阅读说明：本技术 一种标准品稀释液的简易制备方法 (Simple preparation method of standard product diluent ) 是由 黄振宇 于 2020-10-23 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种标准品稀释液的简易制备方法,包括以下步骤：步骤一：在成分明确的缓冲液中,加入不同浓度的生化试剂,浓度范围为0％-10％,浓度梯度为0.5％；步骤二：在各个浓度的标准品稀释液和若干待测样本中,加入等量高浓度的目标蛋白,加入目标蛋白的体积不超过整个体系的10％,并使加入目标蛋白的终浓度位于标曲范围的中段；步骤三：对加入目标蛋白后的标准品稀释液、加入目标蛋白后的待测样本以及不加目标蛋白的待测样本按常规ELISA实验方案操作；步骤四：绘制OD曲线：横坐标为不同浓度的标准品稀释液,纵坐标为OD值；本发明的标准品稀释液成分明确、制备方法相对简易,该配方的标准品稀释液不易长菌,具有突出性的进步。(The invention discloses a simple preparation method of a standard product diluent, which comprises the following steps: the method comprises the following steps: adding biochemical reagents with different concentrations into a buffer solution with definite components, wherein the concentration range is 0-10%, and the concentration gradient is 0.5%; step two: adding target protein with equal high concentration into standard product diluent and a plurality of samples to be detected, wherein the volume of the added target protein is not more than 10% of the whole system, and the final concentration of the added target protein is positioned in the middle section of the standard curve range; step three: performing conventional ELISA experimental scheme operation on the standard substance diluent added with the target protein, the sample to be detected added with the target protein and the sample to be detected without the target protein; step four: drawing an OD curve: the abscissa is standard dilution liquid with different concentrations, and the ordinate is OD value; the standard product diluent has definite components and relatively simple preparation method, and the standard product diluent of the formula is not easy to grow bacteria and has outstanding progress.)

一种标准品稀释液的简易制备方法

技术领域

本发明涉及可溶性目标蛋白准确定量技术领域，尤其涉及一种标准品稀释液的简易制备方法。

背景技术

ELISA(enzyme linked immunosorbent assay，酶联免疫吸附测定)是经典的免疫学实验，具有灵敏度高、特异性强、重复性好的特点。

其中评估ELISA准确度的性能参数是回收率，即目的蛋白计算值与理论值的比值，表明计算值与真实值的差异，优秀的试剂盒，回收率应在80–120％；理论上，标准品稀释液除了不含有目的蛋白，应与检测样本的基质一致，但实际上难以实现，更难以进行量产；取而代之的方法是获得等效的标准品稀释液，当前常用的组分是动物血清，可较好地模拟血清样本体系；然而动物血清也存在诸多不足，例如由于动物个体差异造成血清的批间差异较大、血清浓度较高时容易堵塞滤膜难以过滤、血清中蛋白含量丰富容易长菌等等，此外由于血清成分复杂，有很多未知的蛋白，出现问题时，难以判断影响因素，给生产研究带来了较大的困扰。

综上所述，需要一种标准品稀释液的简易制备方法解决现有技术中所存在的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种标准品稀释液的简易制备方法，旨在解决上述问题。

为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种标准品稀释液的简易制备方法，包括以下步骤：

步骤一：在成分明确的缓冲液中，加入不同浓度的生化试剂，浓度范围为0％-10％，浓度梯度为0.5％；

步骤二：在各个浓度的标准品稀释液和若干待测样本中，加入等量高浓度的目标蛋白，加入目标蛋白的体积不超过整个体系的10％，并使加入目标蛋白的终浓度位于标曲范围的中段；

步骤三：对加入目标蛋白后的标准品稀释液、加入目标蛋白后的待测样本以及不加目标蛋白的待测样本按常规ELISA实验方案操作；

步骤四：绘制OD曲线：横坐标为不同浓度的标准品稀释液，纵坐标为OD值；

步骤五：确定与待测样本OD值平均值相交的标准品稀释液，即目标蛋白在待测样本和该交点所代表的标准品稀释液体系中，与抗体结合的效果接近；

步骤六：选择上述步骤所筛选到的标准品稀释液，及其相邻的两个浓度的标准品稀释液，作为候选标准品稀释液，取若干正常样本，选择标准曲线范围的高中低3个浓度进行加标回收实验，确认回收率是否有偏差，再继续调整浓度，直至符合为止。

进一步的，所述步骤二中若干待测样本采用健康人、小鼠或大鼠血清中的一种。

进一步的，所述确认回收率范围在80–120％。

进一步的，所述待测样本OD值平均值为加入目标蛋白后的待测样本OD值减去不加目标蛋白的待测样本OD值。

进一步的，所述步骤六中的3个浓度为加入目标蛋白后的终浓度，对应标准曲线范围中的第2、第4和第6个点的浓度。

本发明的有益效果：本发明的标准品稀释液成分明确、制备方法相对简易，通过用高纯度、成分明确的生化试剂替代血清，保证批次间的稳定性，生化试剂在较低浓度时，也能与血清的效果相当，此外，该配方的标准品稀释液方便配制、除杂、无菌过滤，而且由于蛋白含量低，不易长菌，具有突出性的进步。

附图说明

图1为以不同浓度碘化钠作为标准品稀释液的OD曲线图。

图2为以含不同浓度焦磷酸钠的2％明胶作为标准品稀释液的OD曲线图。

图3为以不同浓度BSA作为标准品稀释液的OD曲线图。

具体实施方式

如图1、2、3所述，一种标准品稀释液的简易制备方法，包括以下步骤：

步骤一：在成分明确的缓冲液(如PBS、PBST、Tris)中，加入不同浓度的生化试剂，浓度范围为0％-10％，浓度梯度为0.5％；亦或选择含高纯度蛋白(如BSA、明胶)的缓冲液，其中蛋白的浓度范围为0％-40％，浓度梯度为5％(如BSA)，或浓度范围为0％-10％，浓度梯度为0.5％(如明胶)，加入不同浓度的生化试剂，浓度范围为0％-10％，浓度梯度为0.5％。

步骤二：在各个浓度的标准品稀释液和若干待测样本中，加入等量高浓度的目标蛋白，加入目标蛋白的体积不超过整个体系的10％，并使加入目标蛋白的终浓度位于标曲范围的中段；

步骤三：对加入目标蛋白后的标准品稀释液、加入目标蛋白后的待测样本以及不加目标蛋白的待测样本按常规ELISA实验方案操作；

步骤四：绘制OD曲线：横坐标为不同浓度的标准品稀释液，纵坐标为OD值；

步骤五：确定与待测样本OD值平均值相交的标准品稀释液，即目标蛋白在待测样本和该交点所代表的标准品稀释液体系中，与抗体结合的效果接近；

步骤六：选择上述步骤所筛选到的标准品稀释液，及其相邻的两个浓度的标准品稀释液，作为候选标准品稀释液，取若干正常样本，选择标准曲线范围的高中低3个浓度进行加标回收实验，确认回收率是否有偏差，再继续调整浓度，直至符合为止。

进一步的，步骤二中若干待测样本采用健康人、小鼠或大鼠血清中的一种。

进一步的，确认回收率范围在80–120％。

进一步的，待测样本OD值平均值为加入目标蛋白后的待测样本OD值减去不加目标蛋白的待测样本OD值。

进一步的，步骤六中的3个浓度为加入目标蛋白后的终浓度，对应标准曲线范围中的第2、第4和第6个点的浓度。

实施例1：

人IL-6ELISA试剂盒标准品稀释液的筛选，包括以下步骤：

步骤一：在1×PBST中加入不同浓度梯度的生化试剂(碘化钠)，浓度梯度为0.5％，浓度分数分别为0％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％和5％；

步骤二：取每种标准品稀释液各120μl，加入5μl浓度为312.5pg/ml的重组人IL-6蛋白，使之终浓度为12.5pg/ml；取8份正常人血清各57.5μl，加入5μl浓度为312.5pg/ml的重组人IL-6蛋白，使之终浓度为25pg/ml；

步骤三：将加入目标蛋白的正常人血清以及未加入目标蛋白的正常人血清用等体积检测缓冲液稀释2倍；在预包被的人IL-6酶标板中，每孔加入100μl加标后的标准品稀释液以及稀释的待测样本；每孔加入50μl生物素标记的抗人IL-6抗体，封膜，放置于微孔板振荡器，在室温下以300转/分钟震荡孵育2小时；然后用洗液洗涤6次，每孔加入100μlStreptavdin-HRP，孵育45分钟，洗涤6次后，每孔加入100μl TMB，显色10分钟，加入终止液终止反应；于酶标仪中进行双波长检测，主波长为450nm，参考波长为570nm或630nm；

步骤四：根据读取结果，绘制OD曲线；

步骤五：由步骤四绘制的OD曲线图可知，8份正常人血清样本加入标准品后的平均OD值与含1％碘化钠的缓冲液相交；

步骤六：以含0.5％、1％和1.5％碘化钠的缓冲液作为候选标准品稀释液，取10份正常人血清样本做3个浓度的加标回收率，结果显示，在以含1％碘化钠的缓冲液作为标准品稀释液的条件下，回收率范围93–110％，平均回收率102％。

进一步的，正常人血清中，IL-6含量通常在7pg/ml以下或不可测，含量较高的样本的数据应予以剔除。

实施例2：

小鼠TNF-αELISA试剂盒标准品稀释液的筛选，包括以下步骤：

步骤一：在2％明胶中加入不同浓度梯度的生化试剂(焦磷酸钠)，浓度梯度为0.5％，浓度分数分别为0％、0.5％、1％、1.5％、2％、2.5％、3％、3.5％、4％、4.5％和5％；

步骤二：取每种标准品稀释液各120μl，加入0.75μl浓度为40,000pg/ml的重组小鼠TNF-α蛋白，使之终浓度为250pg/ml。取8份正常小鼠血清各15μl，加入1μl浓度为40,000pg/ml的重组小鼠TNF-α蛋白，使之终浓度为2500pg/ml；

步骤三：将加入目标蛋白的正常小鼠血清以及未加入目标蛋白的正常小鼠血清用检测缓冲液稀释10倍。在预包被的小鼠TNF-α酶标板中，每孔加入100μl加标后的标准品稀释液以及稀释的待测样本；每孔加入50μl生物素标记的抗小鼠TNF-α抗体，封膜，放置于微孔板振荡器，在室温下以300转/分钟震荡孵育2小时；然后用洗液洗涤6次，每孔加入100μlStreptavdin-HRP，孵育45分钟，洗涤6次后，每孔加入100μl TMB，显色10分钟，加入终止液终止反应；于酶标仪中进行双波长检测，主波长为450nm，参考波长为570nm或630nm；

步骤四：根据读取结果，绘制OD曲线；

步骤五：由步骤四绘制的OD曲线图可知，8份正常小鼠血清样本加入标准品后的平均OD值与含1％焦磷酸钠的缓冲液相交；

步骤六：以含0.5％、1％和1.5％焦磷酸钠的缓冲液作为候选标准品稀释液，取10份正常小鼠血清样本做3个浓度的加标回收率，结果显示，在以含1％焦磷酸钠的缓冲液作为标准品稀释液的条件下，回收率范围88–107％，平均回收率99％。

进一步的，正常小鼠血清中，TNF-α的含量通常较低或不可测，含量较高的样本的数据应予以剔除。

实施例3：

人高敏IFN-γELISA试剂盒标准品稀释液的筛选，包括以下步骤：

步骤一：在1×PBST中加入不同浓度梯度的牛血清白蛋白(BSA)，浓度梯度为5％，浓度分数分别为0％、5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％和40％；

步骤二：取每种标准品稀释液各120μl，加入0.6μl浓度为2,000pg/ml的重组人IFN-γ蛋白，使之终浓度为10pg/ml。取8份健康人血清各25μl，加入0.625μl浓度为2,000pg/ml的重组人IFN-γ蛋白，使之终浓度为50pg/ml；

步骤三：将加入目标蛋白的健康人血清以及未加入目标蛋白的健康人血清用检测缓冲液稀释5倍。在预包被的人高敏IFN-γ酶标板中，每孔加入100μl加标后的标准品稀释液以及稀释的待测样本，封膜，放置于微孔板振荡器，在室温下以300转/分钟震荡孵育30分钟；洗液洗涤6次，每孔加入100μl生物素标记的抗人IFN-γ抗体，封膜，放置于微孔板振荡器，在室温下以300转/分钟震荡孵育30分钟；洗液洗涤6次，每孔加入100μl Streptavdin-HRP，孵育15分钟；洗涤后，每孔加入100μl信号增强剂，孵育15分钟，洗液洗涤6次，每孔加入100μl Streptavdin-HRP，孵育15分钟，洗涤后，每孔加入100μl TMB，显色10分钟，加入终止液终止反应；于酶标仪中进行双波长检测，主波长为450nm，参考波长为570nm或630nm；

步骤四：根据读取结果，绘制OD曲线；

步骤五：由步骤四绘制的OD曲线图可知，8份健康人血清样本加入标准品后的平均OD值与含30％BSA的缓冲液相交；

步骤六：以含25％、30％和35％BSA的缓冲液作为候选标准品稀释液，取10份健康人血清样本做3个浓度的加标回收率，结果显示，在以含30％BSA的缓冲液作为标准品稀释液的条件下，回收率范围85–94％，平均回收率89％。

进一步的，健康人血清中，IFN-γ的含量通常较低或不可测，含量较高的样本的数据应予以剔除。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换或改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。