一种高效酶解秸秆的方法
阅读说明：本技术 一种高效酶解秸秆的方法 (Method for efficiently performing enzymolysis on straws ) 是由 高吉奎 王焕高 余忠丽 于 2020-12-17 设计创作，主要内容包括：本发明属于生物技术领域,具体涉及一种高效酶解秸秆的方法,本发明提供的方法包括：(1)秸秆的预处理：将秸秆粉碎、过筛后,置于蒸锅中用水蒸气蒸煮,然后加入过硫酸氢钾和硼酸组成的混合溶液,保温静置,再加入到去离子水中,保温静置,然后在烘箱中烘至恒重,再进行高压蒸汽灭菌处理,得到预处理后的秸秆；(2)复合酶解培养：将预处理后的秸秆置于含有里氏木霉和米根霉的培养基中培养,即得。本发明提供的高效酶解秸秆的方法克服了传统单一纤维素酶酶解效果低的问题,通过预处理的方法进一步提高了可及性,使秸秆获得了充分利用,并通过包含水解鱼蛋白粉和棉籽蛋白的培养基增强酶活性,具有较大的经济价值。(The invention belongs to the technical field of biology, and particularly relates to a method for efficiently performing enzymolysis on straws, which comprises the following steps: (1) pretreatment of straws: crushing and sieving straws, putting the straws into a steamer, steaming the straws by using water vapor, adding a mixed solution consisting of potassium hydrogen persulfate and boric acid, keeping the temperature and standing the straws, adding the straws into deionized water, keeping the temperature and standing the straws, drying the straws in an oven to constant weight, and performing high-pressure steam sterilization treatment to obtain pretreated straws; (2) compound enzymolysis culture: and (3) placing the pretreated straws in a culture medium containing trichoderma reesei and rhizopus oryzae for culture to obtain the culture medium. The method for efficiently hydrolyzing the straws overcomes the problem of low enzymolysis effect of the traditional single cellulase, further improves the accessibility by a pretreatment method, fully utilizes the straws, enhances the enzyme activity by a culture medium containing hydrolyzed fish protein powder and cottonseed protein, and has higher economic value.)
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及一种高效酶解秸秆的方法。
背景技术
秸秆是成熟农作物茎叶(穗)部分的总称，包括小麦、水稻、玉米、薯类、油菜等农作物在收获籽实后的剩余部分。在农业生产水平较低的时代，秸秆可用于垫圈、喂养牲畜，以及用于堆沤肥。
秸秆是由纤维素、半纤维素和木质素三大组分组成，纤维素处于木质素的包蔽鞘中，而木质素作为一种高度抵抗生物降解的高分子聚合物，并具有一定的结晶度，其聚合度和结晶度愈高，木质素的包蔽现象愈严重，致使纤维素的生物降解也更加困难，经实验证实，未经预处理的秸秆酶解率仅为20％左右。通过预处理的方式可以解决木质素的包蔽问题，降低天然纤维素的聚合度和结晶度，为后续酶解纤维创造前提条件，但不同的预处理方法必然产生不同的酶解效果，有待发现一种能够大幅提高酶解效果的方法。
现代化肥的使用，使得农业对秸秆所制肥料的需求大大减少，秸秆的处理成为一大难题，秸秆不及时处理，还会影响小麦等秋播作物的播种，为了处理秸秆，常常出现大规模焚烧秸秆且屡禁不止的现象，在污染空气质量的同时，更是造成了极大的经济损失。
秸秆的再生使用提供了解决该问题的新思路，现阶段国内外也进行了深入的研究，取得了一定成果，但至今仍然难以实现大规模的工业化生产，糖化发酵是目前秸秆处理中较为成熟的途径之一，然而在预处理方式、酶解条件等方面仍然没能取得较好的效果，特别是能稳定可靠的在工业化生产中应用。
中国专利申请CN104561129A公开了一种秸秆的酶解糖化处理方法，预处理过程较为简单，不能很好的解决木质素的包蔽现象，从而会影响到最终的酶解效果。
中国专利CN109182418B公开了一种微生物酶解糖化秸秆的方法，能够取得较为有效的酶解糖化效果，但所用发酵培养基过于复杂，成本较高，预处理后的秸秆没有进行灭菌操作，有产生杂菌的风险。
发明内容
本发明旨在提供一种通过有效的预处理显著增强酶解秸秆的可及性，并通过联合酶解和发酵培养的方法获得了较高的酶解转化率，特别是该方法步骤简单、所用原料易于获得，适用于大工业大规模生产，具有较高的经济价值和环保价值。
为了实现上述目的，本发明的技术方案是：
一种高效酶解秸秆的方法，包括以下步骤：
S1:秸秆的预处理；
S2:复合酶解培养：将预处理后的秸秆置于含有里氏木霉和米根霉的培养基中，搅拌均匀后堆积培养,即得。
进一步地，所述步骤S1所述预处理包括以下步骤：
1)将秸秆粉碎、过30目筛后，置于蒸锅中用水蒸气蒸煮2-3h，得蒸煮后的秸秆A；
2)将步骤1)得到的秸秆A加入到由过硫酸氢钾和硼酸制成的混合溶液中，混合溶液加入的质量为秸秆A质量的2-3倍，在65-80℃的条件下保温静置1-2h，得到酸化后的秸秆B；
3)将步骤2)得到的秸秆B加入到去离子水中，在40-60℃的条件下保温静置10-30min，得秸秆C，将秸秆C在100-150℃烘箱中烘至恒重，再进行高压蒸汽灭菌处理，得到最终预处理后的秸秆D。
进一步地，所述步骤2)所述混合溶液的制备方法为：将过硫酸氢钾和硼酸按照1-3:1的质量比混合，将上述混合物溶于去离子水中，即得。
进一步地，所述步骤S2所述里氏木霉的用量为200-300万u/kg，所述米根霉的用量为80-120万u/kg。
进一步地，所述步骤S2所述培养基包括：0.3-0.5g/L的CaCl2、0.1-0.3g/L的MgCl2、0.5-2g/L的蛋白胨、1-2g/L的水解鱼蛋白粉、1-2g/L的棉籽蛋白，余量为缓冲液。
进一步地，所述缓冲液为磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液，其pH为5-6。
进一步地，所述培养基的加入量与加入的秸秆D的质量关系为，1g秸秆D需加入30-45mL培养基。
进一步地，所述步骤S2所述培养的时间为36-48h，培养时的温度为35-45℃。
所述水解鱼蛋白粉为希普集团生产的普乐壮水解鱼蛋白粉，所述棉籽蛋白为希普集团生产的普乐健棉籽蛋白。
与现有技术相比，本发明具有以下优势：
(1)本发明对秸秆进行了彻底充分的预处理，先粉碎过筛并通过水蒸气蒸煮初步处理，再通过由过硫酸氢钾和硼酸制成的混合溶液进行深度破坏，然后再将处理后的秸秆置于去离子水中保温处理，并随后进行烘干和灭菌，显著提高了秸秆酶解的可及性。
(2)经实验充分证实，由本发明方法能够有效去除秸秆中的木质素，去除率可达82％。
(3)在进行充分的预处理后，对处理后的秸秆通过里氏木霉和米根霉联合酶解，并在培养基中加入CaCl2、MgCl2、蛋白胨、水解鱼蛋白粉、棉籽蛋白等成分，产生协同作用促进酶解效果，产生了极高的酶活力，同时还加入了磷酸氢二钠-柠檬酸构成的缓冲体系，保证了在稳定pH值的有效酶解。
(4)本发明提供的高效酶解秸秆的方法经实验证实，与现有技术相比，具有极高的酶解效果，酶解后滤液中的还原糖含量可达320mg/g，具有极大的经济价值。
具体实施方式
以下通过实施例形式的具体实施方式，将本发明的所述内容做进一步解释。但本发明上述主题的范围不仅限于以下实施例。
以下实施例中所用过硫酸氢钾、硼酸、磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液等原材料均为公知的商品化普通原材料，均可从市场上购买获得，其中里氏木霉和米根霉购于山东丰泰生物科技有限公司。
实施例1、一种高效酶解秸秆的方法
一种高效酶解秸秆的方法，包括以下步骤：
S1:秸秆的预处理：
1)将秸秆粉碎、过30目筛后，置于蒸锅中用水蒸气蒸煮2h，得蒸煮后的秸秆A；
2)将步骤1)得到的秸秆A加入到由过硫酸氢钾和硼酸制成的混合溶液中，混合溶液加入的质量为秸秆A质量的2倍，在65℃的条件下保温静置1h，得到酸化后的秸秆B；所述混合溶液的制备方法为：将过硫酸氢钾和硼酸按照1:1的质量比混合，将上述混合物溶于5倍质量的去离子水中，即得；
3)将步骤2)得到的秸秆B加入10倍质量的去离子水中，在40℃的条件下保温静置10min，得秸秆C，将秸秆C在100℃烘箱中烘至恒重，再进行高压蒸汽灭菌处理，灭菌时的温度为121℃、压强为100kPa、灭菌时间为20min，得到最终预处理后的秸秆D；
S2:复合酶解培养：将预处理后的秸秆D置于含有里氏木霉和米根霉的培养基中，所述里氏木霉的用量为200万u/kg，所述米根霉的用量为80万u/kg，所述培养基的加入量与加入的秸秆D的质量关系为，1g秸秆D需加入30mL培养基，搅拌均匀后堆积培养36h,培养时的温度为35℃，即得；所述培养基包括：0.3g/L的CaCl2、0.1g/L的MgCl2、0.5g/L的蛋白胨、1g/L的水解鱼蛋白粉、1g/L的棉籽蛋白，余量为pH为5的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
实施例2、一种高效酶解秸秆的方法
一种高效酶解秸秆的方法，包括以下步骤：
S1:秸秆的预处理：
1)将秸秆粉碎、过30目筛后，置于蒸锅中用水蒸气蒸煮3h，得蒸煮后的秸秆A；
2)将步骤1)得到的秸秆A加入到由过硫酸氢钾和硼酸制成的混合溶液中，混合溶液加入的质量为秸秆A质量的3倍，在80℃的条件下保温静置2h，得到酸化后的秸秆B；所述混合溶液的制备方法为：将过硫酸氢钾和硼酸按照3:1的质量比混合，将上述混合物溶于5倍质量的去离子水中，即得；
3)将步骤2)得到的秸秆B加入10倍质量的去离子水中，在60℃的条件下保温静置30min，得秸秆C，将秸秆C在150℃烘箱中烘至恒重，再进行高压蒸汽灭菌处理，灭菌时的温度为121℃、压强为100kPa、灭菌时间为20min，得到最终预处理后的秸秆D；
S2:复合酶解培养：将预处理后的秸秆D置于含有里氏木霉和米根霉的培养基中，所述里氏木霉的用量为300万u/kg，所述米根霉的用量为120万u/kg，所述培养基的加入量与加入的秸秆D的质量关系为，1g秸秆D需加入45mL培养基，搅拌均匀后堆积培养48h,培养时的温度为45℃，即得；所述培养基包括：0.5g/L的CaCl2、0.3g/L的MgCl2、2g/L的蛋白胨、2g/L的水解鱼蛋白粉、2g/L的棉籽蛋白，余量为pH为6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
实施例3、一种高效酶解秸秆的方法
一种高效酶解秸秆的方法，包括以下步骤：
S1:秸秆的预处理：
1)将秸秆粉碎、过30目筛后，置于蒸锅中用水蒸气蒸煮2h，得蒸煮后的秸秆A；
2)将步骤1)得到的秸秆A加入到由过硫酸氢钾和硼酸制成的混合溶液中，混合溶液加入的质量为秸秆A质量的3倍，在70℃的条件下保温静置1h，得到酸化后的秸秆B；所述混合溶液的制备方法为：将过硫酸氢钾和硼酸按照2:1的质量比混合，将上述混合物溶于5倍质量的去离子水中，即得；
3)将步骤2)得到的秸秆B加入10倍质量的去离子水中，在50℃的条件下保温静置20min，得秸秆C，将秸秆C在120℃烘箱中烘至恒重，再进行高压蒸汽灭菌处理，灭菌时的温度为121℃、压强为100kPa、灭菌时间为20min，得到最终预处理后的秸秆D；
S2:复合酶解培养：将预处理后的秸秆D置于含有里氏木霉和米根霉的培养基中，所述里氏木霉的用量为300万u/kg，所述米根霉的用量为100万u/kg，所述培养基的加入量与加入的秸秆D的质量关系为，1g秸秆D需加入40mL培养基，搅拌均匀后堆积培养40h,培养时的温度为45℃，即得；所述培养基包括：0.4g/L的CaCl2、0.3g/L的MgCl2、2g/L的蛋白胨、2g/L的水解鱼蛋白粉、2g/L的棉籽蛋白，余量为pH为6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
对比例1、一种秸秆预处理的方法
一种秸秆预处理的方法，包括以下步骤：
S1:秸秆的预处理：
1)将秸秆粉碎、过30目筛后，置于蒸锅中用水蒸气蒸煮2h，得蒸煮后的秸秆A；
2)将步骤1)得到的秸秆A加入到质量分数为3％的硫酸溶液中，硫酸溶液加入的质量为秸秆A质量的3倍，在70℃的条件下保温静置1h，得到酸化后的秸秆B；
3)将步骤2)得到的秸秆B加入10倍质量的去离子水中，在50℃的条件下保温静置20min，得秸秆C，将秸秆C在120℃烘箱中烘至恒重，再进行高压蒸汽灭菌处理，灭菌时的温度为121℃、压强为100kPa、灭菌时间为20min，得到最终预处理后的秸秆D。
对比例1与实施例3类似，与实施例3中预处理方法不同的是，对比例1没有加入由过硫酸氢钾和硼酸组成的混合溶液，而是替换为了硫酸溶液。
对比例2、一种酶解秸秆的方法
一种高效酶解秸秆的方法，包括以下步骤：
S1:秸秆的预处理：
1)将秸秆粉碎、过30目筛后，置于蒸锅中用水蒸气蒸煮2h，得蒸煮后的秸秆A；
2)将步骤1)得到的秸秆A加入到由过硫酸氢钾和硼酸制成的混合溶液中，混合溶液加入的质量为秸秆A质量的3倍，在70℃的条件下保温静置1h，得到酸化后的秸秆B；所述混合溶液的制备方法为：将过硫酸氢钾和硼酸按照2:1的质量比混合，将上述混合物溶于5倍质量的去离子水中，即得；
3)将步骤2)得到的秸秆B加入10倍质量的去离子水中，在50℃的条件下保温静置20min，得秸秆C，将秸秆C在120℃烘箱中烘至恒重，再进行高压蒸汽灭菌处理，灭菌时的温度为121℃、压强为100kPa、灭菌时间为20min，得到最终预处理后的秸秆D；
S2:复合酶解培养：将预处理后的秸秆D置于含有里氏木霉和米根霉的培养基中，所述里氏木霉的用量为300万u/kg，所述米根霉的用量为100万u/kg，所述培养基的加入量与加入的秸秆D的质量关系为，1g秸秆D需加入40mL培养基，搅拌均匀后堆积培养40h,培养时的温度为45℃，即得；所述培养基包括：0.4g/L的CaCl2、0.3g/L的MgCl2、5g/L的蛋白胨、余量为pH为6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
对比例2与实施例3类似，与实施例3不同的是，对比例2步骤S2的培养基中没有加入水解鱼蛋白粉和棉籽蛋白。
对比例3、一种酶解秸秆的方法
一种酶解秸秆的方法，包括以下步骤：
S1:秸秆的预处理：
1)将秸秆粉碎、过30目筛后，置于蒸锅中用水蒸气蒸煮2h，得蒸煮后的秸秆A；
2)将步骤1)得到的秸秆A加入到由过硫酸氢钾和硼酸制成的混合溶液中，混合溶液加入的质量为秸秆A质量的3倍，在70℃的条件下保温静置1h，得到酸化后的秸秆B；所述混合溶液的制备方法为：将过硫酸氢钾和硼酸按照2:1的质量比混合，将上述混合物溶于5倍质量的去离子水中，即得；
3)将步骤2)得到的秸秆B加入10倍质量的去离子水中，在50℃的条件下保温静置20min，得秸秆C，将秸秆C在120℃烘箱中烘至恒重，再进行高压蒸汽灭菌处理，灭菌时的温度为121℃、压强为100kPa、灭菌时间为20min，得到最终预处理后的秸秆D；
S2:复合酶解培养：将预处理后的秸秆D置于含有里氏木霉和米根霉的培养基中，所述里氏木霉的用量为300万u/kg，所述米根霉的用量为100万u/kg，所述培养基的加入量与加入的秸秆D的质量关系为，1g秸秆D需加入40mL培养基，搅拌均匀后堆积培养40h,培养时的温度为45℃，即得；所述培养基包括：0.4g/L的CaCl2、0.3g/L的MgCl2、3g/L的蛋白胨、2g/L的水解鱼蛋白粉、余量为pH为6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
对比例3与实施例3类似，与实施例3不同的是，对比例3步骤S2的培养基中没有加入棉籽蛋白。
对比例4、一种酶解秸秆的方法
一种酶解秸秆的方法，包括以下步骤：
S1:秸秆的预处理：
1)将秸秆粉碎、过30目筛后，置于蒸锅中用水蒸气蒸煮2h，得蒸煮后的秸秆A；
2)将步骤1)得到的秸秆A加入到由过硫酸氢钾和硼酸制成的混合溶液中，混合溶液加入的质量为秸秆A质量的3倍，在70℃的条件下保温静置1h，得到酸化后的秸秆B；所述混合溶液的制备方法为：将过硫酸氢钾和硼酸按照2:1的质量比混合，将上述混合物溶于5倍质量的去离子水中，即得；
3)将步骤2)得到的秸秆B加入10倍质量的去离子水中，在50℃的条件下保温静置20min，得秸秆C，将秸秆C在120℃烘箱中烘至恒重，再进行高压蒸汽灭菌处理，灭菌时的温度为121℃、压强为100kPa、灭菌时间为20min，得到最终预处理后的秸秆D；
S2:复合酶解培养：将预处理后的秸秆D置于含有里氏木霉和米根霉的培养基中，所述里氏木霉的用量为300万u/kg，所述米根霉的用量为100万u/kg，所述培养基的加入量与加入的秸秆D的质量关系为，1g秸秆D需加入40mL培养基，搅拌均匀后堆积培养40h,培养时的温度为45℃，即得；所述培养基包括：5.7g/L的蛋白胨、余量为pH为6的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液。
对比例4与实施例3类似，与实施例3不同的是，对比例4步骤S2的培养基中没有加入水解鱼蛋白粉、棉籽蛋白、CaCl2和MgCl2。
实验1、木质素去除率
实验对象：实施例1-3和对比例1预处理后得到的秸秆。
实验方法：将实施例1-3预处理后得到的秸秆和对比例1得到的秸秆通过购于北京索莱宝科技有限公司木质素含量检测试剂盒(货号BC4205)测得预处理前后木质素含量，测定木质素去除率；
木质素去除率的计算公式为：(预处理前秸秆中的木质素含量-预处理后秸秆中的木质素含量)/预处理前秸秆中的木质素含量×100％。
实验结果：如表1所示。
表1：木质素去除率结果
由表1的实验结果可知，实施例1-3相较于对比例1木质素的去除效果显著增加，单一酸体系去除木质素的效果低于实施例1-3通过过硫酸氢钾和硼酸的混合溶液达到的效果。
实验2、酶解糖化实验
实验对象：实施例1-3和对比例2-4的过滤所得的滤液。
实验方法：使用3,5-二硝基水杨酸比色法测定还原糖的含量。
实验结果：如表2所示。
表2：还原糖含量结果测定
组数
实施例1
实施例2
实施例3
对比例2
对比例3
对比例4
还原糖含量
272mg/g
312mg/g
328mg/g
233mg/g
254mg/g
196mg/g
由表2的实验结果可知，实施例1-3具有较高的酶解效果，对比例2在减少水解鱼蛋白粉和棉籽蛋白，所得还原糖含量明显下降，对比例4减少水解鱼蛋白粉、棉籽蛋白、CaCl2和MgCl2,酶解效果进一步下降，而对比例3仅加入水解鱼蛋白粉、CaCl2和MgCl2，而没有加入棉籽蛋白，不能获得比实施例1-3更好的酶解效果，可以得出，在培养基中加入水解鱼蛋白粉、棉籽蛋白、CaCl2和MgCl2可以有效增加里氏木霉和米根霉酶解秸秆获得还原糖的效果，特别是水解鱼蛋白粉和棉籽蛋白的协同使用可以获得更为显著的作用。