阅读说明：本技术 一种可检测粘度和硫化氢的荧光探针及制备与应用 (Fluorescent probe capable of detecting viscosity and hydrogen sulfide, preparation and application thereof ) 是由 张培盛 刘会 田勇 李修莉 张崇华 陈建 于 2019-08-21 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种可检测粘度和硫化氢的荧光探针及制备与应用,该荧光探针是以咔唑,4-(二乙基氨基)水杨醛、四乙酰基-α-D-溴代半乳糖为原料制备的一种新型可检测粘度和硫化氢的荧光探针。该荧光探针能高灵敏性检测粘度变化,同时在一定粘度条件下,也能实现对硫化氢的高选择性和高灵敏度快速比率检测。相比于现有的荧光检测技术,本发明得到的荧光探针制备简单、合成路线成熟,具有双重检测功能,并且选择性好,抗干扰能力强,适于放大合成和实际生产应用,在分析化学、生命科学、以及环境科学等技术领域有着巨大的应用前景。(The invention discloses a fluorescent probe capable of detecting viscosity and hydrogen sulfide, and preparation and application thereof. The fluorescent probe can detect viscosity change with high sensitivity, and can realize high selectivity and high sensitivity rapid ratio detection of hydrogen sulfide under a certain viscosity condition. Compared with the existing fluorescence detection technology, the fluorescent probe obtained by the invention has the advantages of simple preparation, mature synthetic route, dual detection functions, good selectivity, strong anti-interference capability, suitability for amplification synthesis and practical production application, and huge application prospect in the technical fields of analytical chemistry, life science, environmental science and the like.)

一种可检测粘度和硫化氢的荧光探针及制备与应用

技术领域

本发明涉及分析化学、生命科学以及环境科学等领域，具体地说，涉及具有粘度和硫化氢双重检测功能的荧光探针制备，以及荧光探针对粘度和硫化氢检测的应用。

背景技术

粘度是用于反映溶液粘稠程度的一种重要指标，其主要取决于物质在溶液中的扩散速度，在宏观及微观领域中具有十分重要的应用价值在生物体系中，其内部所处环境的粘度水平在整个生命体系中起着至关重要的作用。当人体内的血浆粘度逐渐增加时，就会使人诱发各种疾病，例如高血压、高血脂、脑梗塞、心脏病等，危害人们的安全。

硫化氢分子(H2S)作为生物体内的重要信号分子之一，在调节人的生理机能方面有着非常关键的作用，硫化氢可参与血红蛋白改变，促进体内亚硝基类化合物的还原，调节体内多种酶的功能等。并且体内的硫化氢分子已被证实和许多重大疾病有着密切的关系，例如：硫化氢分子可以起到调节正常肝脏以及肝硬化肝脏中的微血管循环；以及其可以高效的调节心肌收缩力，舒张血管，并且可以平稳双向的调节血压。

目前，已经发展起来的检测粘度和硫化氢方法很多。然而，大部分的检测方法成本投入较高，检测过程过于复杂，这些因素都严重制约了某些方法在实际检测中的运用。荧光探针由于具有灵敏度高、选择性好、易合成、廉价以及良好的生物应用等特点，已成为生命科学和环境科学中主要的检测工具。一些专利中也有报道检测粘度的小分子荧光探针(CN106634968A、CN109053549A、CN106986782A)，以及小分子硫化氢荧光探针(CN108558875A、CN109134483A、CN109422721A)等。然而一些荧光探针分子只能针对粘度或硫化氢进行检测，无法实现一种探针多种响应模式的检测。因此，发明一种简单高效、多响应的检测技术具有相当重要的现实意义和应用前景。

有鉴于此特提出本发明。

发明内容

本发明要解决的技术问题在于克服现有技术的不足，提供一种可检测粘度和硫化氢的荧光探针及制备与应用，该荧光探针是以咔唑，4-(二乙基氨基)水杨醛，四乙酰基-α-D-溴代半乳糖为原料制备的一种新型可检测硫化氢和粘度的荧光探针，进一步应用研究表明，该荧光探针能够实现对粘度和硫化氢的高灵敏度、高选择性的快速检测。

为解决上述技术问题，本发明采用技术方案的基本构思是：

一种可检测粘度和硫化氢的荧光探针的制备，包括以下步骤：

(1)取产物11,1'-(9H-咔唑-3,6-二基)双(乙-1-酮)和氢氧化钾溶解在乙醇中，在70℃下加热6h，然后蒸发溶剂并干燥，得到中间产物为黄棕色固体，将其不经进一步纯化用于下一步骤；

(2)取步骤(1)合成的中间产物溶解在二甲亚砜中，再滴加3-溴丙炔，室温下搅拌6h，然后，将粗产物溶解在二氯甲烷中并用水洗涤，将有机层用无水硫酸钠干燥并浓缩后，进行硅胶层析柱分离提纯，真空干燥，得到相应的产物2；

(3)取步骤(2)合成的产物2和4-(二乙基氨基)水杨醛加入甲烷磺酸中，在90℃搅拌12h，冷却至室温后，将混合物加入到冰水溶液中，然后加入浓度为70％高氯酸，将所得混合物用二氯甲烷萃取，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，进行硅胶层析柱分离提纯，真空干燥，得到相应的产物3；

(4)取相应的产物4(2R，3R，4S，5S，6R)-2-叠氮基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇合成的产物4和步骤(3)合成的产物3、及β-抗坏血酸钠、五水硫酸铜于10mL的封管，加入四氢呋喃:水(3:2(v/v))混合溶剂，充氮排氧，室温下反应24h，减压旋干，用二氯甲烷多次洗涤干燥，再用蒸馏水多次洗涤，得到黑色固体，真空干燥，得所需的荧光探针，即一种具粘度和硫化氢检测功能的荧光探针，其结构式如下：

进一步地，所述步骤(1)中，产物1和氢氧化钾的摩尔比为1:1～1.5，优选1:1.2；所述步骤(2)中，中间产物和3-溴丙炔的摩尔比为1:5～20，优选1:10；所述步骤(3)中，产物2和4-(二乙基氨基)水杨醛摩尔比为1:2～5，优选1:3，反应温度60～80℃，优选75℃，反应时间3～7h，优选5h，产物2在甲烷磺酸中的浓度为0.1～0.5mol/L，优选0.2mol/L；所述步骤(4)中，产物3和产物4摩尔比为1:2～5，优选1:3mol，溶剂水和四氢呋喃体积比1:1～3，优选1:1.5。

根据上述制备方法制备的荧光探针分子，其具体的反应过程如下：

上述反应过程中，产物1参照已知文献(Dyes and Pigments 133(2016)238-247)合成；产物4参照已知专利CN106543251A合成。

一种根据上述的制备方法制备的荧光探针。

根据上述的制备方法制备的荧光探针在粘度和硫化氢快速检测中的应用。

采用上述技术方案后，本发明与现有技术相比具有以下有益效果。

本发明采用咔唑，4-(二乙基氨基)水杨醛，四乙酰基-α-D-溴代半乳糖反应制备所需要的荧光探针，一方面，该探针随着粘度的增加，在630nm处，荧光强度显著增强。另一方面，在一定粘度条件下，该荧光探针在有H₂S存在时，在560nm处会随着H₂S浓度的增加出现显著的荧光增强现象，而在630nm处，随着H₂S浓度的增加呈现明显的荧光下降现象，进而表现出明显的比率检测效果。该荧光传感器对粘度和硫化氢的检测具有明显的高选择性快速响应，并且能达到高灵敏度检测的效果。相比于现有的一些检测技术，本发明中的荧光化学探针成本投入较少，合成路线简单、后处理方便、可直接对粘度和硫化氢实现快速特异性识别，适合放大生产和实际应用。尤其是在线粒体等生物体内环境的应用有着极其重要的意义。

下面结合附图对本发明的

具体实施方式

作进一步详细的描述。

附图说明

附图作为本申请的一部分，用来提供对本发明的进一步的理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，但不构成对本发明的不当限定。显然，下面描述中的附图仅仅是一些实施例，对于本领域普通技术人员来说，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他附图。在附图中：

图1为制备的荧光探针的核磁图。

图2为制备的荧光探针对粘度和硫化氢的识别示意图。

图3为不同粘度浓度时荧光探针的荧光发射光谱变化图(激发波长：470nm，已加入硫化氢清除剂)。

图4为荧光探针随粘度变化的荧光强度变化值对应的拟合曲线和该曲线所对应的函数图。

图5为在一定粘度条件下，不同硫化氢浓度时，荧光探针的荧光发射光谱变化图(λex＝470nm)，[H₂S]＝0(a)，2.0×10^-6mol/L(b)，4.0×10^-6mol/L(c)，6.0×10^-6mol/L(d)，8×10^-6mol/L(e)，1.0×10^-5mol/L(f)，1.2×10^-5mol/L(g)，1.4×10^-5mol/L(h)，1.6×10^{- 5}mol/L(i)，2.0×10^-5mol/L(j)，2.4×10^-5mol/L(k)，2.8×10^-5mol/L(l)，3.2×10^-5mol/L(m)，3.6×10^-5mol/L(n)，4.0×10^-5mol/L(o)，4.4×10^-5mol/L(p)，4.8×10^-5mol/L(q)，5.2×10^-5mol/L(r)，5.6×10^-5mol/L(s)，6.0×10^-5mol/L(t)，6.4×10^-5mol/L(u)，6.8×10^{- 5}mol/L(v)(注：该荧光探针浓度为5μM)。

图6为在一定粘度条件下，荧光探针随H₂S浓度变化的荧光强度变化值对应的拟合曲线和该曲线所对应的函数图。

图7为一定粘度条件下各种离子对该荧光探针荧光比率强度的选择性对比数据图，加入后的离子的浓度均为6.0×10^-4mol/L，硫化氢浓度为6.8×10^-5mol/L，I₅₆₀和I₆₃₀为各离子和过氧化物加入前后的荧光探针在以470nm为激发波长，560nm和630nm为发射波长处的荧光强度变化值。

需要说明的是，这些附图和文字描述并不旨在以任何方式限制本发明的构思范围，而是通过参考特定实施例为本领域技术人员说明本发明的概念。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明实施例中的附图，对实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1：一种具有硫化氢和粘度检测功能的荧光探针的制备。

包括以下步骤：

(1)中间产物的制备。

取产物11,1'-(9H-咔唑-3,6-二基)双(乙-1-酮)(251.1mg，1mmol)和氢氧化钾(67.2mg，1.2mmol)在乙醇(40mL)中的混合物在70℃下加热6h。然后蒸发溶剂并干燥，得到中间产物为黄棕色固体，将其不经进一步纯化用于下一步骤。

(2)利用中间产物合成产物2。

将步骤(1)合成的中间产物全部溶解在二甲亚砜中，再滴加3-溴丙炔(159.0mg，10mmol)，室温下搅拌6h，然后，将粗产物溶解在二氯甲烷(60mL)中并用水(105mL)洗涤。将有机层用无水硫酸钠干燥并浓缩，装柱提取纯产物，得到相应的产物2(143mg)。

(3)利用产物2和4-(二乙基氨基)水杨醛合成产物3。

将产物2(86.7mg，0.3mmol),4-(二乙基氨基)水杨醛(173.7mg，0.9mmol)加入10mL圆底烧瓶中，再加入甲烷磺酸(1mL)中并在75℃搅拌5h。冷却至室温后，将混合物加入到冰水溶液(30g)中，然后加入70％高氯酸(1mL)。将所得混合物用二氯甲烷(120mL)分批次萃取，经无水硫酸钠干燥，过滤并减压浓缩，装柱提取纯产物，用二氯甲烷：甲醇(体积比100:1)过柱，得到相应的产物3(56.8mg)。

(4)利用产物3和产物4合成探针。

取相应的产物4(2R，3R，4S，5S，6R)-2-叠氮基-6-(羟甲基)四氢-2H-吡喃-3,4,5-三醇(61.0mg,0.1mmol)与产物3(83.0mg,0.4mmol)、β-抗坏血酸钠(6.0mg，0.03mmol)五水硫酸铜(4.0mg，0.015mmol)于10mL的封管，加入四氢呋喃:水(3:2)混合溶剂5mL，充氮排氧，室温下反应24h，减压旋干，用二氯甲烷多次洗涤干燥，再用蒸馏水多次洗涤，得到黑色固体，真空干燥，得所需的荧光探针，即一种具有硫化氢和粘度识别功能的荧光探针。

实施例2：粘度的检测实验。

配制浓度为0.5mM实施例1所得荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液，加入硫化氢清除剂50mg待用。

取10个5mL样品瓶，分别取3mL不同比例甘油与甲醇的溶剂体积比(甘油:甲醇＝8.5:1.5，8.0:2.0，7.5:2.5，7:3，6.5:3.5，6:4，5:5，4:6，3:7，2:8)，即粘度分别453.17，347.73，263.93，198.02，146.75，107.34，35.01，26.44，11.8，4.83Pa.s。然后加入探针母液(终浓度为5μM)，进行荧光扫描(激发波长470nm)，测得各体系中相对荧光强度，如图3所示。由图3可知，随着溶剂粘度的增加，相对荧光强度变强，根据图3的荧光强度变化值可作出对应的拟合后的比较理想的函数曲线图和该曲线所对应的函数图，见图4。

实施例3：硫化氢的检测实验。

配制浓度为0.5mM实施例1所得荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液待用，该母液的粘度是固定的。

取22个5mL样品瓶，分别加入实施例1中所得的荧光探针配置的母液0.03mL，再加入甘油：甲醇体积比为85：15的混合溶液2.97mL,然后分别将浓度为[H₂S]＝0(a)，2.0×10^{- 3}mol/L(b)，4.0×10^-3mol/L(c)，6.0×10^-3mol/L(d)，8×10^-3mol/L(e)，1.0×10^-2mol/L(f)，1.2×10^-2mol/L(g)，1.4×10^-2mol/L(h)，1.6×10^-2mol/L(i)，2.0×10^-2mol/L(j)，2.4×10^-2mol/L(k)，2.8×10^-2mol/L(l)，3.2×10^-2mol/L(m)，3.6×10^-2mol/L(n)，4.0×10^-2mol/L(o)，4.4×10^-2mol/L(p)，4.8×10^-2mol/L(q)，5.2×10^-2mol/L(r)，5.6×10^-2mol/L(s)，6.0×10^-2mol/L(t)，6.4×10^-2mol/L(u)，6.8×10^-2mol/L(v)的3μL硫化氢溶液加入22个样品瓶中，常温下搅拌10min后，以470nm为激发波长，分别测定这些样品的荧光强度，得22个样品的荧光发射光谱变化图，见图5。测定结果表明：在一定粘度条件下，该荧光探针的荧光强度在560nm处会随着H₂S浓度的增加出现显著的荧光增强现象，而在630nm处，随着H₂S浓度的增加呈现明显的荧光下降现象，根据图5的荧光强度变化值可作出对应的拟合后的比较理想的函数曲线图和该曲线所对应的函数图,见图6。

实施例4：其它离子和过氧化物影响的对比检测实验。

配制浓度为0.5mM实施例1所得荧光探针的二甲基亚砜(DMSO)的测试母液待用，该母液的粘度是固定的。

取25个5mL样品瓶，分别加入实施例1中所得的荧光探针配置的母液0.03mL，再加入甘油：甲醇体积比为85：15的混合溶液2.97mL,分别将浓度为0.1mol/L的Ca²⁺、Fe²⁺、Ni²⁺、Cu²⁺、Zn²⁺、Mg²⁺、Ca²⁺、H₂O₂、Na⁺、K⁺、NO^3-、SO₄ ^2-、Cl^-、Ac^-、H₂PO₄ ^2-、TBHP(过氧化叔丁醇)、t-BuO·(过氧化叔丁基自由基)、HO·(羟基基自由基)、H₂O₂(过氧化氢)Hys、Cys、GSH溶液各取18μL加入后23个样品瓶中，取3μL浓度为6.8×10^-5mol/L的H₂S溶液加入到24号，0号样品为空白样。然后分别测定25个样品在470nm波长激发下的荧光光谱数据，得到在470nm和630nm波长发射处的荧光比率变化值，结果见图7。测定结果表明：在一定粘度下条件下，除了H₂S外，其它上述各种离子和过氧化物对所制备的荧光传探针的荧光比率强度没有明显影响。

以上所述仅是本发明的较佳实施例而已，并非对本发明作任何形式上的限制，虽然本发明已以较佳实施例揭露如上，然而并非用以限定本发明，任何熟悉本专利的技术人员在不脱离本发明技术方案范围内，当可利用上述提示的技术内容作出些许更动或修饰为等同变化的等效实施例，但凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改、等同变化与修饰，均仍属于本发明方案的范围内。