阅读说明：本技术 一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的大肠杆菌电化学检测方法 (Escherichia coli electrochemical detection method based on bacteria-mediated azido alkyne cycloaddition and atom transfer radical polymerization ) 是由 许媛媛 苗晋锋 黎伟中 李意 鲍芳 于 2020-10-15 设计创作，主要内容包括：一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的大肠杆菌电化学检测方法,属于生命科学分析技术领域。其检测原理为：将修饰N-3基团的双链DNA固定在金电极表面,在大肠杆菌存在时,Cu～(2+)被大肠杆菌中的铜还原酶NDH-2还原为Cu～+,并催化N-3基团与PBIB发生叠氮炔环加成反应,随后大量FMMA通过eATRP连接聚合在双链DNA末端,最终经方波伏安法测定电流强度与大肠杆菌浓度呈正相关,绘制电化学信号与大肠杆菌浓度之间的标准曲线得到线性方程,测量待测样品的电化学信号通过计算即可实现大肠杆菌的灵敏检测。本发明方法提供了一种对大肠杆菌有高选择性,同时又简单、快捷、灵敏的检测方法,具有良好的实用价值,便于推广。(An Escherichia coli electrochemical detection method based on bacteria-mediated azido alkyne cycloaddition and atom transfer radical polymerization belongs to the technical field of life science analysis. The detection principle is as follows: will modify N 3 Double-stranded DNA of the group is fixed on the surface of a gold electrode, and Cu is contained in the presence of Escherichia coli 2+ Is reduced to Cu by copper reductase NDH-2 in escherichia coli + And catalyze N 3 The group and PBIB generate azide alkyne cycloaddition reaction, then a large amount of FMMA is connected and polymerized at the tail end of double-chain DNA through eATRP, finally the current intensity is measured through square wave voltammetry to be in positive correlation with the concentration of escherichia coli, a standard curve between an electrochemical signal and the concentration of the escherichia coli is drawn to obtain a linear equation, the electrochemical signal of a sample to be measured is measured, and the large amount of FMMA is calculated to realize large measurementSensitive detection of enterobacteria. The method provided by the invention has high selectivity on escherichia coli, is simple, rapid and sensitive, has good practical value and is convenient to popularize.)

一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的大 肠杆菌电化学检测方法

技术领域

一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的大肠杆菌电化学检测方法，属于生命科学分析技术领域。

背景技术

大肠杆菌是一种普遍存在于人和动物胃肠道的共生菌，主要寄生于大肠内，约占肠道菌中的0.1％。致病性大肠杆菌胃肠道感染是全球，特别是发展中国家腹泻爆发的重要原因。近年来，由大肠杆菌引起的食源性疾病普遍发生，大肠杆菌已经成为了食品安全的重要检测对象。目前对食品中大肠杆菌的检测方法主要有三种，即传统的微生物培养鉴定法、免疫学检测方法和PCR检测方法。传统微生物培养是基于细菌分离和培养、形态学鉴定和生化反应来进行细菌种类鉴定，操作简单，准确性较高，但存在培养时间长、操作繁琐等问题，因此其应用受到严重限制；免疫学检测方法具有良好的特异性和敏感性，但存在抗体制备时间长、抗体不易保存等问题；PCR检测方法具有较好的特异性及灵敏度，已广泛应用于大肠杆菌的检测，但该方法需要昂贵的仪器及专业的操作人员，不适用于现场检测。因而进一步研究一种灵敏度高、易于操作、选择性高的新方法显得尤为重要。

与此同时，为了提高检测性能，各种信号放大技术，如杂交链式反应、滚环扩增反应、纳米材料、聚合反应等被应用于生物传感领域。其中，原子转移自由基聚合反应(ATRP)具有反应进程可控、反应单体广泛等优点，自90年代被提出以来在材料、合成等领域得到了大量应用，其在生物传感中的应用也得到科研工作者的青睐。

发明内容

针对现存技术不足，本发明目的是提供一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的大肠杆菌电化学检测方法，具有高特异性、高灵敏度等特点。

为了实现上述目的，本发明的技术方案：

一种基于细菌介导叠氮炔环加成和原子转移自由基聚合的大肠杆菌电化学检测方法，包括以下步骤：

(1)dsDNA的合成

将2μM ssDNAA和2μM ssDNA B在95℃加热10min，然后缓慢冷却至室温；

(2)大肠杆菌的培养

大肠杆菌在LB培养基中生长过夜，通过离心在指数生长期收获，弃去上清，然后将细菌颗粒重悬于PBS中，通过测量600nm处的光密度(OD)，可以对细菌浓度进行监测。在进行细菌比色检测实验前，将菌种原液的OD₆₀₀值调整为0.1；

(3)金电极的预处理

用800目、1000目、2000目及5000目砂纸打磨金电极各3-5min；然后用0.3μm和0.05μm的氧化铝悬浮液分别抛光裸露的金电极，再依次用99.99％的乙醇和超净水进行超声清洗；再将所处理过的金电极浸泡在新制备的溶液30％的H₂O₂和98％的H₂SO₄＝1∶3 V∶V中10min；之后将电极放在0.5M H₂SO₄中用循环伏安法在-0.2-1.5V的电位范围内以0.1Vs^-1的扫速进行电化学处理，直至获得稳定的循环伏安图；最后用超净水冲洗电极表面，并用氮气吹干；

(4)金电极的修饰

将10μL 1μM于上述(2)中形成的dsDNA滴加到干净的金电极上并在37℃下孵育1.5h；然后金电极用TE缓冲溶液冲洗两次；随后将金电极浸泡在2mM溶解于70％酒精的MCH溶液0.5h；再用TE缓冲液冲洗电极；

(5)点击反应

将修饰后的金电极浸泡在含50μL 4mM PBIB、5μL 2mM CuSO₄和1mL OD₆₀₀＝0.1大肠杆菌菌液的点击反应溶液中并在37℃下避光孵育40min；

(6)eATRP反应

将进行上述(5)后所得的金电极用TE溶液冲洗十秒；随后放入含有50μL 10mMFMMA、50μL 10mM Cu²⁺/Me₆TREN、500μL 1M KBr、900μL DMF和3500μL 0.1mM KPF₆的溶液中，并在其表面施加一个恒定的负电位-0.53V反应40min；再用线性伏安扫描法LSV扫描以去除沉积在电极表面的铜，其设置为：初始电位0V；最终电位0.2V；扫描速率1.0Vs^-1；最后用DMF和超纯水清洗电极；

(7)电化学测定

将进行上述(6)后所得的金电极放入1.0M LiClO₄溶液中并用方波伏安法SWV对电极表面从头合成的电活性聚合物进行检测，其设置为：初始电位0V，终止电位0.6V，电位增量4.0mV，脉冲幅值25mV，频率15Hz。

本方法设计并基于细菌介导CuAAC和eATRP原理对大肠杆菌进行检测，避免了目前常用信号策略中纳米材料和生物酶(易受外界环境如pH和温度影响)的使用，信号得到成倍的放大，灵敏度极大提高的同时，稳定性和重现性相对更高。建立了一种简单、灵敏的检测大肠杆菌的方法，为今后的监管提供了方便。

附图说明

图1为检测体系的构建原理示意图。

图2为不同浓度大肠杆菌的检测结果图：(A)不同浓度的大肠杆菌检测的方波伏安图(B)大肠杆菌与对应电流强度的线性关系图。

具体实施方式

实施例1.灵敏度实验

实验步骤同发明内容(1)-(7)，分别检测目标液中不同浓度的大肠杆菌(10³CFU/mL、10⁴CFU/mL、10⁵CFU/mL、10⁶CFU/mL、10⁷CFU/mL、10⁸CFU/mL、)产生的电流强度大小来研究本发明方法对于大肠杆菌的检测性能。如图2所示，电流强度随着大肠杆菌浓度的增加而增加，这是因为大肠杆菌的浓度越大，Cu²⁺被还原为Cu⁺的数目越多，进行CuAAC且引入的引发剂PBIB越多，进而导致FMMA电化学聚合物单体越多，产生的电流强度越来越强。电流最大峰强度与大肠杆菌浓度在10³CFU/mL到10⁸CFU/mL范围内呈现良好的线性关系，线性方程为I＝-0.3674+0.5941logC(R²＝0.9974)，最低检测限为90.89CFU/μL。结果表明本发明方法具有较高的检测灵敏度、较低的检测限、优异的性能。