阅读说明：本技术 阿糖胞苷结构类似物及其制备方法和用途 (Cytarabine structure analogue and preparation method and application thereof ) 是由 付瑞新 黎维勇 周媛 于 2020-12-07 设计创作，主要内容包括：本发明公开了阿糖胞苷结构类似物及其制备方法和用途。本发明首次合成阿糖胞苷结构类似物P1～P4,均能抑制白血病细胞HL-60增殖,尤其,与Ara-C相比,阿糖胞苷结构类似物P4对白血病细胞增殖抑制能力更强,细胞穿透能力更强,进入细胞内的药物浓度和在细胞内产生的活性代谢产物三磷酸阿糖胞苷的浓度更高,有更高的生物利用度；能在细胞内转化成母药阿糖胞苷,显著提高体内靶标细胞的血药浓度,可避免大剂量用药带来的毒副作用和耐药性；显著延长阿糖胞苷的半衰期,在较长时间内维持有效血药浓度,可口服给药,可避免注射用药带来的不便。本发明的制备方法简单易操作,适合工业化生产。(The invention discloses a cytarabine structure analogue and a preparation method and application thereof. The cytarabine structure analogue P1-P4 synthesized for the first time can inhibit the proliferation of the leukemia cell HL-60, and particularly, compared with Ara-C, the cytarabine structure analogue P4 has stronger inhibition capability on the proliferation of the leukemia cell and stronger cell penetrating capability, the concentration of a medicament entering the cell and the concentration of an active metabolite cytarabine triphosphate generated in the cell are higher, and the bioavailability is higher; can be converted into the parent drug cytarabine in cells, obviously improves the blood concentration of target cells in vivo, and can avoid toxic and side effects and drug resistance caused by large-dose medication; obviously prolongs the half-life period of the cytarabine, maintains effective blood concentration for a longer time, can be orally taken, and can avoid the inconvenience caused by injection. The preparation method is simple and easy to operate, and is suitable for industrial production.)

阿糖胞苷结构类似物及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于有机合成领域，具体涉及阿糖胞苷结构类似物及其制备方法和用途。

背景技术

阿糖胞苷(cytosine arabinoside，Ara-C)化学名：1-β-D-阿拉伯呋喃糖基-4-氨基-2(1H)-胞嘧啶酮，CAS登记号为[147-94-4]，分子式：C₉H₁₃N₃O₅，其结构式如下：

阿糖胞苷属于嘧啶类抗代谢药物，主要用于治疗急性髓系白血病(acute myeloidleukemia,AML)。Ara-C在体内须经过三个步骤转化为阿糖胞苷三磷酸(Ara-CTp)，才能发挥抗癌作用。首先由胞浆内脱氧胞苷激酶催化形成阿糖胞苷一磷酸(Ara-CMp)，然后分别通过一磷酸和二磷酸嘧啶核苷激酶作用转化为阿糖胞苷二磷酸(Ara-CDp)和活性型阿糖胞苷三磷酸(Ara-CTp)，阿糖胞苷三磷酸通过抑制DNA多聚酶，影响DNA合成，抑制细胞的生长，干扰细胞的增殖；也可少量渗入DNA中，干扰DNA的复制，使细胞死亡。但对RNA和蛋白质合成无显著作用，属于作用于S期的细胞周期特异性药物，对处于S增殖期细胞的作用最为敏感，并对G1/S及S/G2转换期也有作用。

阿糖胞苷最初由美国Upjohn公司开发，于1969年10月在美国上市，在国内首次注册的时间是1992年。阿糖胞苷分子极性很大，导致小肠的膜通透性差，使得阿糖胞苷口服生物利用度很低，仅20％的药物进入血循环，故不作口服使用而多用静脉给药。因此，在市场上销售的阿糖胞苷主要是注射(粉针)剂，目前国内有多家厂家生产盐酸阿糖胞苷注射剂。此外，由于该药进入体内后会迅速被肝脏的胞嘧啶脱氨酶作用脱氨，生成无活性的尿嘧啶阿糖胞苷，t_1/2很短，仅为3～15分钟，因此，必须采用静脉连续滴注给药，才能维持有效血药浓度，得到较好效果。例如，用于急性粒细胞白血病的治疗时，常用静脉注射或静脉滴注，每天100～200mg/m²,或2～6mg/Kg，连用5～7天，剂量从小增大直至出现骨髓抑制。停药5～7天后或骨髓恢复后再重复使用。临床来看，大剂量的阿糖胞苷治疗比普通剂量远期治疗效果更好，但是对血液、神经系统和器官有毒副作用，容易产生耐药，而且五年内的生存率并未显著提高。阿糖胞苷的毒副作用和使用剂量呈正相关，也限制了阿糖胞苷的临床使用。

因此，有必要研发出更加有效的治疗药物，同时能够口服给药，为恢复期患者方便院外给药。

发明内容

有鉴于此，本发明提供了阿糖胞苷结构类似物及其制备方法和用途。阿糖胞苷结构类似物能够抑制人白血病细胞增殖，尤其是，相较于阿糖胞苷，一些阿糖胞苷结构类似物对于白血病细胞的透过性更好、生物利用度更高、半衰期更长，能够口服给药，有望用作新型抗白血病药物。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

本发明的第一方面，提供了阿糖胞苷结构类似物，其结构通式如下式(Ⅰ)：

其中，R1＝Ph或C₁₈H₃₇，

R₂＝H或。

具体来说，

所述阿糖胞苷结构类似物可以是如下式(Ⅱ)所示的阿糖胞苷结构类似物P1：

或者，所述阿糖胞苷结构类似物可以是如下式(Ⅲ)所示的阿糖胞苷结构类似物P2：

或者，所述阿糖胞苷结构类似物可以是如下式(Ⅳ)所示的阿糖胞苷结构类似物P3：

或者，所述阿糖胞苷结构类似物可以是如下式(V)所示的阿糖胞苷结构类似物P4：

本发明的第二方面，提供了阿糖胞苷结构类似物的制备方法。

一种阿糖胞苷结构类似物的制备方法，包括以下步骤：

将阿糖胞苷和磷酰氯衍生物溶于无水四氢呋喃，N₂保护下降温至-70～-78℃，缓慢滴加1-甲基咪唑，再于-70～-78℃搅拌，然后升温至室温反应，反应完成后，反应液经后处理纯化得到产物；其中，

当磷酰氯衍生物为如下式(VI)所示的化合物2时，得到的产物为阿糖胞苷结构类似物P1；

当磷酰氯衍生物为如下式(VII)所示的化合物4时，得到的产物为阿糖胞苷结构类似物P3；

。

优选的技术方案中，阿糖胞苷：磷酰氯衍生物：1-甲基咪唑的摩尔比为1：(1.5～2.0)：(2.0～3.0)。

优选的技术方案中，搅拌时间为1～2小时。

优选的技术方案中，所述升温为自然升温。

优选的技术方案中，所述室温反应的时间为12～16小时。

优选的技术方案中，所述后处理纯化包括：反应液浓缩，加入二氯甲烷稀释，先后用稀盐酸、水、饱和氯化钠溶液洗，合并有机相后干燥浓缩，柱层析纯化得到产物。

优选的技术方案中，所述浓缩均为减压浓缩，最优选为40℃减压浓缩。

优选的技术方案中，柱层析采用体积比为20/1～10/1的二氯甲烷/甲醇。

或者，

一种阿糖胞苷结构类似物的制备方法，包括以下步骤：

将选定化合物与天冬氨酸衍生物溶于无水四氢呋喃，N₂保护下降温至-5℃～0℃，缓慢滴加1-丙基磷酸酐，再升温至室温反应，反应所得第一反应液用饱和NaHCO₃溶液淬灭，水相用二氯甲烷萃取，有机相合并后干燥浓缩，柱层析纯化得到中间体；将中间体溶于甲醇，加入Pd/C，通氢气进行反应，薄层色谱监测反应完成后，所得第二反应液经后处理得到产物；其中，

天冬氨酸衍生物为如下式(Ⅷ)所示的化合物3

当选定化合物为阿糖胞苷结构类似物P1时，所得产物为阿糖胞苷结构类似物P2；

当选定化合物为阿糖胞苷结构类似物P3时，所得产物为阿糖胞苷结构类似物P4。

优选的技术方案中，选定化合物：天冬氨酸衍生物：1-丙基磷酸酐的摩尔比为1：(1.2～1.5)：(2.0～2.5)。

优选的技术方案中，所述升温为自然升温。

优选的技术方案中，室温反应时间为1～2小时。

优选的技术方案中，柱层析采用体积比为20/1～1/1的石油醚/乙酸乙酯。

优选的技术方案中，Pd/C的用量为选定化合物的质量的2～10％。

优选的技术方案中，氢气为0.05～0.1Mpa。

优选的技术方案中，所述的后处理包括：将所述第二反应液过硅藻土垫收集第一过滤液，再用甲醇淋洗所述硅藻土垫收集第二过滤液，合并第一和第二过滤液得到滤液，所述滤液经浓缩后用甲基叔丁基醚搅拌抽滤，得到产物。

优选的技术方案中，所述浓缩均为减压浓缩，最优选为40℃减压浓缩。

本发明中，所述室温为20～30℃。

本发明的第三方面，提供了阿糖胞苷结构类似物在制备用于治疗白血病的药物中的用途。

进一步，本发明还提供了阿糖胞苷结构类似物在制备用于治疗白血病的口服药物中的用途。

相对于现有技术，本发明具有以下有益的技术效果：

本发明首次合成阿糖胞苷结构类似物P1～P4，均能抑制人白血病HL-60细胞，且在低浓度下抑制效果均优于盐酸阿糖胞苷，有望用作新型抗白血病药物。

尤其是，与阿糖胞苷相比，阿糖胞苷结构类似物P4对白血病细胞增殖抑制能力更强，细胞穿透能力更强，进入细胞内的药物浓度和在细胞内产生的活性代谢产物三磷酸阿糖胞苷的浓度更高，有更高的生物利用度；在细胞内转化成母药阿糖胞苷，显著提高体内靶标细胞的血药浓度，可避免大剂量用药带来的毒副作用和耐药性；显著延长阿糖胞苷的半衰期，在较长时间内维持有效血药浓度，可口服给药，从而避免注射用药带来的不便。可见，阿糖胞苷结构类似物P4完全克服了阿糖胞苷极性大，透膜性差，在体内易被代谢失活、半衰期短等缺点，为口服给药提供了可能，填补了国内尚无此类新药上市的技术空白。

本发明的阿糖胞苷结构类似物的制备方法简单易操作，有望用于工业化生产。

附图说明

图1为实施例1制得的化合物的HNMR谱图，谱图显示其结构如式(Ⅱ)所示，记为阿糖胞苷结构类似物P1。

图2为实施例8中不同待测药物与人白血病细胞HL60孵育不同时间后细胞内原药及代谢产物的浓度对比曲线图。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明的实施方案进行详细描述。应理解，这些实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。

下列实施例中未注明具体技术或条件者，可采用本领域中的常规方法，例如按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书中供应商所建议的条件进行。

下列实施例中未特别说明的各种仪器、原料和试剂，未注明生产厂商者，均为可以通过市场购得的常规产品。在下列实施例中列出的所使用的具体材料及其来源，仅仅是示例性的，并不意图限制本发明，与如下组织、细胞、试剂和仪器的类型、型号、品质、性质或功能相同或相似的材料均可以用于实施本发明。

材料及来源说明：

阿糖胞苷，CAS：147-94-4，购自上海皓鸿生物医药科技有限公司。

盐酸阿糖胞苷，CAS：69-74-9，购自上海皓鸿生物医药科技有限公司。

化合物2，结构如式(VI)所示，CAS：261909-49-3，购自武汉熙瑞医药科技有限公司。

化合物3，结构如式(Ⅷ)所示，CAS：4779-31-1，购自上海皓鸿生物医药科技有限公司。

化合物4，结构如式(VII)所示，购自武汉熙瑞医药科技有限公司。

1-丙基磷酸酐(50％乙酸乙酯溶液)，购自上海毕得医药科技股份有限公司。

人白血病细胞HL-60，购自武汉普诺赛生命科技有限公司。

PBMC细胞，为外周血单个核细胞，由大鼠血液经Ficoll淋巴分离液(sigma)分离得到。

Sprague-Dawley大鼠，购自斯贝福(北京)生物技术有限公司公司，实验动物质量合格证编号为SYXK(鄂)2016-0057。

实施例1阿糖胞苷结构类似物P1的合成

合成路线如下式所示：

方法：将阿糖胞苷(化合物1，5.0g，20.56mmol)和化合物2(10.72g，30.84mmol，1.5eq.)溶于无水THF(四氢呋喃，50mL)，N₂保护下降温至-78℃，缓慢滴加1-甲基咪唑(4.39g，53.46mmol，2.6eq.)，再于-78℃搅拌2小时后自然升温至室温(20℃)反应12小时。反应液40℃减压浓缩，加入DCM(二氯甲烷)稀释，先后用稀盐酸(0.5mol/L)、水、饱和氯化钠溶液洗，有机相合并后无水硫酸钠干燥，40℃减压浓缩后，柱层析(DCM/MeOH＝20/1～10/1，V/V，MeOH为甲醇)纯化，得到白色粉末状化合物。¹H-NMR(400MHz,CD₃OD)：δ7.76(d，J＝4.4Hz，1H)，7.37～7.33(m，2H)，6.23(d，J＝4.0Hz，1H)，5.78(d，J＝7.6Hz，1H)，4.40～4.23(m，2H)，4.07～4.06(m，1H)，4.05～3.96(m，4H)，1.52～1.40(m，1H)，1.38～1.33(m，7H)，0.91～0.87(m，6H)。HNMR谱图如图1所示。分析确定其结构如式(Ⅱ)所示，记为阿糖胞苷结构类似物P1。

实施例2阿糖胞苷结构类似物P2的合成

合成路线如下式所示：

方法：将化合物P1(3.0g，5.41mmol)和化合物3(2.32g，6.49mmol，1.2eq.)溶于无水DCM(四氢呋喃，50mL)，N₂保护下降温至0℃，缓慢滴加1-丙基磷酸酐(50％乙酸乙酯溶液)(6.88g，其中，1-丙基磷酸酐T₃P 10.82mmol，2.0eq.)，再自然升温至室温(20℃)反应1小时。反应液用饱和NaHCO₃溶液淬灭，水相用DCM(二氯甲烷，50mL×2)萃取，有机相合并后无水硫酸钠干燥，40℃减压浓缩后，柱层析(PE/EA＝20/1～1/1，PE为石油醚，EA为乙酸乙酯)纯化，得到中间体P1a。将中间体P1a溶于甲醇(50mL)，加入Pd/C(0.3g)，氮气置换3次后通氢气(0.1Mpa)反应。TLC(薄层色谱)监测反应完成后，将所得反应液过硅藻土垫收集第一过滤液，再用少量甲醇淋洗硅藻土垫收集第二过滤液，合并第一过滤液和第二过滤液得到的滤液，经40℃减压浓缩后，用MTBE(甲基叔丁基醚)搅拌抽滤，得白色粉末状化合物。LCMS：[M+1]⁺理论计算：670.24，实测：670.20。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d)：δ10.48(s，1H)，8.84(d，J＝4.0Hz，1H)，7.92(s，1H)，7.37～7.23(m，5H)，6.12(d，J＝4.0Hz，1H)，5.87(d，J＝7.6Hz，1H)，5.11(brs，2H)，4.40～4.23(m，2H)，4.18(s，1H)，4.07～3.93(m，6H)，3.81～3.66(m，4H)，2.79(d，J＝7.6Hz，2H)，1.40～1.33(m，7H)，0.94～0.88(m，6H)。由此确定其结构如式(Ⅲ)所示，记为阿糖胞苷结构类似物P2。

实施例3阿糖胞苷结构类似物P3的合成

合成路线如下式所示：

方法：将阿糖胞苷(化合物1，5.0g，20.56mmol)和化合物4(16.16g，30.84mmol，1.5eq.)溶于无水THF(四氢呋喃，50mL)，N₂保护下降温至-78℃，缓慢滴加1-甲基咪唑(4.39g，53.46mmol，2.6eq.)，再于-78℃搅拌2小时后自然升温至室温(20℃)反应12小时。反应液40℃减压浓缩，加入DCM(二氯甲烷)稀释，先后用稀盐酸(0.5mol/L)、水、饱和氯化钠溶液洗，有机相合并后无水硫酸钠干燥，40℃减压浓缩后，柱层析(DCM/MeOH＝20/1～10/1，V/V)纯化，得到白色粉末状化合物。LCMS：[M+1]⁺理论计算：731.46，实测：731.50。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d)：δ9.13(d，J＝4.0Hz，1H)，8.79(brs，1H)，5.89(d，J＝7.6Hz，1H)，5.87(d，J＝4.4Hz，1H)，4.40～4.27(m，2H)，4.23～4.06(m，8H)，3.58(brs，2H)，1.87～1.77(m，2H)，1.71～1.33(m，39H)，0.98～0.88(m，6H)，由此确定其结构如式(Ⅳ)所示，记为阿糖胞苷结构类似物P3。

实施例4阿糖胞苷结构类似物P4的合成

合成路线如下式所示：

将化合物P3(3.0g，4.10mmol)和化合物3(1.76g，4.93mmol，1.2eq.)溶于无水DCM(四氢呋喃，50mL)，N₂保护下降温至0℃，缓慢滴加缓慢滴加1-丙基磷酸酐(50％乙酸乙酯溶液)(5.21g，其中，1-丙基磷酸酐8.20mmol，2.0eq.)，再自然升温至室温(20℃)反应1小时。反应液用饱和NaHCO₃溶液淬灭，水相用DCM(二氯甲烷，50mL×2)萃取，有机相合并后无水硫酸钠干燥，40℃减压浓缩后，柱层析(PE/EA＝20/1～1/1，PE为石油醚，EA为乙酸乙酯)纯化，得到中间体P3a。将中间体P3a溶于甲醇(50mL)，加入Pd/C(0.3g)，氮气置换3次后通氢气(0.1MPa)反应。TLC(薄层色谱)监测反应完成后，将所得反应液过硅藻土垫收集第一过滤液，再用少量甲醇淋洗硅藻土垫收集第二过滤液，合并第一过滤液和第二过滤液得到的滤液，经40℃减压浓缩后，用MTBE(甲基叔丁基醚)搅拌抽滤，得白色粉末状化合物。LCMS：[M+1]⁺理论计算：846.49，实测：846.50。¹H-NMR(400MHz,DMSO-d)：δ10.48(s,1H)，9.13(d，J＝4.0Hz，1H)，7.92(s，1H)，5.89(d，J＝4.4Hz，1H)，5.78(d，J＝4.0Hz，1H)，5.11(brs，2H)，4.40～4.27(m，2H)，4.23～4.06(m，8H)，3.81～3.66(m，6H)，2.79(d，J＝7.6Hz,2H)，1.87～1.77(m，2H)，1.71～1.33(m，39H)，0.98～0.88(m，6H)。分析确定其结构如式(Ⅴ)所示，记为阿糖胞苷结构类似物P4。

实施例5阿糖胞苷结构类似物P1～P4对人白血病细胞HL-60增殖的抑制作用

受试化合物：实施例1～4制备的阿糖胞苷结构类似物P1～P4、盐酸阿糖胞苷。

细胞培养：将人白血病细胞株HL-60置于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度培养箱中定期传代培养，取对数生长期细胞作为后续实验用细胞。

配制药物母液：将受试化合物溶解于DMSO(二甲基亚砜)，配制成浓度为100mmol/L的母液，保存备用。实验时用DMSO稀释至所需浓度。

抑制率测定：取对数生长期的HL-60细胞，细胞计数制成密度为5×10⁴个/mL的细胞悬液，接种于24孔培养板内，每孔加入细胞悬液2mL(细胞数为10⁵个/孔)。将24孔板置于37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度培养箱中培养24h，弃去培养液，每孔加入100μL含浓度为1.5625μmol/L的受试化合物的培养液。另设对照孔，对照孔不加受试化合物，仅加100μL的培养液。每组设置3个复孔。将24孔板置于37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度培养箱中培养72小时，取出24孔板，从孔中取出细胞，以等比例加入台盼蓝，混匀。使用血球计数板分别计数对照孔和加药孔的细胞数。按如下公式计算生长抑制率：

生长抑制率(％)＝(1-加药孔细胞数/对照孔细胞数)×100％

实验分为5组：第一组为阿糖胞苷结构类似物P1组，第二组为阿糖胞苷结构类似物P2组，第三组为阿糖胞苷结构类似物P3组，第四组为阿糖胞苷结构类似物P4组，第五组为盐酸阿糖胞苷组。测得的细胞增殖抑制率分别为：18％、12％、14％、56％、10％。可以发现：在该较低浓度下，阿糖胞苷结构类似物P1～P4对人白血病细胞HL60增殖生长的抑制效果均强于盐酸阿糖胞苷。

实施例6阿糖胞苷结构类似物P1对人白血病细胞HL-60增殖的抑制作用

受试化合物：实施例1制备的阿糖胞苷结构类似物P1、盐酸阿糖胞苷。

细胞培养：将人白血病细胞株HL-60置于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度培养箱中定期传代培养，取对数生长期细胞作为后续实验用细胞。

配制药物母液：将受试化合物溶解于DMSO(二甲基亚砜)，配制成浓度为100mmol/L的母液，保存备用。实验时用DMSO稀释至所需浓度。

抑制率测定：取对数生长期的HL-60细胞，细胞计数制成密度为5×10⁴个/mL的细胞悬液，接种于24孔培养板内，每孔加入细胞悬液2mL(细胞数为10⁵个/孔)。将24孔板置于37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度培养箱中培养24h，弃去培养液，每孔加入100μL相应的含不同浓度受试化合物的培养液，每一受试化合物设5个浓度梯度(25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L、1.5625μmol/L)，每一浓度设置3个复孔。另设对照孔，对照孔不加受试化合物，仅加100μL的培养液。对照孔设置3个复孔。将24孔板置于37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度培养箱中培养72小时，取出24孔板，从孔中取出细胞，以等比例加入台盼蓝，混匀。使用血球计数板分别计数对照孔和加药孔的细胞数。按如下公式计算生长抑制率：

生长抑制率(％)＝(1-加药孔细胞数/对照孔细胞数)×100％

实验分为阿糖胞苷结构类似物P1组和盐酸阿糖胞苷组。各组对HL-60细胞增殖抑制率测定结果如下表1所示：

表1各受试化合物组对HL-60细胞增殖抑制率测定结果

	P1	盐酸阿糖胞苷
			1.5625μmol/L	18％	10％
3.125μmol/L	30％	21％
			6.25μmol/L	50％	30％
12.5μmol/L	60％	40％
			25μmol/L	64％	56％

由表1的结果可见，在不同的梯度浓度下，阿糖胞苷结构类似物P1均对HL60细胞具有抑制作用。这意味着：和盐酸阿糖胞苷一样，阿糖胞苷结构类似物P1可抑制人白血病细胞HL60增殖生长。此外，在每一相同浓度下，阿糖胞苷结构类似物P1对HL60细胞生长的抑制率均高于盐酸阿糖胞苷，显示：阿糖胞苷结构类似物P1对HL60细胞增殖的抑制效果强于盐酸阿糖胞苷。

实施例7阿糖胞苷结构类似物P4对人白血病细胞HL-60增殖的抑制作用

受试化合物：实施例4制备的阿糖胞苷结构类似物P4、阿糖胞苷、盐酸阿糖胞苷。

细胞培养：将人白血病细胞株HL-60置于含10％胎牛血清的RPMI-1640培养液中，在37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度培养箱中定期传代培养，取对数生长期细胞作为后续实验用细胞。

配制药物母液：将受试化合物溶解于DMSO(二甲基亚砜)，配制成浓度为100mmol/L的母液，保存备用。实验时用DMSO稀释至所需浓度。

抑制率测定：取对数生长期的HL-60细胞，细胞计数制成密度为5×10⁴个/mL的细胞悬液，接种于24孔培养板内，每孔加入细胞悬液2mL(细胞数为10⁵个/孔)。将24孔板置于37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度培养箱中培养24h，弃去培养液，每孔加入100μL相应的含不同浓度受试化合物的培养液，每一受试化合物设5个浓度梯度(25μmol/L、12.5μmol/L、6.25μmol/L、3.125μmol/L、1.5625μmol/L)，每一浓度设置3个复孔。另设对照孔，对照孔不加受试化合物，仅加100μL的培养液。对照孔设置3个复孔。将24孔板置于37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度培养箱中培养72小时，取出24孔板，从孔中取出细胞，以等比例加入台盼蓝，混匀。使用血球计数板分别计数对照孔和加药孔的细胞数。按如下公式计算生长抑制率：

生长抑制率(％)＝(1-加药孔细胞数/对照孔细胞数)×100％

实验分为3组：阿糖胞苷组、阿糖胞苷结构类似物P4组、盐酸阿糖胞苷组。各组对HL-60细胞增殖抑制率测定结果如下表2所示：

表2各受试化合物组对HL-60细胞增殖抑制率测定结果

	阿糖胞苷	P4	盐酸阿糖胞苷
				1.5625μmol/L	20％	56％	10％
3.125μmol/L	34％	73％	21％
				6.25μmol/L	52％	86％	30％
12.5μmol/L	66％	90％	40％
				25μmol/L	75％	96％	56％

根据表2的结果：

(1)不同的梯度浓度下，各受试化合物均对HL60细胞具有抑制作用。这意味着：与阿糖胞苷和盐酸阿糖胞苷一样，阿糖胞苷结构类似物P4可抑制人白血病细胞HL60增殖生长。

(2)在每一相同浓度下，阿糖胞苷结构类似物P4对HL60细胞生长的抑制率均为最高，且显著高于阿糖胞苷组和盐酸阿糖胞苷组。浓度为1.5625μmol/L时，阿糖胞苷结构类似物P4对HL60细胞生长的抑制率为56％，而阿糖胞苷和盐酸阿糖胞苷对HL60细胞生长的抑制率分别为20％和10％；浓度为25μmol/L时，阿糖胞苷结构类似物P4对HL60细胞生长的抑制率高达96％，而阿糖胞苷和盐酸阿糖胞苷对HL60细胞生长的抑制率分别为75％和56％。可见，相较于阿糖胞苷和盐酸阿糖胞苷，阿糖胞苷结构类似物P4在每个浓度下对HL60细胞抑制效果明显强得多。

实施例8阿糖胞苷结构类似物在HL-60细胞内孵育不同时间的药物浓度

取对数生长期的HL-60细胞，细胞计数制成密度为5×10⁴个/mL的细胞悬液，接种于24孔培养板内，每孔加入细胞悬液2mL(细胞数为10⁵个/孔)。将24孔板置于37℃、体积分数为5％的CO₂饱和湿度培养箱中培养24h，弃去培养液，每孔加入100μL含浓度为100μmol/L的待测药物的培养液，待测药物分别为阿糖胞苷、实施例4制得的阿糖胞苷结构类似物P4。每组设3个复孔，置于37℃、5％CO₂饱和湿度孵育箱中继续培养。培养不同时间(0.5小时、1小时、3小时、6小时)后，分别测试在HL-60细胞内的原药(阿糖胞苷，图中记为Ara-C；或者，阿糖胞苷结构类似物P4，图中记为BX20-1-004)和相应的活性代谢产物三磷酸阿糖胞苷(图中记为Ara-CTP(ara-c)和Ara-CTP(004))的浓度。浓度对比图如图2所示。

由图2可以看出：

(1)随着孵育时间的延长，HL-60细胞内原药和相应的活性代谢产物的浓度均增加，并且，孵育时间为3小时及以上时，HL-60细胞内活性代谢产物三磷酸阿糖胞苷的浓度均超过其原药浓度。这意味着阿糖胞苷和阿糖胞苷结构类似物P4均能进入HL-60细胞并在细胞内转化为活性代谢产物。

(2)相同的孵育时间下，细胞内阿糖胞苷结构类似物P4的浓度显著高于阿糖胞苷的浓度，这说明阿糖胞苷结构类似物P4穿透细胞膜进入细胞的能力强于阿糖胞苷。

(3)相同的孵育时间下，与阿糖胞苷处理后的细胞中活性代谢产物三磷酸阿糖胞苷的浓度相比，阿糖胞苷结构类似物P4处理后的细胞中活性代谢产物三磷酸阿糖胞苷的浓度高得多。这提示了：较之阿糖胞苷，实施例4制得的阿糖胞苷结构类似物P4能够产生更高浓度的活性代谢产物，从而发挥更强的抗白血病细胞增殖活性。这说明实施例4制得的阿糖胞苷结构类似物P4的生物利用度明显高于阿糖胞苷。

实施例9大鼠体内口服单次给药后药代动力学研究

将8只Sprague-Dawley大鼠分为两组：阿糖胞苷组和阿糖胞苷结构类似物组，每组各4只大鼠，分别单次口服给药阿糖胞苷结构类似物P4溶液(生理盐水溶液，药物浓度为10mg/mL)和阿糖胞苷溶液(生理盐水溶液，药物浓度为10mg/mL)，口服给药剂量为：以阿糖胞苷计为10mg/Kg大鼠。

采用液质联用(HPLC-MS/MS)测定：(1)口服给药阿糖胞苷后血浆及PBMC细胞中阿糖胞苷的浓度；(2)口服给药阿糖胞苷结构类似物P4后血浆及PBMC细胞中原型药(阿糖胞苷结构类似物P4)的浓度；(3)口服给药阿糖胞苷结构类似物P4后血浆及PBMC细胞中代谢物阿糖胞苷的浓度。其结果如下表3中大鼠单次口服给药后血浆及PBMC细胞中原型药及代谢物阿糖胞苷的药代动力学参数(n＝4)所示。表3中阿糖胞苷结构类似物P4记为BX20-1-004。

表3：大鼠口服单次给药后血浆及PBMC细胞中原型药及代谢物阿糖胞苷的药代动力学参数

表3中，AUC为药时曲线下面积，指血药浓度曲线对时间轴所包围的面积，单位ng·h/mL。该参数是评价药物吸收程度的重要指标，反映药物在体内的暴露特性。C_max为药峰浓度，指给药后出现的血药浓度最高值。该参数是反映药物在体内吸收速率和吸收程度的重要指标。t_max为达峰时间，指给药后达到药峰浓度所需的时间。该参数反映药物进入体内的速度，吸收速度快则达峰时间短。t_1/2是末端消除半衰期，指末端相血药浓度下降一半所需的时间。该参数直观反映了药物从体内的消除速度。

由表3可见：

(1)给药阿糖胞苷结构类似物P4后进入PBMC细胞内的阿糖胞苷结构类似物P4(表中BX20-1-004)的AUC，显著高于给药阿糖胞苷后进入PBMC细胞内的阿糖胞苷的AUC，说明阿糖胞苷结构类似物P4比阿糖胞苷有更好的细胞穿透性。

(2)给药阿糖胞苷结构类似物P4后血浆中阿糖胞苷的AUC，显著低于给药阿糖胞苷后血浆中阿糖胞苷的AUC，这意味着后续在血浆中生成无活性的尿嘧啶阿糖胞苷更少，阿糖胞苷结构类似物P4的生物利用度更高。

(3)给药阿糖胞苷结构类似物P4后，在PBMC细胞内的阿糖胞苷的药峰浓度(986ng/mL)，为给药阿糖胞苷后在PBMC细胞内的阿糖胞苷的药峰浓度(436ng/mL)的两倍多。说明阿糖胞苷结构类似物P4能够在细胞内转化成母药阿糖胞苷，显著提高体内靶标细胞的血药浓度，有更高的生物利用度。

(4)给药阿糖胞苷结构类似物P4后，在PBMC细胞内的阿糖胞苷的达峰时间(26.1h)，显著高于给药阿糖胞苷后在PBMC细胞内的阿糖胞苷的达峰时间(0.83h)。这意味着：阿糖胞苷结构类似物P4显著延长了阿糖胞苷在细胞内的时间。

(5)给药阿糖胞苷结构类似物P4后，在PBMC细胞内的阿糖胞苷的半衰期(25.5h)，显著高于给药阿糖胞苷后在PBMC细胞内的阿糖胞苷的达峰时间(1.02h)。这意味着：口服给药阿糖胞苷结构类似物P4有较长的半衰期，在PBMC细胞内的阿糖胞苷的稳定性好，能在较长时间维持有效血药浓度。

综上，本发明首次合成阿糖胞苷结构类似物P1～P4，均能抑制人白血病HL-60细胞，且在低浓度下抑制效果均优于盐酸阿糖胞苷，有望用作新型抗白血病药物。

尤其是，与阿糖胞苷相比，阿糖胞苷结构类似物P4对白血病细胞HL60增殖抑制能力更强，细胞穿透能力更强，进入细胞内的药物浓度和在细胞内产生的活性代谢产物三磷酸阿糖胞苷的浓度更高，有更高的生物利用度；能够在细胞内转化成母药阿糖胞苷，显著提高体内靶标细胞的血药浓度，可避免大剂量用药带来的毒副作用和耐药性；能够显著延长阿糖胞苷的半衰期，在较长时间维持有效血药浓度，可口服给药，可避免注射用药带来的不便。可见，阿糖胞苷结构类似物P4完全克服了阿糖胞苷极性大，透膜性差，在体内易被代谢失活、半衰期短等缺点，为口服给药提供了可能，填补了国内尚无此类新药上市的技术空白。

本发明的阿糖胞苷结构类似物的制备方法简单易操作，有望用于工业化生产。

最后应该说明的是，以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。上述虽然结合附图对本发明的具体实施方式进行了描述，但并非对本发明保护范围的限制，所属领域技术人员应该明白，在本发明的技术方案的基础上，本领域技术人员不需要付出创造性劳动即可做出的各种修改或变形仍在本发明的保护范围以内。