阅读说明：本技术 一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂及制备方法 (Reagent for targeting bone marrow mesenchymal stem cells to myocardial infarction focus and preparation method ) 是由 孙铃 王庆捷 纪元 于 2020-11-18 设计创作，主要内容包括：本发明提供一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂,所述使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基,由溶质和溶媒组成,所述溶质包括100％血浆、低分子量肝素钠400-700U/mL、磷酸氢二钾溶液40-70mmol/L、腺苷0.4-10μmol/L、人参皂苷Rb1为0.5-10mg/mL、葡萄糖4.5g/L-5.5g/L、碳酸钠0.15g/L-0.25g/L、L-谷氨酰胺0.590g/L-0.710g/L、转铁蛋白50g/L-65g/L、胰岛素5g/L-7g/L、碱性成纤维细胞生长因子0.01g/L-0.05g/L,所述溶媒为复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水,可使通过静脉注射的骨髓间充质干细胞靶向于z心肌梗死灶,解决了目前通过冠状动脉内注射所留下的细胞量较少的问题。(The invention provides a reagent for targeting mesenchymal stem cells to a myocardial infarction focus, which consists of a solute and a solvent, wherein the solute comprises 100 percent of plasma, 400U/mL of low molecular weight heparin sodium, 40-70mmol/L of dipotassium hydrogen phosphate solution, 0.4-10 mu mol/L of adenosine, 0.5-10mg/mL of ginsenoside Rb1, 4.5-5.5 g/L of glucose, 0.15g/L-0.25g/L, L-glutamine, 0.590g/L-0.710g/L of sodium carbonate, 50g/L-65g/L of transferrin, 5g/L-7g/L of insulin, 0.01g/L-0.05g/L of basic fibroblast growth factor, the solvent is compound electrolyte injection, glucose injection or normal saline, can target the mesenchymal stem cells injected by vein to the z myocardial infarction focus, and solves the problem that the amount of the cells left by the current intracoronary injection is less.)

一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂及制备 方法

技术领域

本发明是一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂及制备方法，属于干细胞技术领域。

背景技术

骨髓间充质干细胞是骨髓内除造血干细胞之外的另一类干细胞，是骨髓造血微环境的重要组成部分，在体内外均具有支持和调控造血的作用。因其比较容易贴壁和形成纤维样的克隆，因此也称成纤维细胞集落形成单位。在一定的诱导条件下，BMSCs具有向成骨细胞、脂肪细胞，骨骼肌、软骨细胞平滑肌、肌腱细胞，造血支持基质等中胚层细胞分化的能力；同时可以向外胚层的星形胶质细胞、神经元、血管内皮细胞和心肌细胞分化。BMSCs跨系、甚至跨胚层横向分化的可塑性及其强大的分化潜能使得它可为组织修复提供可能性。由于BMSCs具有多向分化潜能和高增殖特性，取材容易，对机体损伤小，易于基因操作，组织相容性好，不论自体移植或异体移植免疫排斥反应弱等优点，还能分泌多种生长因子，如IL-6，IL-11，LIF，M-CSF及SCF等，被认为是组织工程和基因工程理想的靶细胞，在临床都有着广阔的应用前景。

基于骨髓间充质干细胞的上述特性，如何利用其达到针对性的修复和改善受损皮肤，并从根本上延缓和阻止皮肤细胞的衰老的目的，目前所记载的研究大部分都将干细胞注射到冠状动脉内和肌肉内。使用冠状动脉内注射干细胞治疗急性心肌梗塞对于恢复心脏功能和心脏变形能达到相关的临床效果，使用细胞治疗的病人其目标血管重建的需求并没有增加，研究发现治疗是安全的，虽然乍一看，冠状动脉内注射是细胞应用的一种方式，但放射标记骨髓细胞显示：与肌肉内注射相比，冠状动脉内注射所留下的细胞量较少，但肌肉内注射只能对局部区域起作用现在急需一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂及制备方法来解决上述出现的问题。

发明内容

针对现有技术存在的不足，本发明目的是提供一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂及制备方法，以解决上述背景技术中提出的问题，本发明有效修复皮肤组织的效果，多向分化潜能和高增殖特性。

为了实现上述目的，本发明是通过如下的技术方案来实现：一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂，由使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基和离体的骨髓间充质干细胞组成，所述使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基，由溶质和溶媒组成；

进一步地，所述溶质包括100％血浆、低分子量肝素钠400-700U/mL、磷酸氢二钾溶液40-70mmol/L、腺苷0.4-10μmol/L、人参皂苷Rb1为0.5-10mg/mL、葡萄糖4.5g/L-5.5g/L、碳酸钠0.15g/L-0.25g/L、L-谷氨酰胺0.590g/L-0.710g/L、转铁蛋白50g/L-65g/L、胰岛素5g/L-7g/L、碱性成纤维细胞生长因子0.01g/L-0.05g/L，所述溶媒为复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水。

进一步地，所述培养基和所述离体的骨髓间充质干细胞的配比为每毫升培养基1.0×106-4×106个所述离体的骨髓间充质干细胞。

进一步地，所述离体的人骨髓间充质干细胞为离体的人同种异体骨髓间充质干细胞。

进一步地，一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：配制完全培养液，所述完全培养液为L-DMEM和质量浓度20％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素；

步骤(2)：取骨髓，置于无菌肝素管中，每毫升骨髓加100U肝素抗凝，充分混匀后，用PBS液调整骨髓细胞浓度至10⁶-10⁷/ml，以体积比1:1加入Ficoll分离液和骨髓细胞悬液，不破坏界面，水平离心机20℃条件下500g离心25-30分钟，自然沉降，从界面上取出单个核细胞，用PBS液洗涤2-3次；

步骤(3)：将步骤(2)得到的细胞加步骤(1)配制的完全培养液进行细胞计数，达到10⁶-10⁷/ml后原代培养，按(1-5)×10⁶cells/ml接种到T25或T75细胞培养瓶，每个细胞培养瓶中完全培养液体积为5-25ml，置于CO₂体积比浓度5％的37℃培养箱中培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每3-5d半量换液1次，细胞达80％融合时，用质量浓度0.25％胰酶于37℃下消化，以1×104cells/ml传代扩增，取P2-P5代的骨髓充质干细胞；

步骤(4)：将步骤(3)得到的P2-P5代的骨髓充质干细胞置于O₂体积比浓度为21％的37℃培养箱中，用步骤(1)配制的完全培养液进行培养，直到细胞达60-70％融合时，改用无血清的饥饿培养液，培养12-15h，将无血清的饥饿培养液换为含有10ng/ml表皮细胞生长因子的步骤(1)配制的完全培养液，培养至细胞处于对数生长期；

步骤(5)：将步骤(4)得到的骨髓充质干细胞、血浆、低分子量肝素钠、磷酸氢二钾溶液、腺苷、人参皂苷Rb1、葡萄糖、碳酸钠、L-谷氨酰胺、转铁蛋白、胰岛素、碱性成纤维细胞生长因子和溶媒混匀，得到骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂。

本发明的具有以下有益效果：

(1)本发明取繁殖能力强的P2-P5代骨髓间充质干细胞，采用无血清培养使细胞处于饥饿状态，再加入表皮细胞生长因子诱导，培养至细胞处于对数生长期，所得的骨髓间充质干细胞分化能力和增殖力好，特定的诱导条件下有更好的分化潜能，

(2)本发明的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂，可使通过静脉注射的骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶，解决了目前通过冠状动脉内注射所留下的细胞量较少的问题，用本发明的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基制备的使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂可使心肌梗死的部位获得足够的干细胞进而分化成新生的心肌细胞，本发明有效修复皮肤组织的效果，多向分化潜能和高增殖特性。

具体实施方式

为使本发明实现的技术手段、创作特征、达成目的与功效易于明白了解，下面结合具体实施方式，进一步阐述本发明。

作为本发明的一个实施例：一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂，由使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基和离体的骨髓间充质干细胞组成，所述使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基，由溶质和溶媒组成；

本实施例中：溶质包括100％血浆、低分子量肝素钠400/mL、磷酸氢二钾溶液40mmol/L、腺苷0.4μmol/L、人参皂苷Rb1为0.5mg/mL、葡萄糖4.5g/L、碳酸钠0.15g/L、L-谷氨酰胺0.590g/L、转铁蛋白50g/L、胰岛素5g/L、碱性成纤维细胞生长因子0.01g/L，所述溶媒为复方电解质注射液。

本实施例中：培养基和所述离体的骨髓间充质干细胞的配比为每毫升培养基1.0×10⁶个所述离体的骨髓间充质干细胞。

本实施例中：离体的人骨髓间充质干细胞为离体的人同种异体骨髓间充质干细胞。

本实施例中：一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：配制完全培养液，所述完全培养液为L-DMEM和质量浓度20％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素；

步骤(2)：取骨髓，置于无菌肝素管中，每毫升骨髓加100U肝素抗凝，充分混匀后，用PBS液调整骨髓细胞浓度至10⁶/ml，以体积比1:1加入Ficoll分离液和骨髓细胞悬液，不破坏界面，水平离心机20℃条件下500g离心25分钟，自然沉降，从界面上取出单个核细胞，用PBS液洗涤2次；

步骤(3)：将步骤(2)得到的细胞加步骤(1)配制的完全培养液进行细胞计数，达到10⁶/ml后原代培养，按1×10⁶cells/ml接种到T25细胞培养瓶，每个细胞培养瓶中完全培养液体积为5ml，置于CO₂体积比浓度5％的37℃培养箱中培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每3-5d半量换液1次，细胞达80％融合时，用质量浓度0.25％胰酶于37℃下消化，以1×104cells/ml传代扩增，取P2的骨髓充质干细胞；

步骤(4)：将步骤(3)得到的P2代的骨髓充质干细胞置于O₂体积比浓度为21％的37℃培养箱中，用步骤(1)配制的完全培养液进行培养，直到细胞达60％融合时，改用无血清的饥饿培养液，培养12h，将无血清的饥饿培养液换为含有10ng/ml表皮细胞生长因子的步骤(1)配制的完全培养液，培养至细胞处于对数生长期；

步骤(5)：将步骤(4)得到的骨髓充质干细胞、血浆、低分子量肝素钠、磷酸氢二钾溶液、腺苷、人参皂苷Rb1、葡萄糖、碳酸钠、L-谷氨酰胺、转铁蛋白、胰岛素、碱性成纤维细胞生长因子和溶媒混匀，得到骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂。

作为本发明的一个实施例：一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂，由使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基和离体的骨髓间充质干细胞组成，其特征在于：所述使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的培养基，由溶质和溶媒组成；

本实施例中：溶质包括100％血浆、低分子量肝素钠700U/mL、磷酸氢二钾溶液70mmol/L、腺苷10μmol/L、人参皂苷Rb1为10mg/mL、葡萄糖5.5g/L、碳酸钠0.25g/L、L-谷氨酰胺0.710g/L、转铁蛋白65g/L、胰岛素7g/L、碱性成纤维细胞生长因子0.05g/L，所述溶媒为复方电解质注射液、葡萄糖注射液或生理盐水。

本实施例中：培养基和离体的骨髓间充质干细胞的配比为每毫升培养基4×10⁶个所述离体的骨髓间充质干细胞。

本实施例中：离体的人骨髓间充质干细胞为离体的人同种异体骨髓间充质干细胞。

本实施例中：一种使骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂制备方法，包括以下步骤：

步骤(1)：配制完全培养液，所述完全培养液为L-DMEM和质量浓度20％FBS、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素；

步骤(2)：取骨髓，置于无菌肝素管中，每毫升骨髓加100U肝素抗凝，充分混匀后，用PBS液调整骨髓细胞浓度至10⁷/ml，以体积比1:1加入Ficoll分离液和骨髓细胞悬液，不破坏界面，水平离心机20℃条件下500g离心30分钟，自然沉降，从界面上取出单个核细胞，用PBS液洗涤3次；

步骤(3)：将步骤(2)得到的细胞加步骤(1)配制的完全培养液进行细胞计数，达到10⁷/ml后原代培养，按5×10⁶cells/ml接种到T75细胞培养瓶，每个细胞培养瓶中完全培养液体积为25ml，置于CO₂体积比浓度5％的37℃培养箱中培养，3d后换液去除非贴壁细胞，以后每3-5d半量换液1次，细胞达80％融合时，用质量浓度0.25％胰酶于37℃下消化，以1×10⁴cells/ml传代扩增，取P5代的骨髓充质干细胞；

步骤(4)：将步骤(3)得到的P5代的骨髓充质干细胞置于O₂体积比浓度为21％的37℃培养箱中，用步骤(1)配制的完全培养液进行培养，直到细胞达70％融合时，改用无血清的饥饿培养液，培养15h，将无血清的饥饿培养液换为含有10ng/ml表皮细胞生长因子的步骤(1)配制的完全培养液，培养至细胞处于对数生长期；

步骤(5)：将步骤(4)得到的骨髓充质干细胞、血浆、低分子量肝素钠、磷酸氢二钾溶液、腺苷、人参皂苷Rb1、葡萄糖、碳酸钠、L-谷氨酰胺、转铁蛋白、胰岛素、碱性成纤维细胞生长因子和溶媒混匀，得到骨髓间充质干细胞靶向于心肌梗死灶的试剂。

以上显示和描述了本发明的基本原理和主要特征和本发明的优点，对于本领域技术人员而言，显然本发明不限于上述示范性实施例的细节，而且在不背离本发明的精神或基本特征的情况下，能够以其他的具体形式实现本发明。因此，无论从哪一点来看，均应将实施例看作是示范性的，而且是非限制性的，本发明的范围由所附权利要求而不是上述说明限定，因此旨在将落在权利要求的等同要件的含义和范围内的所有变化囊括在本发明内。

此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。