阅读说明：本技术 全血型冻干粉免疫抑制剂质量控制物质及其制备方法和应用 (Quality control substance of whole blood type freeze-dried powder immunosuppressant and preparation method and application thereof ) 是由 邹继华 沈敏 古咏梅 杨晓东 屠敏敏 邹炳德 于 2019-10-30 设计创作，主要内容包括：一种全血型冻干粉免疫抑制剂质量控制物质及其制备方法和应用,该物质主要是以人全血为基质,和免疫抑制剂制成的冻干品。所述的免疫抑制剂包括他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A中的一种或者多种,或者还包括糖皮质激素类免疫抑制剂：氢化可的松、可的松、泼尼松龙、泼尼松、霉酚酸酯经血检测的免疫抑制剂中的一种或者多种。具有均匀性、稳定性良好,不需-70℃低温保存,可用于不同方法学免疫抑制剂试剂盒的校准品,也可作为质控品用于临床监测免疫抑制剂检测系统的优点。(A quality control substance of whole blood type lyophilized powder immunosuppressant is prepared from human whole blood as matrix and lyophilized product of immunosuppressant. The immunosuppressant comprises one or more of tacrolimus, sirolimus, everolimus and cyclosporine A, or further comprises a glucocorticoid immunosuppressant: one or more of hydrocortisone, cortisone, prednisolone, prednisone, mycophenolate mofetil, and immunosuppressant for blood test. Has the advantages of good uniformity and stability, no need of low-temperature storage at-70 ℃, and can be used as a calibrator of immunosuppressant kits of different methodologies and also can be used as a quality control product for a clinical monitoring immunosuppressant detection system.)

全血型冻干粉免疫抑制剂质量控制物质及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及医学检验技术领域，具体涉及一种全血型冻干粉免疫抑制剂质量控制物质及其制备方法和应用。

背景技术

免疫抑制剂对机体免疫反应具有抑制作用，能抑制机体中T细胞、B细胞等巨噬细胞的增殖和功能，降低抗体免疫反应，在器官移植排斥反应的预防和治疗中有极其重要的作用，还可用于治疗自身免疫性疾病和***反应性疾病等。该类药物具有较强的肾毒性，治疗窗窄、药动学个体差异较大，临床上需对病人进行治疗药物监测(therapeutic drugmonitoring,TDM)以确保免疫抑制剂的使用处于安全有效的治疗范围，且不易中毒。

目前临床应用的免疫抑制剂可划分为5大类：①细胞因子抑制剂，如环孢素A(CsA)、他克莫司(FK506等)；②DNA合成抑制剂，如霉酚酸酯(MMF)、硫唑嘌呤(Aza)等；③肾上腺皮质激素类，如***，甲基***等；④抗淋巴细胞抗体，如抗淋巴细胞球蛋白(ALG)、抗胸腺球蛋白(ATG)等；⑤其他免疫抑制剂，如FTY720、环磷酰胺等。其中环孢素A(CsA)、他克莫司(TAC、FK506)、西罗莫司(SIR)、依维莫司(EVR)等在临床实体器官移植中应用广泛。CsA为亲脂性环多肽，TAC为大环内酰胺类免疫抑制剂，二者均属钙调蛋白磷酸酶抑制剂，作用于T淋巴细胞；SIR是从吸水链霉菌分离出来的大环内酯，EVR为SIR40-O-(2-羟乙基)衍生物，二者均与哺乳动物的雷帕霉素(mTOR)复合物靶点结合，抑制T细胞激活的通路。由于治疗窗窄、个体内及个体间差异大，临床上要求这几种免疫抑制剂进行治疗药物监测(TDM)，这样可获得更为完整的治疗用药信息，便于调整个体给药方案。

免疫抑制剂治疗药物监测常用的分析方法有：分光光度法、液相色谱串联质谱法(LC-MS/MS)、气相色谱串联质谱法(GC-MS/MS)、免疫法(放射免疫法、均相酶免疫法、荧光偏振免疫法、微粒子酶免疫法、化学发光免疫法)、毛细管电泳法、原子吸收法等。临床上常用的监测方法是色谱法和免疫分析法，与LC-MS/MS法相比，免疫法具有分析周期短，自动化程度高，操作简单，适用于急诊和大量样本测定等特点，但因SIR和EVR结构类似，采用免疫法检测时会互相干扰；有报道称免疫法检测TAC和CsA时会高估约30％。LC-MS/MS法检测免疫抑制剂具有更高的特异性和准确性，更能精准指导临床用药。

在人体内CsA、TAC、SIR、EVR广泛存在于红细胞中，药物在红细胞和血浆间的分配比超过30:1，常采用EDTA抗凝全血作为临床检测样本。免疫抑制剂的准确测量需要一个稳定质量控制物质来校准、监控仪器状态和试剂的好坏，但是，目前国内尚无免疫抑制剂质量控制物质制备方法的专利相关报道信息。

在国内美康生物申请的“一种用于准确测定人全血中四种免疫抑制剂类药物浓度的质谱试剂盒及液相色谱串联质谱检测方法”专利中有包含质控品1、2，但该专利未涉及到质控品的制备方法信息。

在临床检测免疫抑制剂(CsA、TAC、SIR、EVR等，不限于此4种，也包括糖皮质激素类免疫抑制剂如氢化可的松、可的松、***龙、***、霉酚酸酯等)，由于检测样本为EDTA抗凝全血，如果质量控制物质的基质与待测样本相同或相似，就可以更好的监测实验方法的准确性和稳定性。虽然可以直接使用人全血作为质量控制物质用于免疫抑制剂的临床监测，但由于全血为液体，临床实验室缺少超低温保存装置，导致其不宜长久保存。

发明内容

本发明针对现有技术的上述不足，提供一种均匀性、稳定性良好，不需-70℃低温保存，可用于不同方法学免疫抑制剂(CsA、TAC、SIR、EVR等)试剂盒的校准品，也可作为质控品用于临床监测免疫抑制剂(CsA、TAC、SIR、EVR等)检测系统的准确性和稳定性高的全血冻干粉免疫抑制剂质量控制物质。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：一种全血冻干粉免疫抑制剂质量控制物质，该物质主要以人全血为基质，和免疫抑制剂制成的冻干品。

优选的，本发明所述的免疫抑制剂包括他克莫司、西罗莫司、依维莫司和环孢素A中的一种或者多种，但并不局限于此4种物质，也可包括糖皮质激素类免疫抑制剂如氢化可的松、可的松、***龙、***、霉酚酸酯等经血检测的免疫抑制剂中的一种或者多种的混合；凡是在全血中可以进行检测的免疫抑制剂均可按此种方法制备，也均落入本专利范围之内。

进一步优选的，所述的全血冻干粉免疫抑制剂质量控制物质，如用于监测检测系统的准确性和稳定性，一般包括低浓度质控品或高浓度质控品，所述的低浓度质控品中他克莫司的浓度范围控制在0～20ng/mL，西罗莫司、依维莫司的浓度范围控制在0～15ng/mL，环孢素A的浓度范围控制在0～300ng/mL；高浓度质控品中他克莫司的浓度范围控制在21～50ng/mL，西罗莫司、依维莫司的浓度范围控制在16～50ng/mL，环孢素A的浓度范围控制在301～1200ng/mL；低浓度、高浓度的免疫抑制剂质量控制物质制备浓度可根据临床实际需要进行调整。

进一步优选的，所述的全血冻干粉免疫抑制剂质量控制物质，如用于免疫抑制剂检测系统的校准品时，则可根据不同方法学的要求制备不同浓度水平，如2～10个均可(即并仅仅是上述的低浓度和高浓度，还可以有三种以上的多种浓度类型)，数量并不局限在此范围内，具体范围根据不同方法学的要求进行制备。

进一步的，本发明还提供上述全血冻干粉免疫抑制剂质量控制物质的制备方法，具体的制备步骤包括：

(1)搜集临床新鲜无黄疸、乳糜、溶血的EDTA-K₂或肝素抗凝全血，取少量上层血浆进行传染病筛查(HIV、乙肝、梅毒、丙肝)，选择结果为阴性的全血样本进行血型检测，将相同血型的全血混合在一起备用；以相同血型的混合全血作为制备免疫抑制剂质量控制物质的基质；如不对全血样本进行血型检测，则在将不同人份全血混合在一起后，需向其中再加入抗凝剂；

(2)将步骤(1)获得的全血混匀，加入分散剂、增溶剂，搅拌至完全溶解；

(3)对步骤(2)全血基质进行免疫抑制剂浓度测量；根据质量控制物质对免疫抑制剂的浓度要求，添加适量的免疫抑制剂的标准储备溶液；在加入全血之前，免疫抑制剂的标准储备溶液需先经氮气吹干，搅拌1～6h使添加的免疫抑制剂完全溶解；

(4)向步骤(3)中的全血中加入保护剂、赋形剂、防腐剂，搅拌至完全溶解；

(5)将步骤(4)中的全血根据规格要求进行分装，进行冷冻干燥制备成冻干粉。

使用时，将冻干粉复溶即可。

优选的，本发明上述步骤(1)中的抗凝剂可以是EDTA-K₂、肝素等，浓度范围为0～20mmol/L(最终在全血中的浓度)。

优选的，本发明上述步骤(2)中的分散剂可以是表面活性剂，如PVP40、PVP360、PEG、吐温20-80等，以保证全血中有形成分分散均匀，浓度范围为0～40％(质量百分含量)；增溶剂可以是多元液体醇类，如乙二醇、叔丁醇等，可用于促进添加的免疫抑制剂在全血基质中溶解，浓度范围为0～5％(质量百分含量)。

优选的，本发明上述步骤(3)中的免疫抑制剂可以是环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司中的一种或者多种，但并不局限于此4种物质，也可包括糖皮质激素类免疫抑制剂如氢化可的松、可的松、***龙、***、霉酚酸酯等经血检测的免疫抑制剂中的一种或者多种的混合；凡是在全血中可以进行检测的免疫抑制剂均可按此种方法制备，也均落入本专利范围之内。

进一步优选的，本发明上述步骤(3)中的环孢素A溶解度较低，采用逐滴加入环孢素A标准储备溶液的方式加入全血中，搅拌1～6h使添加的免疫抑制剂完全溶解。

优选的，本发明步骤(4)所述的保护剂包括但不限于抗氧化保护剂、稳定剂等；抗氧化保护剂可以是具有还原性的物质，如抗坏血酸及其盐、亚硫酸钠、焦亚硫酸钠、半胱氨酸、谷胱甘肽等中的一种或多种组合，浓度范围为0～10％(质量百分比浓度)；稳定剂主要是蛋白质、糖类、多元醇或氨基酸类物质，可以是牛血清白蛋白(BSA)、人血清白蛋白(HSA)、海藻糖、葡萄糖、蔗糖等中的一种或多种组合，浓度范围为0～10％。

优选的，本发明步骤(4)所述的防腐剂为脱氢乙酸及其盐类、丙酸钙、乳酸钠、苯甲酸及其盐类、叠氮钠、山梨酸及其盐类等中的一种或多种组合。

优选的，本发明步骤(4)所述的赋形剂包括但不限于多元醇类(如甘露醇、肌醇等)、糖类(如葡萄糖、乳糖等)、氨基酸类(如半胱氨酸)、蛋白质类(BSA、HSA等)等中的一种或多种组合，浓度范围为0～10％。赋形剂有时也可以起到稳定剂的作用。

优选的，本发明所述的质量控制物质包括低浓度质控品和/或高浓度质控品；所述的低浓度质控品中他克莫司的浓度范围可控制在0～20ng/mL，西罗莫司、依维莫司的浓度范围可控制在0～15ng/mL，环孢素A的浓度范围可控制在0～300ng/mL；所述的高浓度质控品中他克莫司的浓度范围可控制在21～50ng/mL，西罗莫司、依维莫司的浓度范围可控制在16～50ng/mL，环孢素A的浓度范围可控制在301～1200ng/mL。

低浓度、高浓度的免疫抑制剂质控品并没有明确的浓度界限区分，制备浓度可根据临床实际需要进行调整。

优选的，本发明所述的质量控制物质还包括不同浓度水平的免疫抑制剂校准品，浓度水平和具体范围可根据不同方法学的要求进行制备。

本发明上述的各种物质的浓度均为其添加到相应物质中之后，在获得的物质中的浓度。本发明中各种物质的浓度范围，不做单位限定和特殊说明，均理解为质量百分含量。

本发明可得到全血冻干粉免疫抑制剂质量控制物质，可适用于不同方法学免疫抑制剂试剂盒的校准品，也可用于监测临床不同方法学免疫试剂检测系统的准确性和稳定性的质控品。

本发明步骤(5)的冷冻干燥的条件为：在-45℃～-55℃先预冻2～8小时，缓慢升温至-40℃后稳定1～3小时，再降温至-55℃稳定2～4小时，使其冰冻完全；冷冻干燥阶段采用1～3℃的升温速率，逐渐升温，升至某温度平衡后，稳定0.5～3小时，再逐渐升温直至-35℃后持续12～25小时，解析干燥阶段的升温速率采用2～5℃每小时，最高温度不能超过15℃，升温至15℃后，稳定4～15小时。

本发明的优点和有益效果：

1.本发明首次以全血作为基质，与免疫抑制剂进行结合，制备成冻干粉形式的全血冻干粉免疫抑制剂质量控制物质；这种质量控制物质均匀性、稳定性良好，不需-70℃低温保存，可用于免疫抑制剂(CsA、TAC、SIR、EVR等)试剂盒的校准品，也可作为质控品用于临床监测免疫抑制剂(CsA、TAC、SIR、EVR等)检测系统的准确性和稳定性的全血冻干粉免疫抑制剂质量控制物质。

2.本发明提供了一种完整的全血冻干粉免疫抑制剂质量控制物质的制备方法，该方法通过分析：在临床检测免疫抑制剂(CsA、TAC、SIR、EVR等)，由于检测样本为EDTA(乙二胺四乙酸)抗凝全血，如果质量控制物质的基质与待测样本相同或相似，就可以更好的监测实验方法的准确性和稳定性，虽然可以直接使用人全血作为质量控制物质用于免疫抑制剂的临床监测，但由于全血为液体，临床实验室缺少超低温保存装置，导致其不宜长久保存；从而为了克服上述不足，提供了一种首次以全血作为基质，与免疫抑制剂进行结合制备成冻干粉性质的产品，克服了新鲜全血和或冷冻全血免疫抑制剂质量控制物质不稳定，不易长时间保存的缺点；本发明制备的免疫抑制剂质量控制物质在37℃加速考察7天后与靶值相比偏倚在±15％以内，表明本发明该质量控制物质质量稳定并可存放较长时间(2～8℃可存放1年)。

3.本发明的技术方案与现有技术相比，现有技术并不涉及具体的制备方法，且现有技术中提到的质控品Ⅰ、Ⅱ侧重于包含质控品实物；本专利中侧重于如何得到免疫抑制剂质量控制物质实物的制备方法，二者侧重点不同；且现有技术的试剂盒中的“质控品Ⅰ”、“质控品Ⅱ”浓度范围是从临床免疫抑制剂参考区间考虑设置的一个范围，仅两个浓度水平；本专利中“免疫抑制剂质量控制物质”如果用作质控品时，浓度范围可以根据临床参考区间进行设置，因参考区间固定，所以质控品设定范围二者有重叠，因临床一般用参考区间内和异常值，一般制备两个水平，但本专利中不限于两个浓度水平，浓度水平可多个；如果用作校准品来校准检测系统时，本专利中“免疫抑制剂质量控制物质”可根据需要制备成多个浓度水平，2～10个均可(此浓度水平根据不同方法学试剂盒的要求会稍有不同)。

临床上参考区间：

他克莫司：全血谷浓度5～20ng/mL，>20ng/mL有中毒风险

西罗莫司：全血谷浓度5～15ng/mL，>15ng/mL有中毒风险

依维莫司：全血谷浓度5～15ng/mL，>15ng/mL有中毒风险

环孢素A：全血谷浓度100～300ng/mL，>300ng/mL有中毒风险；全血峰浓度(服药后2小时取血)500～1200ng/mL

临床中免疫抑制剂需要达到一定浓度才能产生治疗作用，临床上存在低于谷浓度的样本，所以该质量控制物质中免疫抑制剂他克莫司的浓度范围设定为0～20ng/mL，西罗莫司、依维莫司的浓度范围设定为0～15ng/mL，环孢素A的浓度可设定为0～300ng/mL；高浓度质控品中他克莫司、西罗莫司、依维莫司的浓度范围均控制在20～50ng/mL，环孢素A的浓度范围控制在300～1200ng/mL。

此外，现有技术与本发明的适用范围不同：本申请中“免疫抑制剂质量控制物质”可适用于质谱试剂盒，也可适用于其他方法学试剂盒，不仅仅限于质谱试剂盒；而“现有技术含有质控品Ⅰ、Ⅱ的仅包含在此质谱试剂盒中。另外，本发明与现有技术包含免疫抑制剂范围、种类不同：本申请中“免疫抑制剂质量控制物质”以临床常用的4种为例，但并不局限于此4种物质，凡是在全血中可进行检测的免疫抑制剂均可按此种方法制备，也均落入本专利范围之内，范围更广。而现有技术的则是仅仅针对此4种免疫抑制剂，对于其他的免疫抑制剂种类则不包括在内。

具体实施方式

下面用具体实施例对本发明做进一步的说明，但并不局限于以下几种实例：

本发明冷冻干燥的条件控制：冷冻干燥的条件为在-45℃～-55℃先预冻2～8小时，缓慢升温至-40℃后稳定1～3小时，再降温至-55℃稳定2～4小时，使其冰冻完全；冷冻干燥阶段采用1～3℃的升温速率，逐渐升温，升至某温度平衡后，稳定0.5～3小时，再逐渐升温直至-35℃后持续12～25小时，解析干燥阶段的升温速率采用2～5℃每小时，最高温度不能超过15℃，升温至15℃后，稳定4～15小时。

实例1

搜集无黄疸、乳糜，溶血的全血，选取其中传染病筛查结果为阴性(HIV、乙肝、梅毒、丙肝)的全血样本进行血型检测后，选取A型血100mL混合均匀，用于质控品制备；加入5gPVP40，搅拌至完全溶解；加入叔丁醇0.5g，搅拌至完全溶解。

经检测，该全血中不含环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司，制备质控品中含环孢素A 35ng/mL、他克莫司、西罗莫司、依维莫司6ng/mL，需向其中加入适量标准储备溶液。

根据他克莫司、西罗莫司、依维莫司标准储备溶液的浓度、全血体积、质控品的浓度要求计算出需添加标准储备溶液的体积，用移液器移取至一干净烧杯中，氮气吹干，加入处理好的全血，再移取适量环孢素A标准储备溶液，逐滴加入全血中，边加边搅拌；然后再依次加入谷胱甘肽2g、牛血清白蛋白4g、海藻糖3g，搅拌4h至完全溶解，按规格0.5mL/瓶进行分装，于-45℃预冻4小时，以5℃/h升温速率升温至-40℃，稳定2小时，再降温至-50℃冷冻2小时；冷冻干燥阶段采用2℃/h的升温速率升温至-35℃，稳定18小时；再以3℃/h的升温速率升温至10℃进行解析干燥，升温至10℃后稳定8小时，冻干结束，真空压盖取出，得到冻干粉。

实例2

搜集无黄疸、乳糜，溶血的全血，选取其中传染病筛查结果为阴性(HIV、乙肝、梅毒、丙肝)的全血样本进行混合，加入20mg EDTA-K₂搅拌至完全溶解，加入10gPVP40，搅拌至完全溶解；加入叔丁醇2.5g，搅拌至完全溶解。

经检测，该全血中不含环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司，制备质控品中含环孢素A 50ng/mL、他克莫司、西罗莫司、依维莫司10ng/mL，需向其中加入适量标准储备溶液。

根据他克莫司、西罗莫司、依维莫司标准储备溶液的浓度、全血体积、质控品的浓度要求计算出需添加标准储备溶液的体积，用移液器移取至一干净烧杯中，氮气吹干，加入处理好的全血，再移取适量环孢素A标准储备溶液，逐滴加入全血中，边加边搅拌；然后再依次加入焦亚硫酸钠5.0g、人血清白蛋白2.5g、甘露醇5.0g，搅拌6h至完全溶解，按规格1.0mL/瓶进行分装，于-55℃预冻3小时，以4℃/h升温速率升温至-40℃，稳定1小时，再降温至-55℃冷冻4小时；冷冻干燥阶段采用4℃/h的升温速率升温至-35℃，稳定20小时；再以3℃/h的升温速率升温至10℃进行解析干燥，升温至15℃后稳定12小时，冻干结束，真空压盖取出，得到冻干粉。

实例3

搜集无黄疸、乳糜，溶血的全血，选取其中传染病筛查结果为阴性(HIV、乙肝、梅毒、丙肝)的全血样本进行混合，加入113mg肝素搅拌至完全溶解，加入10g PVP40，搅拌至完全溶解；加入叔丁醇2.5g，搅拌至完全溶解。

经检测，该全血中不含环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司，制备质控品中含环孢素A 100ng/mL、他克莫司、西罗莫司、依维莫司20ng/mL，需向其中加入适量标准储备溶液。

根据他克莫司、西罗莫司、依维莫司标准储备溶液的浓度、全血体积、质控品的浓度要求计算出需添加标准储备溶液的体积，用移液器移取至一干净烧杯中，氮气吹干，加入处理好的全血，再移取适量环孢素A标准储备溶液，逐滴加入全血中，边加边搅拌；然后再依次加入半胱氨酸3.5g、牛血清白蛋白5.0g、葡萄糖5.0g，搅拌6h至完全溶解，按规格5.0mL/瓶进行分装，于-50℃预冻5小时，以5℃/h升温速率升温至-40℃，稳定3小时，再降温至-50℃冷冻3小时；冷冻干燥阶段采用2℃/h的升温速率升温至-35℃，稳定25小时；再以4℃/h的升温速率升温至10℃进行解析干燥，升温至15℃后稳定15小时，冻干结束，真空压盖取出，得到冻干粉。

免疫抑制剂(环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司)质量控制物质均匀性考察

取免疫抑制剂(环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司)质量控制物质冻干粉，随机抽取10瓶，准确加入1.0mL纯化水，并用液相色谱-串联质谱法进行检测，计算环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司的浓度及均值、SD等，结果如表1所示。

表1免疫抑制剂冻干质量控制物质均匀性考察(单位：ng/mL)

将上述质量控制物质任取3瓶混匀，连续测定10次，计算环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司测量结果的均值、SD，结果如表2所示。

表2免疫抑制剂质量控制物质3瓶混匀后测量结果(单位：ng/mL)

按照下列公式计算瓶间重复性CV％：

当S₁<S₂时，令CV_瓶间＝0

式中：为平均差

S为标准差

n为测量次数

X_i为指定参数第i次测量值

经考察，本方法制备的免疫抑制剂质量控制物质环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司的瓶间S_瓶间分别为1.552、0.209、0.236、0.253，对应的瓶间重复性CV_瓶间分别为4.8％、4.0％、4.1％、4.4％，小于10％。

免疫抑制剂(环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司)质量控制物质加速稳定性考察

取冻干粉6瓶，放37℃水浴中，经3天、5天、7天后分别取出2瓶，复溶，对环孢素A、他克莫司、西罗莫司、依维莫司进行检测，每瓶检测2次，结果与表1中各项均值比较，结果详见表3。

表3免疫抑制剂质量控制物质37℃加速稳定性考察结果(单位ng/mL)

从表3的数据可看出，本发明制备的免疫抑制剂质量控制物质在37℃加速考察7天后与靶值相比偏倚在±15％以内，表明本发明该质量控制物质质量稳定并可存放较长时间(2～8℃可存放1年)。

实例所用的原料，除另有说明外，均为市售商业产品。

以上所述，仅为本发明的优选实施例。应当指出，在本发明核心技术前提下，还可以做出改进优化，这些改进优化也应属于本发明的专利保护范围。与本发明的权利要求书相当的含义和范围内的任何改变，都应认为是包括在权利要求书的范围内。