1、3,4-二苄氧基苯乙醇的合成(6)

称取3,4-二羟基苯乙醇(2)(1g,6.49mmol)和碳酸钾(3.59g,25.9mmol)于50ml圆底烧瓶中，加入无水丙酮(20ml)溶解，再加入溴化苄(4)(1.62ml,13.62mmol)，于70℃搅拌回流4-5h,TLC检测反应完全，滤除碳酸钾，浓缩，拌样，柱层析(DCM:EA＝20:1)得3,4-二苄氧基苯乙醇(6)，白色固体1.86g，产率86％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.45–7.43(m,4H),7.39–7.26(m,6H),6.88d,J＝8.1Hz,1H),6.81(d,J＝2.0Hz,1H),6.73(dd,J＝8.1,2.0Hz,1H),5.15(s,2H),5.13(s,2H),3.77(q,J＝6.3Hz,2H),2.75(t,J＝6.4Hz,2H).3,4-二苄氧基苯乙醇的¹H NMR谱图如图7所示。

S2、3-氧代丁酸的制备(10)

量取乙酰乙酸乙酯(9)26ml于圆底烧瓶中，加入新配制的1N的NaOH水溶液100ml，于60℃油浴反应，3h后点板检测反应，反应完全，待反应液冷却至室温，将反应瓶置于0℃冰浴环境中，向反应液中缓慢滴加10％的稀盐酸，酸化至PH＝3，待反应液温度回升至室温再加入NaCl固体使反应溶液饱和，反应液用乙酸乙酯萃取三次，合并有机层，浓缩，干法拌样，柱层析，得透明液体3-氧代丁酸(冷冻后成蜡状固体)2.80g，产率80％。

S3、3-氧代-3’,4’-二苄氧基-丁酸苯乙酯的合成(11)

称取3,4-二苄氧基苯乙醇(1.70g，5mmol),3-氧代丁酸(1.02g，10mmol)于圆底烧瓶中，加入30ml的DCM，超声溶解，再向混合溶液中依次加入EDCI1.85 g，DMAP100 mg，室温反应，1h后点板检测反应，反应完全，展开剂PE：EA＝3:1，Rf＝0.7，将反应液浓缩，加入25ml的饱和氯化钠水溶液，用乙酸乙酯萃取，有机层浓缩，干法拌样，柱层析，得类白色蜡状固体(干燥后冷冻制得)3-氧代-3’,4’-二苄氧基-丁酸苯乙酯1.88g，产率88％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ7.49–7.26(m,10H),6.87(d,J＝8.2Hz,1H),6.81(d,J＝2.0Hz,1H),6.71(dd,J＝8.2,2.0Hz,1H),5.13(d,J＝7.0Hz,1H),4.28(t,J＝7.0Hz,2H),3.38(s,2H),2.85(t,J＝7.0Hz,2H),2.17(s,3H).3-氧代-3’,4’-二苄氧基-丁酸苯乙酯的¹H NMR谱图如图9所示。

S4、3-氧代-3’,4’-羟基-丁酸苯乙酯的合成(12)

称取3-氧代-3’,4’-二苄氧基-丁酸苯乙酯1.00g于双颈瓶中，加入25ml甲醇，超声溶解，在氩气保护下加入100mg的Pd/C，向反应瓶中通入氢气并在真空状态下置换三次，室温反应，2h后点板检测反应，反应完全,将反应液抽滤，取滤液，浓缩，得类白色蜡状固体(干燥后冷冻制得)3-氧代丁酸3,4-二羟基苯乙酯0.54g，产率95％。1H NMR(400MHz,DMSO)δ8.71(d,J＝23.2Hz,2H),6.63(d,J＝8.0Hz,1H),6.60(d,J＝1.7Hz,1H),6.47(dd,J＝7.9,1.7Hz,1H),4.17(t,J＝7.1Hz,2H),3.56(s,2H),2.70(t,J＝7.0Hz,2H),2.14(s,3H).3-氧代-3’,4’-羟基-丁酸苯乙酯的¹H NMR谱图如图10所示。

S5、3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯的合成II(8)

称取3-氧代-3’,4’-羟基-丁酸苯乙酯500mg于50ml圆底烧瓶中，加入20ml无水乙醇，超声溶解，将反应瓶置于0℃冰浴中，待反应液温度稳定后，分批缓慢加入NaBH495.78mg,15min后点板检测反应，反应完全，随后向反应液中滴加无水丙酮，猝灭剩余NaBH4，再向反应液中滴加饱和的盐酸乙醇溶液，酸化至PH＝5，浓缩反应液，干法拌样，柱层析，得无色至淡黄色油状物3,4-二羟基苯乙基3-羟基丁酸酯430mg，产率85％。1H NMR(400MHz,CDCl3)δ6.76(d,J＝8.0Hz,1H),6.70(d,J＝1.8Hz,1H),6.69–6.51(m,2H),6.33(s,1H),4.32–4.23(m,2H),4.23–4.14(m,1H),3.42(s,1H),2.79(t,J＝6.8Hz,2H),2.48–2.37(m,2H),1.20(d,J＝6.3Hz,3H).13C NMR(101MHz,CDCl3)δ172.88,143.92,142.69,130.17,121.04,115.95,115.52,65.51,64.71,42.89,34.25,22.31.HRMS(ESI):calcd forC12H16NaO5+[M+Na]+,263.0890；found 263.0891.3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯的¹HNMR谱图如图11所示。3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯的13C NMR谱图如图12所示。3-羟基-3’,4’-二羟基-丁酸苯乙酯的HRMS(ESI)谱图如图13所示。

实施例2

1、实验材料

羟基酪醇醋酸酯从美国Santa公司购买，CAS号69039-02-7；β羟丁酸乙酯从美国阿拉丁公司购买，CAS号24915-95-5。

2、实验动物饲养及模型建立

本实验选用8周龄250g的成年雄性SD大鼠，从上海海军军医大学动物中心购买。大鼠饲养在可控温度(22度到28度)和湿度(60％)的动物房内，房间的灯光维持在12小时白天、12小时黑夜的循环中，在实验进行中大鼠能够自由进食和进水。本实验采用睡眠剥夺方法建立大鼠脑疲劳模型。实验大鼠一共分为五组，每组10只。五组分别为：(1)正常饲养组同时每天灌胃生理盐水(以下简称对照组)；(2)用睡眠剥夺法建立的脑疲劳模型同时每天灌胃生理盐水(以下简称脑疲劳组)(3)脑疲劳同时每天灌胃35mg/kg的羟基酪醇醋酸酯；(以下简称HTac组，如下表所示)(4)脑疲劳同时每天灌胃23.6mg/kg的β羟丁酸乙酯(以下简称HBET组，如下表所示)；(5)脑疲劳同时每天灌胃42.9mg/kg的羟基酪醇羟丁酸酯(以下简称HTHB组，如下表所示)。

动物在动物房预适应一周，预适应期间灌胃法给予药物干预一周，然后在水迷宫实验的获得性训练第二天，开始对除对照组外的大鼠进行小站台水环境法睡眠剥夺，造成脑疲劳应激模型。剥夺装置主要由剥夺箱和站台两个部分组成。箱内盛水，站台大小仅能供大鼠后腿站立，站台与箱底连接，周围注水，站台高出水面，动物放在站台上后，由于动物睡眠状态时肌张力降低，重心前移使其掉入水中而惊醒，为避免掉入水中，动物必须保持轻微抓住站台边沿的状态，从而达到剥夺睡眠造成大鼠脑疲劳的目的。

3、实验方法

1)水迷宫实验

水迷宫装置描述：水迷宫由一个直径120cm，高50cm的大型圆形黑色水池组成的，在计算机的监视屏上被分成四个大小相等的象限。加入自来水至30cm深度。将水迷宫放置在150lx均匀亮度、室温26℃±2℃的实验室中，并包含各种明显的视觉线索(A4纸大小的黑色几何图形即可)。将直径12cm的逃生平台置于第四象限中部水下，调节平台台面距离水面2cm。水中加入无毒无味黑色染料并混匀，确保水面游泳的大鼠看不到平台。每天换一次水。水温稳定26℃±2℃。

水迷宫实验的获得性训练：动物在动物房预适应一周后的第一天对大鼠进行水迷宫实验的获得性训练，第二天继续对大鼠进行水迷宫实验的获得性训练，然后进行睡眠剥夺，第三天对正在进行睡眠剥夺的大鼠进行水迷宫获得性训练，然后进行睡眠剥夺，第四天对正在进行睡眠剥夺的大鼠进行水迷宫获得性训练，然后进行睡眠剥夺，第五天对正在进行睡眠剥夺的大鼠进行水迷宫探索实验和旷场实验。训练期间持续给予药物干预。

获得性训练操作方法：训练试验中，每天每只大鼠均需要在一、二、三象限接受训练，训练顺序见下表。对每个象限实验开始时，将动物放入水中，使其面向池壁的一侧。一旦动物在水中，允许120s定位逃生平台；如果超过120s未找到，则实验者轻轻地将动物引导至平台。一旦动物登上平台，它允许休息10s(如果不足10s需要再次引导)，观察平台上的空间线索。使用视频跟踪系统记录动物发现隐藏平台之前所经过的时间和行进距离。之后，将动物从水迷宫中移出，在大鼠第一个象限的训练完成之后，将动物换一个象限释放，期间保证每只大鼠有五分钟以上的休息时间恢复体温和体力。完成其他两个象限的训练。四天的训练过程中，应保证每天的入水象限得顺序是随机的。

大鼠定位航行试验放置象限顺序

水迷宫探索实验：三天的睡眠剥夺处理结束后，立即对大鼠进行水迷宫探索实验，拿走平台，从第四象限放入大鼠，录像观测大鼠120s游过第四象限的路程和时间。游泳情况。期间，由于大鼠避水求生的本能，大鼠会根据自己在获得性实验中的记忆寻找逃生平台，获得性训练中逃生平台放置于第四象限中间位置。

评价指标：大鼠在第四象限游动的时间和路程的比例。该比例越高，说明大鼠的学习和记忆能力越好。

2)旷场实验

实验装置：旷场实验是评价大鼠情绪经典行为学实验。它的原理基于啮齿类动物有畏惧空旷场地的天性，因此自发活动具有趋避性。其趋避行为的异常，可以指征大鼠情绪的异常。旷场实验装置主要是由黑色PVC材料旷场箱以及视频追踪装置两部分组成，旷场箱的长宽均为80cm,高50cm，距离箱底1.5m悬挂有视频追踪装置。大鼠在旷场箱内可以充分自由活动，视频追踪装置正对旷场箱，用于记录大鼠的活动情况。在软件追踪系统中，将旷场箱内部被划分为4×4的16方格，其中，规定周边的12个方格为周边区，内部的4个方格为中央区。

旷场实验操作方法：水迷宫检查试验结束后，将大鼠放回笼内休息10min，之后在安静环境下将动物放入箱内底面中心，同时进行摄像和计时。观察5min后停止摄像。清洗方箱内壁及底面，以免上次动物余留的信息气息和粪便影响下次测试结果。更换动物，继续实验。根据计算机软件计算可观察移动次数，运动速度和每个方格的运动路程等参数。

评价指标：移动速度，移动次数，中央区域移动路程比。情绪躁狂是脑疲劳的一种表现形式，与对照大鼠相比，实验脑疲劳大鼠会表现出异常兴奋，在旷场中的移动速度会变快，移动次数降低(停止运动的倾向变低)，在旷场中央区运动的路程增加。

3)统计分析

结果以Mean±S.E.M形式表示，其中空白组数据为15只大鼠的统计结果，其他5组数据为10只大鼠的统计学结果，根据99.9％的置信区间剔除了少数不合理数据；数据分析使用One Way-ANOVA分析方法，显著统计学意义为*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001，****p<0.0001。

4、羟基酪醇羟丁酸酯对脑疲劳大鼠学习记忆的改善作用

采用水迷宫实验的方法，检测羟基酪醇羟丁酸酯对大鼠脑疲劳模型学习记忆能力的改善。水迷宫检查实验各项指标，从不同角度说明了睡眠剥夺引起的脑疲劳对大鼠学习记忆能力带来的影响和药物的改善效应。在水迷宫训练实验的过程中，平台被放置在了水迷宫的第四象限的水下，大鼠经过四天的学习后，拿走水下平台，将大鼠放入水池一段时间。大鼠在第四象限停留的时间和路程的比例越高，说明大鼠的学习和记忆能力越好。图1和图2分别显示了对照组、脑疲劳组、HTac组、HBET组和HTHB组的大鼠，在水迷宫检查试验中，在训练时平台所在象限(即第四象限)中，停留的时间比和游动的路程比。结果显示，在第四象限停留时间指标上，脑疲劳组相于对照组存在显著性差异；HTHB组与脑疲劳组存在显著性差异。在第四象限游动距离指标上，脑疲劳组相于对照组存在显著性差异；HTHB组与脑疲劳组存在显著性差异。脑疲劳模型组相对于对照组学习记忆能力有显著下降，相对于羟基酪醇醋酸酯和β羟丁酸乙酯两种药物，新药羟基酪醇羟丁酸酯的使用对脑疲劳模型大鼠的学习记忆能力改善趋势更为明显。

5、羟基酪醇羟丁酸酯对脑疲劳大鼠躁狂情绪的改善作用

采用旷场实验的方法，检测羟基酪醇羟丁酸酯对脑疲劳模型大鼠躁狂情绪的改善。躁狂情绪之后往往伴随不同程度的抑郁情绪，药物改善了脑疲劳带来的躁狂情绪，证明药物具有改善脑疲劳导致的抑郁情绪的潜力。旷场实验各项指标，从不同角度说明了脑疲劳对大鼠躁狂带来的影响和新化合物的改善效应。大鼠在一定面积的正方形旷场中自由活动一段时间，其中的一些行为学指标可以直观的反应大鼠的情绪。图3、图4和图5显示了对照组、脑疲劳组、HTac组、HBET组和HTHB组的大鼠，在旷场实验中的平均运动速度、移动次数和内部区域移动路程比。情绪躁狂的大鼠一定时间内在旷场中的移动会越快，停止运动的倾向越小，故而总移动次数相应减少，同时更倾向于在矿场的内部区域运动而不是旷场边缘运动。。结果显示，在平均运动速度指标上，脑疲劳组相对于对照组存在显著性差异；HTac组、HBET组和HTHB组与脑疲劳组相比均有显著性差异。在移动次数指标上，脑疲劳组相于对照组存在显著性差异；HTac组和HTHB组与脑疲劳组相比均有显著性差异。在内部区域移动路程比指标上，脑疲劳组相于对照组存在显著性差异；HTac组和HTHB组与脑疲劳组相比均有显著性差异。在脑疲劳情况下，大鼠的躁狂情绪显著强于对照组，而羟基酪醇醋酸酯，β羟丁酸乙酯，和羟基酪醇羟丁酸酯三种药物分别使用后，大鼠的躁狂情绪有不同程度上的显著改善。说明合成的新分子羟基酪醇羟丁酸酯在改善情绪方面的作用延续了羟基酪醇醋酸酯和β羟丁酸乙酯的有效性，而且部分指标上的表现优于羟基酪醇醋酸酯或β羟丁酸乙酯。