抗人癌胚抗原抗体及其编码基因和应用
阅读说明：本技术 抗人癌胚抗原抗体及其编码基因和应用 (Anti-human carcinoembryonic antigen antibody and coding gene and application thereof ) 是由 侯伟 徐闻璟 龚士杰 于 2020-11-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种抗人癌胚抗原抗体及其编码基因和应用,该抗人癌胚抗原抗体包括重链可变区和轻链可变区,所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GDSISGD、HHSGS、AARAAMDRSFDF；其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为TGSGSNIGAGYDVH、LNNNRPS、QSYDKSLRGGL。该抗体为全人源抗人癌胚抗原抗体,与人癌胚抗原具有高亲和力,能用于检测和治疗人体癌症疾病。(The invention discloses an anti-human carcino-embryonic antigen antibody, a coding gene and an application thereof, the anti-human carcino-embryonic antigen antibody comprises a heavy chain variable region and a light chain variable region, and the amino acid sequences of three hypervariable regions of the heavy chain variable region, namely CDRH1, CDRH 2and CDRH3, are respectively as follows: GDSISGD 、 HHSGS 、 AARAAMDRSFDF (ii) a The amino acid sequences of three hypervariable regions of a light chain variable region of the light chain variable region are respectively CDRL1, CDRL 2and CDRL3 TGSGSNIGAGYDVH 、 LNNNRPS 、 QSYDKSLRGGL . The antibody is a fully human anti-human carcinoembryonic antigen antibody, has high affinity with human carcinoembryonic antigen, and can be used for detecting and treating human cancer diseases.)
技术领域
本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及一种抗人癌胚抗原抗体及其编码基因和应用。
背景技术
肿瘤标志物(Tumor Marker)是反映肿瘤存在的化学类物质。它们或不存在于正常成人组织而仅见于胚胎组织，或在肿瘤组织中的含量大大超过在正常组织里的含量，它们的存在或量变可以提示肿瘤的性质，借以了解肿瘤的组织发生、细胞分化、细胞功能，以帮助肿瘤的诊断、分类、预后判断以及治疗指导。
在与恶性肿瘤的斗争中，医生、患者和家属往往最关心的是如何尽早发现肿瘤的产生、发展、转移。X线诊断机、CT机、MRI机等诊断仪器和技术的发展，使得目前已能够发现直径＞5mm的肿瘤，对早期检出肿瘤和评价治疗效果、帮助医生修改治疗方案提供了有力的支持。但是，仍然有一部分肿瘤的“残渣余孽”因为其体积太小或位于体内特殊位置而难以被识别出来，这些“漏网之鱼”在暗处悄悄长大，导致肿瘤复发、转移，最终夺去了不少患者的生命。那么，有没有其他办法帮助识别出这些潜在的威胁呢？答案就是一类重要指标，即目前在临床诊治中广泛应用的“肿瘤标记物”。它们是一类能通过化验血液、尿液或肿瘤组织查出、并反映体内肿瘤情况的物质，与以上所述的影像学形态检查方法相比，可称之为“无形表象”，是对形态诊断的有力补充。
广义来说，肿瘤标记物是某些肿瘤细胞上存在或分泌、排出到体液中的物质，可大致分为肿瘤细胞分泌物和肿瘤细胞表达物两类。前者是肿瘤细胞在发生、发展中产生的物质，肿瘤生长越旺盛、其量越多，反之，肿瘤生长被压制、其产生量也减少。这些物质往往是糖蛋白，可以通过检验血等体液查出并进行监测。目前常用的有肺癌肿瘤标记物群(CEA、Cyfra21-1、NSE等)、消化道肿瘤标记物群(CEA、CA199、CA242、CA724等)、CA153(乳腺癌等)、CA125(卵巢癌等)、AFP(肝癌等)、PSA(前列腺癌等)、HCG(绒癌等)[Tannous BA,Teng J(2011)“Secreted blood reporters:Insights and applications”Biotechnol Adv.29(6):997-1003；Khunger M,Kumar U,Roy HK,Tiwari AK.(2014)“Dysplasia and cancerscreening in 21st century.”APMIS 122(8):674-682；Grunnet M,Mau-M.(2014)“Serum tumor markers in bile duct cancer—a review.”Biomarkers 19(6):437-443；Napier KJ,Scheerer M,Misra S.(2014)“Esophageal cancer:A Review ofepidemiology,pathogenesis,staging workup and treatment modalities.”World JGastrointest Oncol 6(5):112-120.]。它们往往在肿瘤很小时即可被检测出来，有助于早期发现病灶；则提示疗效可能不佳；如手术切除肿瘤一段时间后标记物进行性升高，则往往提示体内可能已经有肿瘤细胞增殖、生长，如在治疗后明显降低，则提示治疗有效，反之，需严密监视。
因此，有经验的肿瘤科医生往往会在对患者做影像检查、评估瘤体大小的同时抽血检查、动态观察相应标记物，以了解肿瘤生长是否仍然活跃、治疗后其活性是否被抑制等。它们的特点是反映灵敏、往往能早于CT、MRI等手段早期判断肿瘤生长状态，提醒医生是否需要更换治疗方案；弱点是准确性较低、不如影像学诊断可靠，所以，往往需要共同检验几个标记物、动态观察其变化、并结合其他临床表征做出判断。肿瘤标志物检测临床上常用于：(1)早期预警肿瘤发生、发展；(2)动态监测以反映治疗效果；(3)在无法取得肿瘤标本、明确病理诊断时对肿瘤性质做出某些提示、为试验性治疗提供参考依据。
人癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)是一种酸性糖蛋白，可广泛存在于内胚叶起源的消化系统癌，也存在于正常胚胎的消化管组织中，最初发现于结肠癌和胎儿肠组织中，故名癌胚抗原。癌胚抗原是在胚胎时胃肠道、肝、胰腺合成的一种蛋白质。在成年人胃肠道中也有少量合成，但不进入血液系统而是通过胃肠道排出，因此，在正常成年人血清中只有微量的癌胚抗原。
癌胚抗原是一个广谱性肿瘤标志物，它能向人们反映出多种肿瘤的存在，CEA升高常见于大肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢、甲状腺髓样癌和泌尿系统的肿瘤[Grunnet M,Sorensen JB.(2012)“Carcinoembryonic antigen(CEA)as tumormarker in lung cancer.”Lung Cancer76(2):138-43；Nagai Y,Beppu T,Sakamoto Y,etal.(2014)“Carcinoembryonic Antigen Half-life Is an Early Predictor ofTherapeutic Effects in Induction Chemotherapy for Liver Metastases fromColorectal Cancer.”Anticancer Res.34(10):5529-35；Chao YJ,Sy ED,Hsu HP,ShanYS.(2014)“Predictors for resectability and survival in locally advancedpancreatic cancer after gemcitabine-based neoadjuvant therapy.”BMC Surg.14:72.]。此外，对大肠癌、乳腺癌和肺癌的疗效判断、病情发展、监测和预估计，CEA也是一个较好的肿瘤标志物。
癌旁正常粘膜CEA含量很少或为阴性。以胃癌为例，胃癌的CEA阳性率为85.58％；而其中胃粘液腺癌及印戒细胞癌(又称粘液细胞癌)的CEA阳性率为100％[Chung JK,LeeMC,Chung HK,Lim SM,Jang JJ,Koh CS(1995)“Concentration and distribution oftumor associated antigens TAG-72and CEA in stomach cancer.”Ann Nucl Med.9(1):7-13.]。癌细胞质内CEA含量较多的原因与癌细胞CEA合成增加及CEA排出受阻有关。当癌细胞变性坏死时，细胞内膜结构受损破裂，CEA可出现在胞质的基质内。粘液细胞癌CEA分布在整个细胞膜和胞浆的膜结构中，CEA抗原决定基为糖蛋白，而肿瘤细胞的浸润和转移均与细胞膜糖蛋白的糖基化改变也有关。另外粘液细胞癌还能分泌释放大量蛋白水解酶，破坏癌细胞钙桥，溶解癌巢周围软组织。因此胃粘液细胞癌侵袭力强，转移率高。
此前，基于CEA的影像学诊断尚未报道和应用。因此，获得能检测CEA蛋白的抗体对于多种肿瘤的检测、影像学诊断和治疗显得非常有意义。公开号为CN104628859的中国发明专利申请文献中，公开了一种抗人癌胚抗原抗体，并进行了利用该抗体对肿瘤进行影像检测的初步研究。
发明内容
本发明提供了一种抗人癌胚抗原抗体，相对于现有的抗人癌胚抗原抗体，与人CEA蛋白的亲和力系数Kd具有显著性提高，同时对肿瘤细胞有显著的抑制作用，可用于抗肿瘤药物的制备。
一种抗人癌胚抗原抗体(简称抗人CEA蛋白抗体)，包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3的氨基酸序列分别为：GDSISGD(SEQ IDNo.5)、HHSGS(SEQ ID No.6)、AARAAMDRSFDF(SEQ ID No.7)；其轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3的氨基酸序列分别为TGSGSNIGAGYDVH(SEQ ID No.8)、LNNNRPS(SEQ IDNo.9)、QSYDKSLRGGL(SEQ ID No.10)。
其中，重链可变区的三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3分别位于重链可变区的第26～32位、第52～56位和第98～114位；轻链可变区的三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3分别位于轻链可变区的第24～34位、第50～56位和第89～96位。
在抗体分子可变区上，三个高变区的氨基酸序列存在很大的变异性，而高变区之间的区域氨基酸序列则变化较小。这三个高变区在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，因此又被称为互补决定区(CDR)，不同重链轻链的CDR决定了抗体对抗原的特异性。
优选地，所述重链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.1所示，所述轻链可变区的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
所述的抗人癌胚抗原抗体可以是全抗体或全抗体的抗原结合部分。所述的全抗体优选为IgG1型；所述的抗原结合部分优选为Fab片段、Fab’片段、F(ab’)2片段或单链抗体，更优选为单链抗体。
抗原结合部分既保留了能与抗原特异结合的区域，又避免了Fc片段的抗原性而引起的副作用；其中单链抗体具有易渗透肿瘤组织中增加药物浓度，免疫原性小，在体内循环的半衰期短、易于清除，易于与毒素或酶基因连接从而直接获得免疫毒素或酶标抗体等优点。
抗原结合部分可以通过DNA重组技术或通过酶促/化学裂解全抗体来制备。本发明
具体实施方式
中以抗人癌胚抗原(CEA)单链抗体为例，其制备方法为：采用公开号为CN1444651 A的中国专利文献公开的方法构建人单链抗体文库，并在该人单链抗体文库中筛选抗人CEA蛋白抗体。
本发明还提供了所述的抗人癌胚抗原抗体的编码基因，包括重链可变区编码基因和轻链可变区编码基因；具体地，重链可变区编码基因的核苷酸序列如SEQ ID No.3所示，轻链可变区编码基因如SEQ ID No.4所示。
本发明还提供了一种包含所述的编码基因的重组载体或表达系统。所述重组载体的原始载体为pACT2或pET27b。
本发明还提供一种包含所述表达系统的宿主细胞。
本发明还提供了所述的抗人癌胚抗原抗体在制备肿瘤体外诊断试剂或肿瘤影像诊断试剂中的应用。本发明抗人癌胚抗原抗体能够特异性地结合人癌胚抗原，可用于肿瘤病人血清样本CEA肿瘤标志物的检测；也可将抗人癌胚抗原抗体注入人体内通过影像诊断对肿瘤进行影像检测。
本发明还提供了如所述的抗人癌胚抗原抗体在制备抑制或治疗肿瘤的药物中的应用。进一步地，所述的抗人癌胚抗原抗体为IgG1型全抗体，其可变区序列与单链抗体hCEA-1的可变区序列相同。经抗CEA-1全长抗体IgG-CEA-1处理40天以后，肿瘤大小仅为对照组的约50％。
其中，在上述三种应用中，所述人癌胚抗原是一种广谱性的肿瘤标志物，可用于多种肿瘤疾病的检测和预防，例如：大肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢、甲状腺髓样癌和泌尿系统的肿瘤等。
本发明还提供一种药物组合物，包括药物有效量的所述的抗人癌胚抗原抗体。所述的抗人癌胚抗原抗体与药用载体混配。药用载体包括生理上相容的任何所有溶剂、分散介质、包衣、抗细菌剂和抗真菌剂、等渗和吸收延迟剂等。优选地，载体适于静脉内、肌内、皮下、肠胃外、脊髓或表皮实用(例如，通过注射或者输注)。
本申请的药物组合物中活性成分的实际剂量水平可以改变以便得到一定量的活性成分，其对于患者，组合物和施用方式有效实现所希望的治疗应答而对患者没有毒性。所选的剂量水平依赖于多种因素，包括具体的组合物或者其酯、盐或者酰胺的活性、施用途径、施用时间、排泄速率、治疗持续时间、与药物组合物组合使用的其他药物、化合物或/和物质、所治疗的患者的年龄、性别、体重、病症、一般健康和以前的医疗史，和医学领域公知的类似因素。
一些实施方式中，药物组合物需是无菌和流体以至于可以通过注射器递送的程度，除了水，自艾特可以是等渗的缓冲盐水溶液、乙醇、多元醇等或合适的混合物。
一些实施方式中，通过使用包衣如卵磷脂，对于分散体的情况通过保持所需的颗粒大小和通过使用表面活性剂，可以保持合适的流动性。在许多情况中，在组合物中优选包括等渗剂，如糖、多元醇(甘露醇或山梨醇)和氯化钠等。通过在组合物中包括延迟吸收的试剂，如单硬脂酸铝或者明胶可引起注射组合物的长期吸收。
该药物组合物用于治疗或抑制大肠癌、胰腺癌、胃癌、肺癌、肝癌、胆管癌、乳腺癌、卵巢、甲状腺髓样癌和泌尿系统的肿瘤等。
与现有技术相比，本发明至少具有如下有益效果之一：
(1)本发明抗人癌胚抗原抗体是一种既能用于检测多种肿瘤、也能治疗和预防人体疾病的全人源抗人癌胚抗原抗体，具有非常高的亲和力，能够特异性结合人癌胚抗原，有效检测多种肿瘤，对治疗相关肿瘤具有重要作用。
(2)本发明抗人癌胚抗原抗体与人CEA蛋白的亲和力系数Kd相对于现有的抗人癌胚抗原抗体具有显著提高(提高了44％)。
(3)本发明抗人癌胚抗原抗体对肿瘤细胞的抑制效果也具有显著性提高，相同条件下，经抗CEA-1全长抗体IgG-CEA-1处理40天以后，肿瘤大小仅为对照组的约50％。
附图说明
图1为实施例1中抗人CEA蛋白单链抗体的结构示意图；
图2为实施例2中抗人CEA蛋白单链抗体#HCEA-1的特异性ELISA分析；
图3为实施例3中抗人CEA蛋白单链抗体#HCEA-1ELISA法检测多种肿瘤病人血清的结果。
图4为实施例4中抗CEA-1全长抗体(IgG-CEA-1)或非特异的人IgG蛋白或磷酸缓冲液PBS以皮下注射方式注射入SCID鼠体内处理后肿瘤大小与时间变化的关系结果图。
具体实施方式
以下结合具体的实施例进行详细说明。
实施例1抗人CEA蛋白单链抗体的筛选
本实施例构建单链抗体库，并针对此单链抗体库进行抗人CEA蛋白单链抗体的筛选。
采用公开号为CN 1444651 A的中国专利文献公开的方法构建人单链抗体文库，并在该人单链抗体文库中筛选抗人CEA蛋白单链抗体，具体实施过程如下：
1、扩增得到人抗体重链和轻链可变区DNA
以来自人骨髓、人胎肝、人脾和人外周血白细胞的poly A+RNA(购自Clontech)为模板，利用oligo(dT)和随机引物(random primers)，使用逆向转录酶试剂盒(购自Clontech)，根据Clontech试剂盒所提供的方法指南，将poly A+RNA逆向转录成cDNA。
以上述cDNA为模板，利用一系列识别人抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因的引物，进行PCR扩增得到人抗体中所有的重链可变区和轻链可变区的DNA序列。一系列识别人抗体重链和轻链可变区基因的引物序列如下：
第一组为扩增人抗体重链可变区(VH)基因的5’-端引物(SEQ ID No.11～17)，包括：
VH1b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGCAGGAGTC(C/G)G-3’；
VH2b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTACAGCTGCAGCAGTCA-3’；
VH3b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTACAGCAGTGG G-3’；
VH4b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACGAGGTGCAGCTG(G/T)TGGAG(A/T)C
(C/T)-3’；
VH5b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTCCAGCT(G/T)GT(A/G)CAGTCTG
G-3’；
VH6b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAG(A/G)TCACCTTGAAGGAGTCTG-3’；
VH7b：5’-CCATACGATGTTCCAGATTACCAGGTGCAGCTGGTG(C/G)A(A/G)TCTG
G-3’；
第二组为扩增人抗体重链可变区(VH)基因的3’-端引物(SEQ ID No.18～23)，包括：
VH1f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGAC(A/G)GTGACCAGGGTG-3’；
VH2f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCAGGGTT-3’；
VH3f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAAGAGACGGTGACCATTGT-3’；
VH4f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCTGAGGAGACGGTGACCGTGGTCC-3’；
VH5f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCCGGTTGGGGCGGATGCACTCC-3’；
VH6f：5’-GCCGCCTGATCCACCACCGCC(C/G)GATGGGCCCTTGGTGGA(A/G)GC-3’；
第三组为扩增人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的5’-端引物(SEQ ID No.24～32)，包括：
VL1b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTGT(C/G)(C/G/T)TGACGCAGCCGCC-3’；
VL2b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATG(A/T)GCTGAC(A/T)CAGCCAC-3’；
VL3b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTATGAGCTGA(C/T)(A/G)CAGC(C/T)ACC-3’；
VL4b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCCTGTGCTGACTCA(A/G)(C/T)C-3’；
VL5b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAG(A/G/T)CTGTGGTGAC(C/T)CAGGAGCC-3’；
VL6b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGCC(A/T)G(G/T)GCTGACTCAGCC(A/C)CC-3’；
VL7b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTTCCTCTGAGCTGA(C/G)TCAGGA(C/G)CC-3’；
VL8b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTCAGTCTG(C/T)(C/T)CTGA(C/T)TCAGCCT-3’；
VL9b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTAATTTTATGCTGACTCAGCCCC-3’；
第四组为扩增人抗体λ-轻链可变区(Vλ)基因的3’-端引物(SEQ ID No.33～34)，包括：
VL1f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATAGGACGGT(C/G)A(C/G)CTTGGTCC-3’；
VL2f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGAGAGGACGGTCAGCTGGGTGC-3’；
第五组为扩增人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的5’-端引物(SEQ ID No.35～38)，包括：
VK1b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGACATCC(A/G)G(A/G/T)TGACCCAGTCTCC-3’；
VK2b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAATTGT(A/G)(A/T)TGAC(A/G)CAGTCTCC-3’；
VK3b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGATATTGTG(A/C)TGAC(C/G/T)CAG(A/T)CTCC-3’；
VK4b：5’-GGCAGCGGTGGTGGAGGCAGTGAAACGACACTCACGCAGTCTC-3’；
第六组为扩增人抗体k-轻链可变区(Vk)基因的3’-端引物(SEQ ID No.39～42)，包括：
VK1f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATTTCCACCTTGGTCC-3’；
VK2f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATCTCCA(C/G)CTTGGTCC-3’；
VK3f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTGATATCCACTTTGGTCC-3’；
VK4f：5’-GGGGTTTTTCAGTATCTACGATTTAATCTCCAGTCGTGTCC-3’。
扩增人抗体中的重链可变区(VH)时，利用第一组引物与第二组引物的组合，即有42个PCR反应；扩增人抗体中的λ-轻链可变区(Vλ)时，利用第三组引物与第四组引物的组合，即有18个PCR反应；扩增人抗体中的k轻链可变区(Vk)时，利用第五组引物与第六组引物的组合，即有16个PCR反应。
第一组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2(Hua SB,Luo Y,Qiu M,Chan E,ZhouH,Zhu L.(1998)Gene.215:143-152.)(Hua SB,Qiu M,Chan E,Zhu L,Luo Y.(1997)Plasmid.38:91-96.)多克隆位点的上游同源序列(下划线部分)；第四组和第六组引物中包含有酵母双杂交载体pACT2多克隆位点的下游同源序列(下划线部分)；而第二组、第三组和第五组引物中包含有连接肽序列(下划线部分)，连接肽用于连接抗体的重链可变区和轻链可变区。
扩增时，PCR反应体系与反应条件均相同，PCR反应体系为：
将上述各组分混合均匀后置于PCR仪中进行反应。反应条件为：94℃解链1分钟，50℃退火1分钟，72℃延伸2.5分钟，循环30次。
2、连接载体多克隆位点的同源序列和连接肽序列
(1)以步骤1中PCR所得的人抗体重链可变区DNA为模板，分别以引物7和引物8为上游引物和下游引物，序列为：
上游引物(引物7，SEQ ID No.43，下划线部分为载体pACT2多克隆位点的上游同源序列)：
5’-ACCCCACCAAACCCAAAAAAAGAGATCTGTATGGCTTACCCATACGATGTTCCAGATTAC-3’；
下游引物(引物8，SEQ ID No.44，下划线部分为连接肽反链序列)：
5’-ACTGCCTCCACCACCGCTGCCACCTCCGCCAGATCCTCCGCCGCCTGATCCACCACCGCC-3’；
进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。反应完成后获得含5’-载体pACT2多克隆位点的上游同源序列和3’-连接肽反链序列的人抗体重链可变区DNA序列。
(2)以步骤1中PCR所得的人抗体轻链可变区DNA为模板，以引物9和引物10分别为下游引物和上游引物，序列如下：
上游引物(引物10，SEQ ID No.45，下划线部分为连接肽顺链序列)：
5’-GGCGGTGGTGGATCAGGCGGCGGAGGATCTGGCGGAGGTGGCAGCGGTGGTGGAGGCAGT-3’；
下游引物(引物9，SEQ ID No.46，下划线部分为载体pACT2多克隆位点的下游同源序列)：
5’-GAGATGGTGCACGATGCACAGTTGAAGTGAACTTGCGGGGTTTTTCAGTATCTACGA-3’；
进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。反应完成后获得含3’-载体pACT2多克隆位点的下游同源序列和5’-连接肽顺链序列的人抗体轻链可变区DNA序列。
3、连接单链抗体(scFv)DNA
将步骤2中PCR扩增得到的含载体pACT2多克隆位点的同源序列和连接肽序列的人抗体重链可变区DNA和轻链可变区DNA混合，以该混合DNA为模板，分别以引物7和引物9为上游引物和下游引物，进行PCR扩增，反应条件和体系同步骤1。
如图1所示，反应完成后得到包括人抗体重链可变区DNA序列、轻链可变区DNA序列、载体pACT2多克隆位点同源序列以及连接肽DNA序列的单链抗体(scFv)DNA。
4、构建人单链抗体基因文库
将步骤3得到的单链抗体(scFv)DNA与经限制性内切酶(Bam HI和Eco RI)处理后的酵母双杂交载体pACT2按照原Clontech公司提供的方法(Yeast Protocol Handbook,PT3024-1)共同转入酵母菌株Y187(MATα ura3-52,his3-200,ade2-101,lys2-801,trp1-901,leu2-3,112,gal4,gal80,met-,URA3::GAL1UAS-GAL1TATA-lac Z,MEL1)内，经细胞内同源重组后将单链抗体DNA整合到pACT2载体上，从而得到酵母双杂交单链抗体文库，单链抗体DNA片段与pACT2载体上的Gal4激活区域(Activation Domain，AD)融合在一起。
为检查该单链抗体基因文库的质量，从中随机挑出了21个克隆，对插入片段进行测序分析。分析结果表明，所有克隆都包括与Gal4融合在一起的单链抗体DNA片段，而且所有单链抗体DNA序列都是独特的。
经同源重组而得到的酵母双杂交单链抗体基因文库中抗体DNA拷贝数大约有1×108个，可应用于酵母双杂交技术筛选特定的抗体。
5、筛选抗体
(1)抗体筛选
使用编码人CEA蛋白的DNA作为抗原基因，对酵母双杂交单链抗体基因文库进行抗体筛选。
将编码人CEA成熟蛋白的DNA(序列见GenBank的ID号M15042，核苷酸92到2095)重组到载体pGBKT7中，构建pGBK-hCEA。pGBK-hCEA编码Gal4 DNA结合区域(Binding Domain，简称BD)及在其C端融合了人CEA蛋白。
在编码人CEA蛋白的DNA序列得到验证后，将pGBK-hCEA质粒DNA转化入酵母菌株AH109(MATa,trp1-901,leu2-3,112,ura3-52,his3-200,gal4,gal80,LYS2::GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2,URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lac Z)；带有pGBK-hCEA质粒的AH109酵母可在不含色氨酸的合成培养基(SD/-W)上生长。
将等量的含pGBK-hCEA的MATa型酵母细胞(AH109菌株)与含单链抗体基因文库的MAT型酵母细胞(Y187菌株)进行共同培养，使此二型细胞交配结合。由于载有单链抗体基因文库的pACT2载体含有Leu2基因，且pGBK-hCEA包含Trp1基因，因此，包含两种质粒的酵母细胞可以生长在不含亮氨酸和丝氨酸的酵母合成培养基(SD/-LW)。
存在单链抗体scFv与人CEA蛋白相互作用的酵母细胞会激活整合在菌株基因组中的报告基因ADE2和HIS3，从而使得酵母细胞可以生长在缺乏腺嘌呤，组氨酸，亮氨酸和色氨酸的培养基(SD/-AHLW)上，并在该平板培养基上形成菌落。
(2)特异性抗体筛选
1)半乳糖苷酶分析
由于存在scFv与人CEA蛋白相互作用的细胞也会激活整合在菌株基因组中的另一报告基因lac Z，因此检测酵母细胞内半乳糖苷酶是否表达可判断酵母细胞内scFv/CEA蛋白的存在。
在筛选培养基(SD/-AHLW)上总共挑选出67个菌落，使用半乳糖苷酶检测法检测lac Z表达。检测方法如下：
①将存在scFv/CEA蛋白相互作用的酵母接种到筛选培养基(SD/-AHLW)平板上生长；
②将酵母菌落转移到Whatman五号滤纸上；
③将带有酵母细胞菌落的滤纸浸入液氮之中，使细胞破裂；
④将滤纸从液氮中取出，并置于30℃的烘箱内；重复步骤(3)和(4)两次；
⑤将滤纸铺于适量的X-gal溶液中，并置于37℃的温箱内约15分钟；若菌落处显示蓝色，表明为半乳糖苷酶阳性，即lac Z基因被激活表达。
其中，X-gal溶液配方如下：
16.1g/L Na2HPO4·7H2O；
5.50g/L NaH2PO4·H2O；
0.75g/L KCl；
0.246g/L MgSO4·7H2O；
35mg/L X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)；
5mM-巯基乙醇；pH 7.0。
检测结果：上述挑选出的33个菌落中，有17个是半乳糖苷酶阳性，表明在这些菌落中报告基因lacZ被激活了。
2)特异结合分析
对上述17个半乳糖苷酶阳性菌落的scFv进行特异性分析，以验证单链抗体scFv是否特异性地与人CEA蛋白结合。
从上述17个半乳糖苷酶阳性的酵母中提取含有scFv的pACT2质粒DNA，再分别与pGBKT7空载体DNA、pGBK-hCEA质粒DNA、pGBK-Lam质粒DNA(编码Gal4 DNA结合区域并在其C端融合有人核纤层蛋白C)共同转化到AH109酵母细胞内；转化后的酵母细胞先铺于SD/-LW平板培养基上生长，然后转移到SD/-AHLW平板培养基上；对长出的菌落作半乳糖苷酶分析，验证为阳性的菌落视为含有非特异性的scFv，将其剔除。
经上述特异性分析后，得到一个对人CEA蛋白具有特异性的单链抗体，编号为hCEA-1，使用ABI自动测序仪对该单链抗体进行测序分析，结果显示：
hCEA-1的重链可变区的DNA序列如SEQ ID No.3所示；
hCEA-1的重链可变区氨基酸序列(SEQ ID No.1所示)为：QVQLQESGPGLVKPSETLSLTCTVSGDSISGDYWSWIRQPPGKGLEWIGEIHHSGSTNYNPSLKSRVSISLDTSKNQFSLKLSSVTAADTAVYYCAA RAAMDRSFDFWGQGTLVTVSSGSASAPT
其中，下划线部分依次为三个高变区CDRH1、CDRH2、CDRH3(SEQ ID No.5～7)；
hCEA-1的轻链可变区的DNA序列如SEQ ID No.4所示；
hCEA-1的轻链可变区氨基酸序列(SEQ ID No.2)为：QSVLTQPPSVSGAPGQRVTISCTG SGSNIGAGYDVHWYQQRPGTAPKLLIYLNNNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAIPGLQAEDEADYYCQSYDKSLRGG LFGGGTKLTVL。
其中，下划线部分依次为三个高变区CDRL1、CDRL2、CDRL3(SEQ ID No.8～10)。
实施例2特异性检测
本实施例将上述实施例筛选所得的单链抗体在细菌系统中表达、纯化，并测定其特异性。
1、单链抗体表达与纯化
将单链抗体hCEA-1的编码基因克隆到表达载体pET27b(+)中，构建得到pET27b-hCEA1；
将pET27b-hCEA1转化入表达细菌E.coli BL21(DE3)，并按照Novagen公司提供的方法用IPTG(0.5mM)诱导表达；表达出的目标蛋白中，scFv的N端是pelB序列，pelB序列可将表达后的scFv分泌到BL21(DE3)的周质腔(periplasmic space)中；scFv的C端含有一个HSV标记物和一个6×His标记物，方便目标蛋白的纯化；应用Qiagen公司所提供的方法方便地用Ni-NTA柱分离纯化得到抗人CEA蛋白的单链抗体。
2、ELISA测试单链抗体对CEA蛋白的特异性
人CEA蛋白购自上海科兴生物科技有限公司。ELISA测试方法如下：
(1)用CEA蛋白包被96-孔板，在2-8℃过夜；
(2)包被后的96-孔板再用SuperBlock作封闭处理；
(3)将单链抗体hCEA-1在0.02％BSA中作系列稀释后加入已包被有CEA蛋白的96-孔中，与CEA蛋白结合；
(4)将96-孔板清洗后，加入稀释5000倍的鼠抗HSV标记物的抗体，用来检测结合了的单链抗体；
(5)将96-孔板清洗后，加入稀释10000倍的山羊抗鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶偶联物；
(6)将96-孔板最终清洗后，应用辣根过氧化物酶底物TMB试剂作显色处理；
(7)用0.5M的硫酸终止反应，并检测450nm的吸收光谱。
检测结果如图2所示，表明单链抗体#hCEA-1能有效地结合CEA蛋白。
从检测结果分析获得hCEA-1单链抗体与人CEA蛋白的亲和力系数Kd值为0.786nM。hCEA-1单链抗体的亲和力优于hCEA-A的亲和力(1.132nM)(中国专利申请号：201510039112.2)。
实施例3抗人CEA蛋白单链抗体检测血清CEA
本实施例应用上述抗人CEA蛋白单链抗体检测肿瘤病人血清中CEA肿瘤标志物。
兔子抗人CEA的多克隆抗体(目录号sc-20131，H300)购自于美国Santa CruzBiotechnology公司。人CEA蛋白购自上海科兴生物科技有限公司。肿瘤病人血清样本和正常健康血清样本来自杭州武警医院。
ELISA测试方法如下：
(1)用兔子抗人CEA的多克隆抗体包被96-孔板，在2-8℃过夜；
(2)包被后的96-孔板再用SuperBlock作封闭处理；
(3)将血清样本(100倍稀释)或人CEA蛋白在0.02％BSA-生理盐水中作稀释后加入上述已包被有兔子抗人CEA的多克隆抗体的96-孔中，多克隆抗体结合样本中的CEA蛋白；
(4)将96-孔板清洗后，将稀释在0.02％BSA-生理盐水中的单链抗体hCEA-1(0.1μg/ml)加入到上述的96-孔中；
(5)加入稀释5000倍的鼠抗HSV标记物的抗体，用来检测结合了的单链抗体；
(6)将96-孔板清洗后，加入稀释10000倍的山羊抗鼠IgG抗体-辣根过氧化物酶偶联物；
(7)将96-孔板最终清洗后，应用辣根过氧化物酶底物TMB试剂作显色处理；
(8)用0.5M的硫酸终止反应，并检测450nm的吸收光谱(OD450nm)。
检测结果如图3所示，表明单链抗体hCEA-1能有效地结合CEA蛋白，用于肿瘤病人血清样本的CEA肿瘤标志物检测。
实施例4抗人CEA全长抗体可在肿瘤模型动物体内抑制肿瘤生长
1、制备全长重组人源抗人CEA蛋白抗体IgG-CEA-1
委托北京义翘神州生物技术有限公司制备全长重组人源抗人CEA蛋白抗体IgG-CEA-1(缓冲液为常规PBS磷酸缓冲液，浓度为1.0mg/ml)。全长的IgG-CEA-1为IgG1型，其可变区序列与单链抗体hCEA-1的可变区序列相同。
2、制备人原代外周血单核细胞PBMC
人原代外周血单核细胞PBMC细胞中多数(约60-70％)为免疫T细胞。PBMC源自健康捐献者的外周血，根据供应商提供的方法，用Ficoll Lymphocyte Separation Medium(美国Sigma-Aldrich公司，Histopaque-1077)密度梯度离心方法制备获得。上述所制备的PBMC细胞首先用抗CD3单克隆抗体(40ng/ml)(美国加州eBioscience公司，产品目录号16-0037)预培养3天。
3、制备表面带人CEA抗原的肝癌肿瘤细胞
人肝癌肿瘤细胞株Hep3B源自美国ATCC(Rockville,Maryland,USA)。编码全长人CEA蛋白的DNA(序列见GenBank的ID号M15042，核苷酸序列1到2092)，在其C端加上TGF-β受体II的跨膜(TM)肽(ISLLPPLGVAISVIIIFYCYRVNRQ(SEQ ID No.47))(序列见GenBank的ID号NM_001024847.2,核苷酸序列965到1039)及终止密码子TAA。此CEA-TM融合蛋白的DNA序列由南京金斯瑞公司合成，并克隆到pcDNA3.1/Hygromycin质粒中。
应用常规的细胞转染技术，把上述带有CEA-TM融合蛋白的质粒DNA转染入Hep3B细胞，并在包含200μg/ml Hygromycin(Sigma公司)的培养基中进行筛选14天；筛选后的Hep3B/CEA-TM细胞株通过稀释培养的方法获得细胞株(Fuller SA等，2001.CurrentProtocols of Molecular Biology.第11章，11.8节)。表达CEA-TM的细胞株再用抗CEA抗体(结合流式细胞仪FACS进行分析，挑选CEA-TM表达量高的人肝癌肿瘤细胞株Hep3B/CEA-TM。
4、制备人肝癌肿瘤Hep3B/CEA-TM小鼠模型
根据文献(Pollack VA等1999.“Inhibition of Epidermal growth factorreceptor-associated tyrosine phosphorylation in human carcinomas with CP-358:Dynamics of receptor inhibition in situ and antitumor effects in athymicmice.”J.Pharmacol.Exp.Ther.291:739-748.)中记载的方法，在SCID鼠体内诱导肿瘤。
将人肝癌肿瘤细胞株Hep3B/CEA-TM(约3x106个细胞)与50％Matrigel(美国Beckton-Dickinson公司)制剂皮下注射到6-7周雄性的SCID鼠(北京维通利华实验动物技术有限公司)体内诱导肿瘤；肿瘤细胞接种15天后，肿瘤形成到约100-200mm3大小时，在肿瘤内注射5×105个原代人外周血单核细胞PBMC(混合后的来源于三个健康捐献者的PBMC细胞)。
5、
在接种PBMC三天后，将这些SCID鼠分成三组，分别将(1)抗CEA-1全长抗体(IgG-CEA-1)、(2)非特异的人IgG蛋白(美国Sigma公司)、(3)磷酸缓冲液PBS以皮下注射方式注射入上述的SCID鼠体内。抗体用量为10mg/kg，隔10天后相同剂量再次注射，共注射三次。用游标卡尺测量肿瘤的二个直径来确定肿瘤的尺寸，并根据文献(“Protocols for screeningchemical agents and natural products against animal tumors and otherbiological systems.”Cancer Chemother.Rep.3:1-104.)记载的方法计算肿瘤的体积，肿瘤体积＝(长度×[宽度]2)/2。
图4所示的为接种PBMC三天后，分别将抗CEA-1全长抗体(IgG-CEA-1)或非特异的人IgG蛋白或磷酸缓冲液PBS以皮下注射方式注射入上述的SCID鼠体内处理后，肿瘤大小与时间变化的关系。
检测结果表明，与对照组相比，抗CEA-1全长抗体IgG-CEA-1对肿瘤细胞具有较强的肿瘤抑制效果。抗CEA-1全长抗体IgG-CEA-1处理40天以后，肿瘤大小仅为对照组的约50％。
以上所述实施例仅表达了本申请的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本申请构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本申请的保护范围。因此，本申请专利的保护范围应以所附权利要求为准。
SEQUENCE LISTING
<110> 杭州慈兴医疗器械有限公司
<120> 抗人癌胚抗原抗体及其编码基因和应用
<130>
<160> 47
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 125
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 1
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Asp Ser Ile Ser Gly Asp
20 25 30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Glu Ile His His Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
50 55 60
Ser Arg Val Ser Ile Ser Leu Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65 70 75 80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
85 90 95
Ala Arg Ala Ala Met Asp Arg Ser Phe Asp Phe Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Ala Ser Ala Pro Thr
115 120 125
<210> 2
<211> 111
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 2
Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala Pro Gly Gln
1 5 10 15
Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Gly
20 25 30
Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu
35 40 45
Leu Ile Tyr Leu Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Pro Gly Leu
65 70 75 80
Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr Asp Lys Ser
85 90 95
Leu Arg Gly Gly Leu Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu
100 105 110
<210> 3
<211> 375
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60
acctgcactg tctctggtga ctccatcagt ggtgactact ggagttggat ccggcagccc 120
ccagggaagg gactggagtg gattggggaa atccatcata gtgggagcac caactacaat 180
ccttccctca agagtcgagt cagcatatca ctagacacgt ccaagaacca gttctccctg 240
aagctgagct ctgtgaccgc tgcggacacg gccgtgtatt actgtgcggc tcgtgcagct 300
atggaccgct cttttgactt ctggggccag ggaaccctgg tcaccgtctc ctcagggagt 360
gcatccgccc caact 375
<210> 4
<211> 333
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 4
cagtctgtgt tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60
tcctgcactg ggagcggctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcag 120
cgtccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatcttaaca acaatcggcc ctcaggggtc 180
cctgatcgat tctctgggtc caagtctggc acctcagcct ccctggccat ccctggactc 240
caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acaagagcct gaggggagga 300
ctattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc cta 333
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 5
Gly Asp Ser Ile Ser Gly Asp
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<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 6
His His Ser Gly Ser
1 5
<210> 7
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 7
Ala Ala Arg Ala Ala Met Asp Arg Ser Phe Asp
1 5 10
<210> 8
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 8
Thr Gly Ser Gly Ser Asn Ile Gly Ala Gly Tyr Asp Val His
1 5 10
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<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 9
Leu Asn Asn Asn Arg Pro Ser
1 5
<210> 10
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 10
Gln Ser Tyr Asp Lys Ser Leu Arg Gly Gly Leu
1 5 10
<210> 11
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccatacgatg ttccagatta ccaggtgcag ctgcaggagt csg 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ccatacgatg ttccagatta ccaggtacag ctgcagcagt ca 42
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
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<210> 14
<211> 42
<212> DNA
<213> 人工序列
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ccatacgatg ttccagatta cgaggtgcag ctgktggagw cy 42
<210> 15
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 15
ccatacgatg ttccagatta ccaggtccag ctkgtrcagt ctgg 44
<210> 16
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 16
ccatacgatg ttccagatta ccagrtcacc ttgaaggagt ctg 43
<210> 17
<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 17
ccatacgatg ttccagatta ccaggtgcag ctggtgsart ctgg 44
<210> 18
<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
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gccgcctgat ccaccaccgc ctgaggagac rgtgaccagg gtg 43
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
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gccgcctgat ccaccaccgc ctgaggagac ggtgaccagg gtt 43
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<212> DNA
<213> 人工序列
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gccgcctgat ccaccaccgc ctgaggagac ggtgaccgtg gtcc 44
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gccgcctgat ccaccaccgc cggttggggc ggatgcactc c 41
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<211> 42
<212> DNA
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<400> 23
gccgcctgat ccaccaccgc csgatgggcc cttggtggar gc 42
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 24
ggcagcggtg gtggaggcag tcagtctgts btgacgcagc cgcc 44
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<211> 43
<212> DNA
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ggcagcggtg gtggaggcag ttcctatgwg ctgacwcagc cac 43
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<212> DNA
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ggcagcggtg gtggaggcag ttcctatgag ctgayagcag cyacc 45
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ggcagcggtg gtggaggcag tcagcctgtg ctgactcary c 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggcagcggtg gtggaggcag tcagdctgtg gtgacycagg agcc 44
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<211> 44
<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggcagcggtg gtggaggcag tcagtctgyy ctgaytcagc ct 42
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<211> 43
<212> DNA
<213> 人工序列
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ggcagcggtg gtggaggcag taattttatg ctgactcagc ccc 43
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<211> 41
<212> DNA
<213> 人工序列
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ggggtttttc agtatctacg ataggacggt sascttggtc c 41
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<212> DNA
<213> 人工序列
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ggggtttttc agtatctacg agaggacggt cagctgggtg c 41
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ggcagcggtg gtggaggcag tgacatccrg dtgacccagt ctcc 44
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ggcagcggtg gtggaggcag tgaaattgtr wtgacrcagt ctcc 44
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<212> DNA
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<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
<213> 人工序列
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<212> DNA
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<212> PRT
<213> 人工序列
<400> 47
Ile Ser Leu Leu Pro Pro Leu Gly Val Ala Ile Ser Val Ile Ile Ile
1 5 10 15
Phe Tyr Cys Tyr Arg Val Asn Arg Gln
20 25