阅读说明：本技术 一种具有改善老年认知功能障碍的牡蛎活性肽及其制备方法和应用 (Oyster active peptide capable of improving senile cognitive dysfunction and preparation method and application thereof ) 是由 朱国萍 章超桦 秦小明 曹文红 卢虹玉 郑惠娜 高加龙 林海生 曾少葵 于 2020-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明属于功能肽领域,涉及一种具有改善老年认知功能障碍牡蛎活性肽的制备方法,包括如下步骤：牡蛎经碱提酸沉提蛋白,用中性蛋白酶酶解后,经超滤膜超滤获得5-8kDa的超滤组分,即为所述牡蛎活性肽。本发明的所述牡蛎活性肽具有改善老年认知功能障碍的作用。(The invention belongs to the field of functional peptides, and relates to a preparation method of oyster active peptide capable of improving senile cognitive dysfunction, which comprises the following steps: the oyster is subjected to alkali extraction, acid precipitation and protein extraction, enzymolysis is carried out by neutral protease, and ultrafiltration is carried out by an ultrafiltration membrane to obtain an ultrafiltration component of 5-8kDa, namely the oyster active peptide. The oyster active peptide has the effect of improving senile cognitive dysfunction.)

一种具有改善老年认知功能障碍的牡蛎活性肽及其制备方法 和应用

技术领域

本发明属于功能肽领域，更具体地，涉及一种具有改善老年认知功能 障碍牡蛎活性肽制备方法。

背景技术

牡蛎肽是将肽分子生物技术运用于牡蛎加工过程，经酶解制成的。这 种制作方法形成的小分子低聚肽，保留了牡蛎富含的牛磺酸、锌等营养成 分，使富含小分子活性肽的牡蛎在人体摄入后比单一氨基酸或蛋白质吸收 更快，更容易被肌体吸收，在人体代谢方面有着更重要的生物活性。比普 通牡蛎制品有更高的生物效价、更重要的生理功能。

认知功能是人体信息采集、记忆、计算、表达、执行能力的综合表现， 是生活质量的重要组成部分。认知功能受损或下降属于痴呆的早期症状， 如果受损严重，日常生活和照料均会受到影响。我国已经进入老年型社会， 认知功能障碍对老年人的健康影响不容忽视。因此，对老年人认知功能障 碍的影响因素进行早期干预具有现实意义，也是老年医学的重要内容之一。

发明内容

本发明的目的是提供一种具有改善老年认知功能障碍牡蛎活性肽制备 方法。

为了实现上述目的，本发明提供一种牡蛎活性肽的制备方法，包括如 下步骤：牡蛎经碱提酸沉提蛋白，用中性蛋白酶酶解后，经超滤膜超滤获 得5-8kDa的超滤组分，即为所述牡蛎活性肽。

进一步地，所述制备方法包括如下步骤：

S1.牡蛎碱提酸沉提蛋白：

牡蛎肉均质匀浆后以1∶1-5(w/v)的比例加水，在冰浴中用高速分散机均 质1-8min，调节pH至10.0-14.0，低温搅拌反应后低温离心，取上清液， 调节pH至4.0-6.0，低温离心，取沉淀；

S2.酶解：

取步骤S1所得沉淀以1∶1-5(w/v)加超纯水，调节pH至6-8，加入中性 蛋白酶，40-60℃恒温振荡2-6h后高温灭酶活，冷却后离心，取上清液；

S3.超滤：

用8kDa超滤膜超滤步骤S2得到的牡蛎蛋白酶解上清液，透过超滤膜 的上清液再用5kDa超滤膜进行分离，被5kDa超滤膜截留的上清液为 5-8kDa超滤组分，即为所述牡蛎活性肽。

进一步地，步骤S1包括：

牡蛎肉均质匀浆后以1∶2-4(w/v)的比例加水，在冰浴中用高速分散机均 质3-6min，然后用0.08-0.12mol/L NaOH调节pH至11.5-12.5，0-4℃恒温 搅拌2-4h后0-4℃、8000-12000r/min离心10-30min，取上清液，用0.08-0.12 mol/L HCl调节pH至4.6-5.0，0-4℃、8000-12000r/min离心10-30min，取 沉淀。

进一步地，步骤S2包括：

取步骤S1所得沉淀以1∶2-4(w/v)加超纯水，用0.08-0.12mol/L NaOH 调节pH至6.8-7.2，以酶和底物质量比(E/S)1-5∶100加入中性蛋白酶， 40-60℃恒温振荡3-5h后95-100℃灭酶8-12min，冷却后10-30℃、 8000-12000r/min离心10-30min，取上清液。

本发明的第二方面提供由上述方法制得的牡蛎活性肽。

本发明通过斑马鱼实验验证了所述牡蛎活性肽对于改善老年认知功能 的作用。本发明的第三方面提供所述牡蛎肽在制备具有改善老年认知功能 障碍活性的食品或药品中的应用。

本发明的其它特征和优点将在随后

具体实施方式

部分予以详细说明。

附图说明

通过结合附图对本发明示例性实施方式进行更详细的描述，本发明的 上述以及其它目的、特征和优势将变得更加明显。

图1示出了牡蛎活性肽对斑马鱼进入食物放置区成功率的影响。

图2示出了牡蛎活性肽对斑马鱼潜伏期的影响。

图3示出了牡蛎活性肽对斑马鱼右臂游动路程的影响。

图4示出了牡蛎活性肽对斑马鱼右臂游动时间的影响。

图5示出了牡蛎活性肽对斑马鱼鱼脑BDNF含量的影响。

具体实施方式

下面将更详细地描述本发明的优选实施方式。虽然以下描述了本发明 的优选实施方式，然而应该理解，可以以各种形式实现本发明而不应被这 里阐述的实施方式所限制。

实施例1

本实施例用于说明本发明的牡蛎活性肽的制备。

牡蛎碱提酸沉提蛋白：

牡蛎肉均质匀浆后以1∶3(w/v)的比例加水(1份牡蛎肉加3份水)，在 冰浴中用高速分散机均质5min，然后用0.1mol/L NaOH调节pH至12.0，4℃ 恒温搅拌3h后4℃、10000r/min，离心20min，取上清液，用0.1mol/L HCl 调节pH至4.8，4℃、10000r/min，离心20min，取沉淀。

酶解：取提取所得的蛋白以1∶3(w/v)加超纯水(1份蛋白加3份水)， 用0.1mol/LNaOH调节PH至7.0，以酶和底物质量比2∶100加入中性蛋白 酶，50℃恒温振荡4h后100℃灭酶10min，冷却后20℃、10000r/min离 心20min，取上清液进行超滤。

超滤：

用8kDa超滤牡蛎蛋白酶解上清液，透过超滤膜的上清液再用5kDa 超滤膜进行分离，被5kDa超滤膜截留的上清液为5-8kDa超滤组分，即为 所述牡蛎活性肽。

测试例1

牡蛎活性肽对斑马鱼行为学的影响。

图1示出了牡蛎活性肽对斑马鱼进入食物放置区成功率的影响。图2 示出了牡蛎活性肽对斑马鱼进入食物放置区潜伏期的影响。图3示出了牡 蛎活性肽对斑马鱼在右臂游动路程的影响。图4示出了牡蛎活性肽对斑马 鱼在右臂游动时间的影响。其中，YF为青年鱼，YF+UF2为喂食牡蛎活性 肽的青年鱼；AF为老年鱼，AF+UF2为喂食牡蛎活性肽的老年鱼。

从图1-图4可以看出，老年鱼相对于青年鱼进入食物放置区的成功率 较低，而潜伏期更长。喂食牡蛎活性肽后，青年鱼和老年鱼四天的成功率 均大幅度提高，其中青年鱼在第二天成功率呈现显著性提高，老年鱼在第 四天成功率呈现显著性提高。喂食牡蛎活性肽后，青年鱼和老年鱼进入食 物放置区的潜伏时间在四天的测试过程中也有不同程度的降低，其中青年 鱼在第三天有显著性下降，而老年鱼则在第4天有显著性下降；右臂游动路程四天均有不同程度的提高，青年鱼在1-3天有显著性提高，老年鱼则在 四天均呈现显著性提高；老年鱼右臂游动时间1-3天均呈现性显著性提高， 而青年鱼模型组则在第2，3天有显著性提高。

测试例2

牡蛎活性肽对斑马鱼抗氧化活性的影响。

与青年鱼相比，老年鱼鱼脑中的SOD活性明显下降，喂食牡蛎活性肽 后SOD活性升高接近青年水平，而年龄对CAT活性影响不大，但喂食牡蛎 活性肽后，青年鱼及老年鱼的活性均显著升高。反映氧化损伤的MDA在老 年鱼身上大幅度升高，喂食牡蛎活性肽后显著下降。实验结果表明机体衰 老引起体内抗氧化酶活性下降，机体遭受严重的脂质过氧化损伤，牡蛎活 性肽可提高机体的抗氧化活性，缓解机体过氧化损伤。

表1牡蛎活性肽对斑马鱼鱼脑抗氧化活性的影响

注：#为老年鱼与青年鱼比较；*为喂食UF2后与未喂食UF2比较；*/#P＜0.05；**/##P＜0.01；***/###P＜0.001

测试例3

牡蛎活性肽对青年及老年斑马鱼鱼脑炎症因子的影响。

测定了3种促炎因子IL-1β，TNF-α及INF-r，其中老年鱼的IL-1β，TNF-α 均明显升高，喂食牡蛎活性肽后显著性下降；而年龄对INF-r的影响不大， 喂食牡蛎活性肽后有少量降低；测定了两种抗炎因子IL-10和IL-13，年龄 对它们影响不大，喂食牡蛎活性肽后有轻微提高，说明衰老机体脑部出现 慢性炎症，牡蛎活性肽的抗炎作用通过抑制促炎因子的活性而不是提高抗 炎因子的活性而产生。

表2牡蛎活性肽对斑马鱼炎症因子的影响

注：#为老年鱼与青年鱼比较；*为喂食UF2后与未喂食UF2比较；*/#P＜0.05；**/##P＜0.01；***/###P＜0.001

测试例4

牡蛎活性肽对斑马鱼鱼脑神经递质及神经营养因子含量的影响。

测定的三种神经递质中Ach及r-GABA在老年鱼身上出现显著性下降， 喂食牡蛎活性肽后显著升高，而DA的含量基本不受年龄影响，喂食牡蛎 活性肽对其影响也不大；而脑源性神经营养因子BDNF，老年鱼鱼脑中的 含量下降，喂食牡蛎活性肽后显著提高。图5示出了牡蛎活性肽对斑马鱼 鱼脑BDNF含量的影响。

表3牡蛎活性肽对斑马鱼鱼脑神经递质的影响

注：#为老年鱼与青年鱼比较；*为喂食UF2后与未喂食UF2比较；*/#P＜0.05；**/##P＜0.01；***/###P＜0.001

测试例5

牡蛎活性肽对斑马鱼大脑基因表达的影响。

和BDNF含量结果相一致，老年鱼BDNF的基因表达量出现显著性下 降，喂食牡蛎活性肽后BDNF的基因表达量显著升高。TrkB与p75是BDNF 的两个特异性受体，其中TrkB与BDNF结合后可激活细胞分化通路，而 p75与BDNF结合则激活细胞凋亡，老年鱼的TrkB受体显著下降，喂食牡 蛎活性肽后显著上升，说明衰老导致神经细胞的分化与再生能力下降，喂 食牡蛎活性肽有利于老年斑马鱼神经细胞的生长与分化；而年龄对p75的 基因表达量影响不大，喂食牡蛎活性肽后p75的基因表达量变化不大。GFAP 是星形胶质细胞标志性蛋白，星形胶质细胞在中枢神经系统中通过分泌神 经营养因子来支持和营养神经元，起神经保护作用，老年鱼GFAP的基因 表达量下降，说明衰老导致星形胶质细胞的活力下降，其分泌神经营养因 子含量下降，这与所测定的脑源性神经营养因子BDNF的含量及基因表达 量下降的结果相一致，喂食牡蛎活性肽后GFAP的基因表达量显著上升， 与所测定的BDNF的含量及基因表达量在喂食牡蛎活性肽后升高结果相一 致。PSD-95(后突触蛋白)和SYP(前突触蛋白)是突触蛋白标志性蛋白， 参与突触的形成和成熟，以及神经递质的释放，老年鱼中PSD-95和SYP 的表达下降意味着突触的丢失，说明衰老导致神经突触可塑性下降，喂食 牡蛎活性肽后PSD-95均显著升高，SYP有所提高但不呈显著性，显示牡蛎 活性肽可提高神经突触可塑性；与慢性炎症相关的CD11b基因及与衰老相 关的基因β-牛乳糖甘酶(SAβG)的表达量则在老年鱼身上出现显著性升高， 显示老年鱼出现严重的脑部慢性炎症，呈现显著的衰老，喂食牡蛎活性肽 可缓解老年鱼脑内的慢性炎症，并降低老年鱼的衰老程度。

表4牡蛎活性肽对斑马鱼大脑基因表达的影响

注：#为老年鱼与青年鱼比较；*为喂食UF2后与未喂食UF2比较

以上已经描述了本发明的各实施例，上述说明是示例性的，并非穷尽 性的，并且也不限于所披露的各实施例。在不偏离所说明的各实施例的范 围和精神的情况下，对于本技术领域的普通技术人员来说许多修改和变更 都是显而易见的。