阅读说明：本技术 TIGIT-IgV的亲和剂及其应用 (Affinity agent of TIGIT-IgV and application thereof ) 是由 高艳锋 周秀曼 李琬琼 翟文杰 吴亚红 赵文珊 祁元明 于 2020-03-29 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种TIGIT-IgV的亲和剂及其应用,所述亲和剂选自SEQ ID NOs:1、3或4所示氨基酸,或亲和剂结构如式I或式II所示,X1-Tyr-X2-His-X3-Arg-X4-X5(I)X1-Tyr-X2-His-X3-Arg-X4-X5-(L)n-X6(II)。本发明独辟蹊径,通过反复筛选、优化得到的亲和剂,能较好地阻断TIGIT/PVR之间的相互作用,从而治疗肿瘤或其它类型疾病。(The invention relates to a affinity agent of TIGIT-IgV and application thereof, wherein the affinity agent is selected from amino acids shown in SEQ ID NOs:1, 3 or 4, or the structure of the affinity agent is shown in formula I or formula II, X1-Tyr-X2-His-X3-Arg-X4-X5(I) X1-Tyr-X2-His-X3-Arg-X4-X5- (L) n-X6 (II). The invention develops a new method, and the affinity agent obtained by repeated screening and optimization can better block the interaction between TIGIT/PVR, thereby treating tumors or other types of diseases.)

TIGIT-IgV的亲和剂及其应用

技术领域：

本发明属于生物制药技术领域，具体涉及一种TIGIT-IgV的亲和剂及其在肿瘤等相关疾病方面的应用等。

背景技术：

肿瘤免疫治疗，尤其是基于免疫检查点分子阻断的肿瘤免疫治疗是肿瘤治疗领域最具前景的研究方向。免疫检查点分子是指T细胞或NK细胞表达的一系列功能非冗余的负性共刺激分子，如PD-1，TIM-3，LAG-3和TIGIT等。免疫系统受到外界刺激而活化时，免疫检查点分子表达上调，并与抗原提呈细胞上的配体分子结合，发挥“刹车”的功能防止T细胞过度活化。免疫检查点分子过度表达或功能过强，会介导免疫耐受导致肿瘤等疾病的发生；反之，机体会处于持续的免疫激活状态导致免疫过度或自身免疫病。

目前，研究最为透彻的免疫检查点分子是PD-1，阻断其介导的PD-1/PD-L1负性信号通路能够打破免疫耐受，激活肿瘤微环境中的T细胞杀伤和清除肿瘤。PD-1/PD-L1抗体已经在黑色素瘤、非小细胞肺癌和霍金奇淋巴瘤等肿瘤类型的临床治疗中取得突破性进展。然而，PD-1/PD-L1抗体的低响应率及由于其他免疫检查点分子表达上调引起的适应性耐药，迫切需要找到新的治疗靶点并开发相应的药物。

TIGIT是主要表达于NK细胞、活化的T细胞和调节性T细胞的免疫检查点分子，与表达在肿瘤细胞或DC细胞上的配体分子PVR结合进而发挥抑制功能。TIGIT能直接抑制NK细胞的细胞毒作用、颗粒酶极化及细胞因子分泌，也能够抑制T细胞增殖及细胞因子分泌。阻断TIGIT以打破TIGIT/PVR介导的负性信号通路，能同时恢复荷瘤小鼠体内耗竭的NK细胞和T细胞的功能，并显著抑制肿瘤生长。抗体联合阻断TIGIT和PD-1、PD-L1能够能显著抑制荷瘤小鼠肿瘤生长(甚至消退)，也能够促进肿瘤病人CD8⁺TIL细胞增殖及细胞因子分泌。TIGIT已经成为免疫检查点分子中的新星，单独阻断TIGIT或与其他免疫检查点分子联合阻断或将成为免疫治疗的新趋势。此外，TIGIT在机体免疫系统中扮演着重要的角色，除上述广受关注的在肿瘤领域的应用，还在细菌和病毒感染(如：人类免疫缺陷病毒(HIV)慢性感染、人类T淋巴细胞白血病病毒Ⅰ型感染和淋巴细胞脉络丛脑膜炎病毒感染)，以及多种自身免疫病的免疫发病机制中发挥重要的调节功能。因此基于TIGIT/PVR通路的调控，寻找合理有效的治疗策略也是科学家们正在面临和亟待解决的问题。

TIGIT阻断剂的研究还处于早期阶段，而且多为抗体药物。抗体药物自身的一些特性如分子量较大难以浸润到肿瘤部位；抗体的Fc段容易引起免疫相关不良反应；半衰期太长，治疗过程中一旦出现副作用难以及时处理；抗体免疫原性较强，容易产生抗抗体导致耐药等限制了抗体药物充分发挥作用。多肽药物具有渗透性强、免疫原性弱、易于合成和改造的优点，已有研究报道针对免疫检查点的多肽可以用于诊断和体内示踪，也可以被设计成纳米颗粒用于药物递送、药物缓释等。

现有靶向免疫检查点分子的多肽药物多为天然的L构型，在体内容易被酶降解而难以发挥应有的效果。由于体内不存在降解D构型多肽的酶，D构型多肽药物更为稳定，更具有应用前景。

目前，靶向TIGIT的多肽药物，尤其是活性稳定的D构型多肽药物亟待开发，并应用于TIGIT相关的科学研究及疾病治疗。

发明内容

本发明独辟蹊径，通过反复筛选得到一种TIGIT-IgV的亲和剂，并经过实验证明了该亲和剂具有亲和TIGIT、同时阻断TIGIT/PVR蛋白结合的活性，可用于体内靶向、治疗肿瘤或其它类型疾病。

第一方面，本发明提供一种TIGIT-IgV的亲和剂，或其成药修饰形式，所述亲和剂选自SEQ ID NOs:1、3或4所示氨基酸，或亲和剂结构如式I或式II所示，

X1-Tyr-X2-His-X3-Arg-X4-X5 (I)

X1-Tyr-X2-His-X3-Arg-X4-X5-(L)n-X6 (II)

式I或式II中：

X1、X2、X3或X5独立选自0-2个氨基酸构成的肽段(为行文简洁，此处将<2个氨基酸的结构亦归为肽段)，

X4不存在或为亮氨酸，

(L)n表示柔性连接子，n为正整数，X6为1-12个氨基酸构成的肽段；

本专利所述亲和剂意指其能亲和TIGIT蛋白的IgV样结构域，并能阻断TIGIT/PVR蛋白相互结合，TIGIT蛋白与PVR配体可为野生型或仍保留其活性的突变型蛋白；所述成药修饰形式意指本领域人为成药，在保留活性的前提下，对前述亲和剂进行化学修饰以延长半衰期，比如环化修饰、乙酰化修饰、PAS修饰、PEG修饰、脂肪酸修饰、白蛋白修饰、白蛋白亲和肽偶联、肿瘤归巢肽偶联、穿膜肽偶联、纳米载体偶联。

任选地，所述X1不存在或选自Gly-Gly-、Ala-Gly-、Gly-Ala-或Gly-。

任选地，所述X2不存在或选自肽基Thr-Phe、Ala-Phe或Thr-Ala。

任选地，所述X3不存在或选自肽基Trp-His、Ala-His或Trp-Ala。

任选地，所述X5不存在或选自肽基Asn-Pro、Ala-Pro或Asn-Ala。

任选地，所述L为肽基-Ala-Ala-。

任选地，n＝1-6，优选n＝1。

任选地，所述X6为肽段-Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe。

任选地，所述亲和肽的序列选自SEQ ID NOs：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17或18(NOs在本领域表示序列号的并列列举，即氨基酸序列分别为SEQ IDNO.1、SEQ ID NO.2……)。

任选地，所述亲和肽的氨基酸的构型独立地选自D型或L型(不分构型的甘氨酸，本专利亦将其任意归入D型或L型，以使行文简洁)，可均为D型或L型，如氨基酸均为D构型。

另需注意的是，本专利的亲和剂，可以游离形式存在，也可以其药学上可接受的盐的形式存在，基于本专利思路的简单变形，均构成对本专利的等同侵权。

第二方面，本发明提供了含前述第一方面所述亲和剂或其成药修饰形式的药物组合物或试剂盒。

第三方面，本发明提供了前述第一方面所述亲和剂在制备药物(或含其的药物组合物)或诊断试剂盒中的应用。

第二方面或第三方面所述的药物组合物、第三方面所述药物，可用于下述至少一种用途：

1)抗肿瘤，如结肠癌、黑色素瘤或乳腺癌

2)治疗细菌、病毒或真菌引起的感染

3)治疗自身免疫性疾病

4)阻断TIGIT蛋白与PVR配体结合；所述TIGIT与PVR可为人源(hTIGIT)或小鼠源的野生型或仍保留其活性的突变型蛋白。

第二方面或第三方面所述的诊断试剂盒，可用于检测待测物对TIGIT蛋白的亲和或阻断能力，或者用于检测样品中TIGIT蛋白表达与否、表达位置或表达含量。

本发明所涉的多肽片段可通过固相合成制得，如采用Fmoc方案制备式I、X6、(L)n，再拼接得到式II。

本发明有益效果：

本发明独辟蹊径，通过反复筛选、优化获得了TIGIT-IgV亲和剂，亲和阻断活性实验证实，这些亲和剂均可阻断TIGIT/PVR的结合。进一步的体外亲和力实验和小鼠体内抗肿瘤实验验证，高阻断率肽可显著抑制小鼠CT26结肠癌和B16-OVA黑色素瘤的生长，抑制小鼠4T1乳腺癌肿瘤的生长以及肿瘤的肺转移，且无明显毒副作用。

附图说明：

图1为本发明的母体肽阻断TIGIT/PVR蛋白结合的实验结果图；

图2为本发明的亲和肽衍生物阻断TIGIT/PVR蛋白结合的实验结果图；

图3为本发明的丙氨酸扫描肽阻断TIGIT/PVR蛋白结合的实验结果图；

图4为本发明的截短肽阻断TIGIT/PVR蛋白结合的实验结果图；

图5为本发明实验7生物信息分析结果；

图6为本发明的示范肽对接种CT26的BALB/c小鼠体重变化影响结果图；

图7为本发明的示范肽对接种CT26的BALB/c小鼠移植瘤体积变化的影响；

图8为本发明的示范肽对接种B16-OVA的C56BL/6小鼠体重变化影响结果图；

图9为本发明的示范肽对接种B16-OVA的C56BL/6小鼠移植瘤体积变化的影响；

图10为本发明的示范肽对接种4T1的BALB/c小鼠体重变化影响结果图；

图11为本发明的示范肽对接种4T1的BALB/c小鼠移植瘤体积变化的影响；

图12为本发明的示范肽对接种4T1的BALB/c小鼠的肺部转移灶数目变化的影响；图13为本发明的示范肽的组织浸润实验结果图；

各图中涉及的显著性分析标识*表示P<0.05，**<0.01。

具体实施方式

：

下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是下列实施例仅用于说明本发明，而不应该为限制本发明的范围。

如无特别说明，下面所用试剂、生物材料、培养基和溶液均为本领域常用、公众可以得到或市售的物品。

1.噬菌体镜像展示肽库液相筛选得到TIGIT-IgV的亲和肽TBP-1等母体肽，大体筛选过程如下：

a)全化学合成D-TIGIT-IgV-biotin，并采用链霉亲和素(SA)磁珠捕获该D构型蛋白，采用差向液相筛选法进行噬菌体展示十二肽库的筛选工作；

b)经过多轮的筛选后，与靶蛋白D-TIGIT-IgV有亲和力的噬菌体单克隆逐轮得到富集；

c)从中挑选阳性克隆进行测序，共得到多个插入十二肽序列，根据测序结果确定多个富集的噬菌体克隆，其展示的多肽都能与TIGIT-IgV结合，得到的母体肽命名为TBP-1、TBP-3、TBP-5、TBP-17(序列依次如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4所示，各氨基酸构型均合成为D型)。

2.表面等离子共振(SPR)检测多肽与人TIGIT亲和力，检测过程如下：

a)仪器的准备：使用Biacore T200仪器(GE Healthcare)在25℃下用含有0.05％表面活性剂P20的真空过滤和脱气的运行缓冲液(10mM Na2HPO4、2.7mM KCl，137mM NaCl，pH 7.4，GE Healthcare)进行SPR实验。

b)SA芯片的准备：将带有生物素标签的冻干蛋白hIgVTIGIT(TIT-H82E5，ACROBiosystems)以5.7μM的蛋白质浓度溶解，将所得的蛋白质水缓冲液稀释在10mM乙酸钠缓冲液(pH 4.5，GE Healthcare)中，并根据标准规程以1800的固定水平立即固定在Series S传感器SA芯片上。

c)样品测试：为了确认亲和力，在运行缓冲液中新鲜制备所选肽或hPVR胞外域的浓度梯度(2倍系列稀释)。使用运行缓冲液，使分析物流过传感器芯片，流速为30L/min，接触和解离时间为60秒。不含hIgVTIGIT蛋白的未处理通道用作空白对照，以避免非特异性结合。通过用30mL/min的10mM甘氨酸3.0再生20秒以完全去除残留的分析物，为下一个分析物准备传感器芯片表面。

结果显示TBP-1，TBP-3，TBP-5，TBP-17都能较好的与TIGIT蛋白亲和，K_d(μM)值依次为2.79±0.51、5.60±2.56、6.75±1.07、48.3±11.2。

3.阻断实验：

a)培养CHO-K1-hTIGIT细胞于含有10％FBS的RMPI 1640培养基中，待细胞长至对数期胰酶消化并收集细胞于1.5mL EP管中，每管细胞量均为3×10⁵，1mL PBS7.2洗两遍后，置于冰上备用；

b)多肽与CHO-K1-hTIGIT细胞共孵育：称取一定质量的多肽，PBS7.2溶解至1000μM，将50μL溶解的多肽重悬细胞，其中两管细胞用50μL PBS重悬，用作阴性和阳性对照，涡旋混合冰上共同孵育30min。

c)将10ng hPVR-Fc蛋白加入上述细胞混合物中，阴性对照管加入等体积的PBS，涡旋混合冰上共同孵育30min。

d)加入0.3μL的抗体(Human Fcγspecific PE)于上述所有细胞混合物中，涡旋混匀后冰上避光孵育30min。

f)洗抗体：1mL冰冷的PBS7.2洗一次，1800rpm离心5min后，加入200μL PBS7.2重悬，转入流式管中流式检测CHO-K1-hTIGIT细胞与hPVR-Fc蛋白结合情况。

阻断结果表明：本发明的母体肽(TBP-1，TBP-3，TBP-5，TBP-17)均能够不同程度的阻断hPVR蛋白与CHO-K1-hTIGIT细胞的结合，阻断率如图1所示。

4.亲和肽衍生物在不同浓度下的阻断率：

按照上述实验3所述，改在不同肽浓度下检测TBP-3衍生物的阻断率，结果如图2所示：

我们合成了衍生物，将TBP-3(Gly-Gly-Tyr-Thr-Phe-His-Trp-His-Arg-Leu-Asn-Pro)与肽Asn-Tyr-Ser-Lys-Pro-Thr-Asp-Arg-Gln-Tyr-His-Phe偶联(中间连接子为-Ala-Ala-)得到亲和肽TBP-3的衍生物，并检测其对TIGIT和PVR的阻断效率，结果显示TBP-3的衍生物同样具有阻断TIGIT/PVR相互作用的能力，结果如图2所示。

5.将肽TBP-3进行丙氨酸扫描，阻断实验研究其丙氨酸扫描肽阻断能力，具体实施方法与上述实验3所述基本相同。

将肽TBP-3的任意一个氨基酸替换为丙氨酸得到一系列单突变肽(氨基酸构型保持D型)，称为丙氨酸扫描肽，比如丙氨酸扫描肽A9序列为Gly-Gly-Tyr-Thr-Phe-His-Trp-His-Ala-Leu-Asn-Pro，丙氨酸扫描肽A1、A2、A4、A5、A7、A8、A11、A12序列依次如SEQ IDNO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.11、SEQ IDNO.12、SEQ ID NO.13所示，将TBP-3对hTIGIT的阻断率的数值作为100％，计算TBP-3的丙氨酸扫描肽A1、A2、A4、A5、A7、A8、A9、A11、A12相对该肽的相对阻断率，如图3所示：TBP-3的丙氨酸扫描肽A1、A2、A4、A5、A7、A8、A11、A12，在500μM浓度下均能较好地阻断TIGIT/PVR蛋白结合。

6.将肽TBP-3进行截短，阻断实验研究其截短肽阻断能力，具体实施方法与上述实验3所述基本相同。

选择性地将肽TBP-3从其N端或C端截去1至多个氨基酸后得到的一系列更短的肽(氨基酸构型保持D型)称为截短肽，截短肽P4序列为Gly-Gly-Tyr-Thr-Phe-His-Trp-His，截短肽P7序列为Thr-Phe-His-Trp-His-Arg-Leu-Asn-Pro，截短肽P1、P2、P3、P5、P6序列依次如SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.15、SEQ ID NO.16、SEQ ID NO.17、SEQ ID NO.18，将TBP-3对hTIGIT的阻断率的数值作为100％，计算各截短肽相对该肽的相对阻断率，结果如图4所示。

7.生物信息分析及验证

a)PEPstrMOD在线预测TBP-3肽的3D结构：打开PEPstrMOD网页，输入多肽序列，选择D构型氨基酸模块并提交，预测完成后多肽结构保存至邮箱。

b)Z-DOCK分子对接：将上述预测得到的TBP-3肽结构与hTIGIT(PDB ID:3UDW)进行分子对接，分子对接采用Z-DOCK在线对接，MOE软件分析对接结果，选择对接模式(综合键能、距离、互作位点进行考虑)。

c)分析对接模式：在MOE软件中分析TIGIT蛋白与TBP-3肽的相互作用，选择与上述丙氨酸扫描肽结果中关键氨基酸一致的结合模式，该结合模式显示TBP-3肽与TIGIT蛋白的互作位点为H6-N58，R9-E60，R9-D63，Y3-N70和L10-S80；

d)验证关键氨基酸：将TIGIT蛋白的氨基酸位点Q56，N58，E60，D63，N70，L73和S80分别突变成丙氨酸，将突变蛋白表达于细胞表面，合成生物素标记的TBP-3肽(TBP-3-biotin)，利用流式检测TBP-3-biotin与膜表达TIGIT蛋白及上述突变蛋白的细胞的亲和能力，并计算各组相对于TBP-3-biotin对TIGIT野生蛋白亲和力的相对亲和率。

相对亲和率如图5所示，结果显示TIGIT蛋白(图示为WT)的氨基酸位点N58，E60，D63，N70，和S80突变成丙氨酸，TBP-3-biotin肽与TIGIT蛋白的亲和力降低，而将预测结果以外的重要位点Q56和L73突变，对TBP-3-biotin肽与TIGIT蛋白的亲和力没有干扰，该结果验证了结合模式中TBP-3肽的关键氨基酸位点有Y3，H6，R9等。

8.亲和肽酶降解稳定性实验：

a)将肽TBP-3用PBS7.2溶解至100μM母液，将190μL的10％的人血清溶液与10μL上述TBP-3肽的母液迅速混匀，取出20μL混合液计时为0h，其余置于37℃培养箱进行酶解反应，并分别于之后的0.5h、1h、2h、4h、8h、16h、24h、48h取出20μL反应产物于1.5mL EP管中，用于各个时间点酶解情况检测；

b)向上述不同时间点取出的样品中用移液枪小心加入90μL的乙腈，立即震荡混合均匀后，放置于冰上10min后移液枪加入90μL0.5％的冰乙酸溶液以终止该酶解反应；

c)4℃预冷离心机，10000g离心20min后并收集上清于新的EP管中，用于后续RP-HPLC分析酶降解稳定性实验表明，亲和肽TBP-3在48h仍稳定存在，抗酶解能力显著。

9.在CT26结直肠癌移植瘤模型、B16-OVA黑色素移植瘤模型及4T1乳腺癌模型中探究TBP-3的抗肿瘤效果，具体实施方法如下：

a)荷瘤：收集生长状态良好的CT26结直肠癌细胞、B16-OVA黑色素瘤细胞和4T1乳腺癌细胞，分别荷瘤BALB/c小鼠(2×10⁵细胞/只)、C57BL/6小鼠(5×10⁵细胞/只)和BALB/c小鼠(1×10⁴细胞/只)。

b)对于CT26或B16-OVA荷瘤小鼠，荷瘤一周左右，待小鼠瘤体积约长至40-80mm³时，根据小鼠肿瘤大小进行S形分组，并每天腹腔给药，连续给药2周，给药期间隔天使用电子天平称量小鼠体重、数显游标卡尺测量小鼠肿瘤，按照公式V＝1/2×a(长)×b(宽)×c(高)计算并记录小鼠肿瘤体积变化；

c)对于4T1荷瘤小鼠，荷瘤12天后，根据小鼠肿瘤大小进行S形分组，并每天腹腔给药，连续给药2周，记录小鼠体重及肿瘤体积变化，荷瘤34天后，解剖荷瘤小鼠，观察并记录各组小鼠肺部转移灶数目。

三种移植瘤模型给药期间小鼠精神状态都较为良好，各实验结果如图6-12所示。

10.活体成像实验探究亲和肽TBP-3的组织浸润性，具体实施方法如下：

a)选择肿瘤大小均一的CT26荷瘤小鼠，尾静脉注射200μg Cy5.5荧光标记的亲和肽TBP-3-Cy5.5以及等摩尔量的荧光染料Cy5.5；

b)尾静脉注射0h和24h后利用小动物活体成像系统，检测荧光在小鼠体内的分布，并在24h后解剖荷瘤小鼠，取小鼠的肿瘤组织及脏器(心、肝、脾、肺、肾和脑)进行荧光检测；

结果显示，荧光标记的亲和肽TBP-3-Cy5.5主要分布于荷瘤小鼠肿瘤组织部位，说明其有较强肿瘤组织浸润能力而荧光染料主要分布于肾脏，荧光强度统计结果如图13所示。

尽管以用具体实施例来说明和描述了本发明，然而应意识到，在不背离本发明的精神和范围的情况下可以做出许多其他的更改和修改，因此，这意味着在所述权利要求中包括本发明范围的所有变化和修改均属于本发明保护范围。

序列表

<110> 郑州大学

<120> TIGIT-IgV的亲和剂及其应用

<160> 18

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Leu Thr Pro His Lys His His Lys His Leu His Ala

1 5 10

<210> 2

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Gly Gly Tyr Thr Phe His Trp His Arg Leu Asn Pro

1 5 10

<210> 3

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Gly Asn Leu Thr Leu His Met His Arg Ser Pro Ser

1 5 10

<210> 4

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Ser Ala Ile His Phe His His Pro Arg Trp Lys Pro

1 5 10

<210> 5

<211> 26

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Gly Gly Tyr Thr Phe His Trp His Arg Leu Asn Pro Ala Ala Asn Tyr

1 5 10 15

Ser Lys Pro Thr Asp Arg Gln Tyr His Phe

20 25

<210> 6

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ala Gly Tyr Thr Phe His Trp His Arg Leu Asn Pro

1 5 10

<210> 7

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Gly Ala Tyr Thr Phe His Trp His Arg Leu Asn Pro

1 5 10

<210> 8

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gly Gly Tyr Ala Phe His Trp His Arg Leu Asn Pro

1 5 10

<210> 9

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

Gly Gly Tyr Thr Ala His Trp His Arg Leu Asn Pro

1 5 10

<210> 10

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gly Gly Tyr Thr Phe His Ala His Arg Leu Asn Pro

1 5 10

<210> 11

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Gly Gly Tyr Thr Phe His Trp Ala Arg Leu Asn Pro

1 5 10

<210> 12

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Gly Gly Tyr Thr Phe His Trp His Arg Leu Ala Pro

1 5 10

<210> 13

<211> 12

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Gly Gly Tyr Thr Phe His Trp His Arg Leu Asn Ala

1 5 10

<210> 14

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gly Gly Tyr Thr Phe His Trp His Arg Leu Asn

1 5 10

<210> 15

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

Gly Gly Tyr Thr Phe His Trp His Arg Leu

1 5 10

<210> 16

<211> 9

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Gly Gly Tyr Thr Phe His Trp His Arg

1 5

<210> 17

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

Gly Tyr Thr Phe His Trp His Arg Leu Asn Pro

1 5 10

<210> 18

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Tyr Thr Phe His Trp His Arg Leu Asn Pro

1 5 10