阅读说明：本技术 一种d-二聚体检测试剂盒 (D-dimer detect reagent box ) 是由 李小英 刘芳 王玉玉 于 2020-08-28 设计创作，主要内容包括：本发明涉及体外诊断技术领域,尤其涉及一种D-二聚体检测试剂盒,解决了现有技术在D-二聚体胶乳免疫比浊法的检测过程中,其自然反应时间较长,导致检测结果需要等待较长时间的缺点,包括试剂一、试剂二、补充试剂、稀释液及校准品；试剂一包括缓冲液及叠氮钠；试剂二包括交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球及缓冲液；补充试剂包括丙烯酸树脂及硫酸软骨素；稀释液为生理盐水。本发明通过交联D-二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球进行胶乳免疫比浊法的检测支撑,而后利用缓冲液进行缓冲配比反应,其中还加入了叠氮钠,提升检测试剂的稳定性,保证试剂盒可稳定的通过胶乳免疫比浊法来实现D-二聚体的检测。(The invention relates to the technical field of in-vitro diagnosis, in particular to a D-dimer detection kit, which solves the defect that in the detection process of a D-dimer latex immunoturbidimetry in the prior art, the natural reaction time is longer, so that the detection result needs to wait for a longer time, and comprises a first reagent, a second reagent, a supplementary reagent, a diluent and a calibrator; the reagent I comprises buffer solution and sodium azide; the reagent II comprises polystyrene latex microspheres of the cross-linked D dimer monoclonal antibody and a buffer solution; the supplementary reagent comprises acrylic resin and chondroitin sulfate; the diluent is normal saline. The detection support of the latex immunoturbidimetry is carried out through the polystyrene latex microspheres of the cross-linked D-dimer monoclonal antibody, then the buffer solution is utilized for carrying out buffer proportioning reaction, sodium azide is added, the stability of the detection reagent is improved, and the kit can be ensured to stably realize the detection of the D-dimer through the latex immunoturbidimetry.)

一种D-二聚体检测试剂盒

技术领域

本发明涉及体外诊断技术领域，尤其涉及一种D-二聚体检测试剂盒。

背景技术

D-二聚体来源于纤溶酶溶解的交联纤维蛋白凝块，主要反映纤维蛋白溶解功能。D-二聚体的临床检测主要应用在静脉血栓栓塞(VTE)、深静脉血栓形成(DVT)和肺栓塞(PE)的诊断。

血液中有纤维蛋白，纤维蛋白经过活化和水解，产生特异的降解产物称为纤维蛋白降解产物。D-二聚体是最简单的纤维蛋白降解产物，D-二聚体水平升高说明体内存在高凝状态和继发性的纤维蛋白溶解亢进。因此，D-二聚体质量浓度对血栓性疾病的诊断、疗效评估和预后判断具有重要的意义。

D-二聚体常规的检测方法主要包括：乳胶凝集法、酶联免疫吸附法(ELISA)、胶乳增强免疫比浊法、免疫金标法等。其中，胶乳免疫比浊法具有操作简便、快速、定量准确、特异性强、敏感度高等优点，可满足门诊和急诊的需要，在临床应用中越来越广泛。在D-二聚体胶乳免疫比浊法的检测过程中，其自然反应时间较长，导致检测结果需要等待较长时间，且在逐步进行反应过程中，其内部pH发生变化，进一步导致检测末端速率缓慢，拉长D-二聚体整体检测时间。

因此，我们提出了一种D-二聚体检测试剂盒用于解决上述问题。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术在D-二聚体胶乳免疫比浊法的检测过程中，其自然反应时间较长，导致检测结果需要等待较长时间，且在逐步进行反应过程中，其内部pH发生变化，进一步导致检测末端速率缓慢，拉长D-二聚体整体检测时间的缺点，而提出的一种D-二聚体检测试剂盒。

为了实现上述目的，本发明采用了如下技术方案：

本发明提出的一种D-二聚体检测试剂盒，包括试剂一、试剂二、补充试剂、稀释液及校准品；

所述试剂一包括缓冲液及叠氮钠；

所述试剂二包括交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球及缓冲液；

所述补充试剂包括丙烯酸树脂及硫酸软骨素；

所述稀释液为生理盐水。

优选的，所述试剂一按重量份计包括：缓冲液10～15份及叠氮钠20～30份。

优选的，所述试剂二按重量份计包括：交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球40～50份及缓冲液10～15份。

优选的，所述补充试剂按重量份计包括：丙烯酸树脂20～30份及硫酸软骨素10～15份。

优选的，所述缓冲液为Tris，其pH为7.0～9.0，浓度为250～500mmol/L。

优选的，所述稀释液为质量分数为0.5％～0.9％的生理盐水。

优选的，一种D-二聚体检测试剂盒的校准样品配制方法，包括以下步骤：

S1采集：进行血液采集；

S2冷冻：在血液采集后4小时内，将血浆冷冻在-30℃～-18℃的温度中；

S3使用：在37℃的温度中，在10min内将冷冻的血浆解冻，混合均匀，并且以10000～15000xg离心70min，且离心完成后，在2小时内测定D-Dimer。

优选的，所述S1中，在采集血液后，以1500xg～2500xg直接离心血液试管15min，而后以15000xg再次离心70min以充分离心高脂血浆。

优选的，一种D-二聚体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：取待检测血浆置于第一试剂瓶及第二试剂瓶内，将校准样品置于第三试剂瓶内，并在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入稀释液，该稀释液与检测血浆/校准样品的容量比为(5～9)：1；

S2：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂一，孵育5～10min；

S3：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂二，混合均匀孵育5～10min；

S4：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入补充试剂，采用血凝分析仪或生化分析仪测定透光率的变化率从而做出校准样品的校准曲线，而后测定出待检测血浆的透光率的变化率，即可在校准曲线上求得待检测血浆中D-二聚体的含量。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

1、本发明通过交联D-二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球进行胶乳免疫比浊法的检测支撑，而后利用缓冲液进行缓冲配比反应，其中还设置有叠氮钠，提升检测试剂的稳定性，保证试剂盒可稳定的通过胶乳免疫比浊法来实现D-二聚体的检测。

2、本发明在试剂盒内设置了补充试剂，且在补充试剂内设有丙烯酸树脂，在添加完试剂一及试剂二后，可通过加入补充试剂中的丙烯酸树脂，实现二者的反应加速促凝，使得待检测血浆与交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球进行快读凝集反应，产生凝集以致浊度上升，进而实现透光率降低，快速得到检测数据。

3、本发明在补充试剂内还设置了硫酸软骨素，通过硫酸软骨素可对试剂盒凝集反应过程中的pH进行及时调整，保证其处于可快速进行凝集反应的标准之下，为凝集反应的进行提供环境，辅助实现快速检测，高效的得到D-二聚体检测数据。

具体实施方式

除非另有限定，本文使用的所有技术以及科学术语具有与本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同的含义。当存在矛盾时，以本说明书中的定义为准。“质量、浓度、温度、时间、或者其它值或参数以范围、优选范围、或一系列上限优选值和下限优选值限定的范围表示时，这应当被理解为具体公开了由任何范围上限或优选值与任何范围下限或优选值的任一配对所形成的所有范围，而不论该范围是否单独公开了。例如，1-50的范围应理解为包括选自1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、或50的任何数字、数字的组合、或子范围、以及所有介于上述整数之间的小数值，例如，1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、和1.9。关于子范围，具体考虑从范围内的任意端点开始延伸的“嵌套的子范围”。例如，示例性范围1-50的嵌套子范围可以包括一个方向上的1-10、1-20、1-30和1-40，或在另一方向上的50-40、50-30、50-20和50-10。”

下面结合具体实施例对本发明作进一步解说，在以下实施例中，未详细描述的各种过程和方法是本领域中公知的常规方法。下述实例中所用的材料、试剂、装置、仪器、设备等，如无特殊说明，均可从商业途径获得。

实施例一

本发明提出的一种D-二聚体检测试剂盒，包括试剂一、试剂二、补充试剂、稀释液及校准样品；

试剂一按重量份计包括：缓冲液30份及叠氮钠3份；

试剂二按重量份计包括：交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球20份及缓冲液30份；

补充试剂按重量份计包括：丙烯酸树脂20份及硫酸软骨素10份；

稀释液为质量分数为0.5％的生理盐水。

其中，缓冲液为Tris，其pH为7.0，浓度为250mmol/L。

实施例中，还提出了一种D-二聚体检测试剂盒的校准样品配制方法，包括以下步骤：

S1采集：进行血液采集；

S2冷冻：在血液采集后4小时内，将血浆冷冻在-30℃的温度中；

S3使用：在37℃的温度中，在10min内将冷冻的血浆解冻，混合均匀，并且以10000xg离心70min，且离心完成后，在2小时内测定D-Dimer。

具体地，一种D-二聚体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：取待检测血浆置于第一试剂瓶及第二试剂瓶内，将校准样品置于第三试剂瓶内，并在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入稀释液，该稀释液与检测血浆/校准样品的容量比为5：1；

S2：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂一，孵育5min；

S3：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂二，混合均匀孵育5min；

S4：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入补充试剂，采用血凝分析仪或生化分析仪测定透光率的变化率从而做出校准样品的校准曲线，而后测定出待检测血浆的透光率的变化率，即可在校准曲线上求得待检测血浆中D-二聚体的含量。

实施例二

本发明提出的一种D-二聚体检测试剂盒，包括试剂一、试剂二、补充试剂、稀释液及校准样品；

试剂一按重量份计包括：缓冲液40份及叠氮钠4份；

试剂二按重量份计包括：交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球22份及缓冲液40份；

补充试剂按重量份计包括：丙烯酸树脂24份及硫酸软骨素12份；

稀释液为质量分数为0.6％的生理盐水。

其中，缓冲液为Tris，其pH为8.0，浓度为300mmol/L。

实施例中，还提出了一种D-二聚体检测试剂盒的校准样品配制方法，包括以下步骤：

S1采集：进行血液采集；

S2冷冻：在血液采集后4小时内，将血浆冷冻在-28℃的温度中；

S3使用：在37℃的温度中，在10min内将冷冻的血浆解冻，混合均匀，并且以12000xg离心70min，且离心完成后，在2小时内测定D-Dimer。

具体地，一种D-二聚体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：取待检测血浆置于第一试剂瓶及第二试剂瓶内，将校准样品置于第三试剂瓶内，并在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入稀释液，该稀释液与检测血浆/校准样品的容量比为6：1；

S2：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂一，孵育7min；

S3：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂二，混合均匀孵育7min；

S4：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入补充试剂，采用血凝分析仪或生化分析仪测定透光率的变化率从而做出校准样品的校准曲线，而后测定出待检测血浆的透光率的变化率，即可在校准曲线上求得待检测血浆中D-二聚体的含量。

实施例三

本发明提出的一种D-二聚体检测试剂盒，包括试剂一、试剂二、补充试剂、稀释液及校准样品；

试剂一按重量份计包括：缓冲液50份及叠氮钠4份；

试剂二按重量份计包括：交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球24份及缓冲液50份；

补充试剂按重量份计包括：丙烯酸树脂28份及硫酸软骨素14份；

稀释液为质量分数为0.7％的生理盐水。

其中，缓冲液为Tris，其pH为8.0，浓度为400mmol/L。

实施例中，还提出了一种D-二聚体检测试剂盒的校准样品配制方法，包括以下步骤：

S1采集：进行血液采集；

S2冷冻：在血液采集后4小时内，将血浆冷冻在-20℃的温度中；

S3使用：在37℃的温度中，在10min内将冷冻的血浆解冻，混合均匀，并且以14000xg离心70min，且离心完成后，在2小时内测定D-Dimer。

具体地，一种D-二聚体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：取待检测血浆置于第一试剂瓶及第二试剂瓶内，将校准样品置于第三试剂瓶内，并在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入稀释液，该稀释液与检测血浆/校准样品的容量比为8：1；

S2：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂一，孵育8min；

S3：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂二，混合均匀孵育8min；

S4：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入补充试剂，采用血凝分析仪或生化分析仪测定透光率的变化率从而做出校准样品的校准曲线，而后测定出待检测血浆的透光率的变化率，即可在校准曲线上求得待检测血浆中D-二聚体的含量。

实施例四

本发明提出的一种D-二聚体检测试剂盒，包括试剂一、试剂二、补充试剂、稀释液及校准样品；

试剂一按重量份计包括：缓冲液55份及叠氮钠5份；

试剂二按重量份计包括：交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球25份及缓冲液55份；

补充试剂按重量份计包括：丙烯酸树脂30份及硫酸软骨素15份；

稀释液为质量分数为0.9％的生理盐水。

其中，缓冲液为Tris，其pH为9.0，浓度为500mmol/L。

实施例中，还提出了一种D-二聚体检测试剂盒的校准样品配制方法，包括以下步骤：

S1采集：进行血液采集；

S2冷冻：在血液采集后4小时内，将血浆冷冻在-18℃的温度中；

S3使用：在37℃的温度中，在10min内将冷冻的血浆解冻，混合均匀，并且以15000xg离心70min，且离心完成后，在2小时内测定D-Dimer。

具体地，一种D-二聚体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：取待检测血浆置于第一试剂瓶及第二试剂瓶内，将校准样品置于第三试剂瓶内，并在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入稀释液，该稀释液与检测血浆/校准样品的容量比为9：1；

S2：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂一，孵育10min；

S3：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂二，混合均匀孵育10min；

S4：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入补充试剂，采用血凝分析仪或生化分析仪测定透光率的变化率从而做出校准样品的校准曲线，而后测定出待检测血浆的透光率的变化率，即可在校准曲线上求得待检测血浆中D-二聚体的含量。

对比例一

一种D-二聚体检测试剂盒，包括试剂一、试剂二、补充试剂、稀释液及校准样品；

试剂一按重量份计包括：缓冲液55份及叠氮钠5份；

试剂二按重量份计包括：交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球25份及缓冲液55份；

补充试剂按重量份计包括：丙烯酸树脂30份；

稀释液为质量分数为0.9％的生理盐水。

其中，缓冲液为Tris，其pH为9.0，浓度为500mmol/L。

具体地，一种D-二聚体检测试剂盒的校准样品配制方法，包括以下步骤：

S1采集：进行血液采集；

S2冷冻：在血液采集后4小时内，将血浆冷冻在-18℃的温度中；

S3使用：在37℃的温度中，在10min内将冷冻的血浆解冻，混合均匀，并且以15000xg离心70min，且离心完成后，在2小时内测定D-Dimer。

具体地，一种D-二聚体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：取待检测血浆置于第一试剂瓶及第二试剂瓶内，将校准样品置于第三试剂瓶内，并在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入稀释液，该稀释液与检测血浆/校准样品的容量比为9：1；

S2：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂一，孵育10min；

S3：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂二，混合均匀孵育10min；

S4：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入补充试剂，采用血凝分析仪或生化分析仪测定透光率的变化率从而做出校准样品的校准曲线，而后测定出待检测血浆的透光率的变化率，即可在校准曲线上求得待检测血浆中D-二聚体的含量。

对比例二

一种D-二聚体检测试剂盒，包括试剂一、试剂二、补充试剂、稀释液及校准样品；

试剂一按重量份计包括：缓冲液55份及叠氮钠5份；

试剂二按重量份计包括：交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球25份及缓冲液55份；

补充试剂按重量份计包括：硫酸软骨素15份；

稀释液为质量分数为0.9％的生理盐水。

其中，缓冲液为Tris，其pH为9.0，浓度为500mmol/L。

具体地，一种D-二聚体检测试剂盒的校准样品配制方法，包括以下步骤：

S1采集：进行血液采集；

S2冷冻：在血液采集后4小时内，将血浆冷冻在-18℃的温度中；

S3使用：在37℃的温度中，在10min内将冷冻的血浆解冻，混合均匀，并且以15000xg离心70min，且离心完成后，在2小时内测定D-Dimer。

具体地，一种D-二聚体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：取待检测血浆置于第一试剂瓶及第二试剂瓶内，将校准样品置于第三试剂瓶内，并在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入稀释液，该稀释液与检测血浆/校准样品的容量比为9：1；

S2：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂一，孵育10min；

S3：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂二，混合均匀孵育10min；

S4：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入补充试剂，采用血凝分析仪或生化分析仪测定透光率的变化率从而做出校准样品的校准曲线，而后测定出待检测血浆的透光率的变化率，即可在校准曲线上求得待检测血浆中D-二聚体的含量。

对比例三

一种D-二聚体检测试剂盒，包括试剂一、试剂二、补充试剂、稀释液及校准样品；

试剂一按重量份计包括：缓冲液55份及叠氮钠5份；

试剂二按重量份计包括：交联D二聚体单克隆抗体的聚苯乙烯胶乳微球25份及缓冲液55份；

稀释液为质量分数为0.9％的生理盐水。

其中，缓冲液为Tris，其pH为9.0，浓度为500mmol/L。

具体地，一种D-二聚体检测试剂盒的校准样品配制方法，包括以下步骤：

S1采集：进行血液采集；

S2冷冻：在血液采集后4小时内，将血浆冷冻在-18℃的温度中；

S3使用：在37℃的温度中，在10min内将冷冻的血浆解冻，混合均匀，并且以15000xg离心70min，且离心完成后，在2小时内测定D-Dimer。

具体地，一种D-二聚体检测试剂盒的使用方法，包括以下步骤：

S1：取待检测血浆置于第一试剂瓶及第二试剂瓶内，将校准样品置于第三试剂瓶内，并在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入稀释液，该稀释液与检测血浆/校准样品的容量比为9：1；

S2：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂一，孵育10min；

S3：分别在第一试剂瓶、第二试剂瓶及第三试剂瓶内加入试剂二，混合均匀孵育10min；

S4：采用血凝分析仪或生化分析仪测定透光率的变化率从而做出校准样品的校准曲线，而后测定出待检测血浆的透光率的变化率，即可在校准曲线上求得待检测血浆中D-二聚体的含量。

实施例五

使用实施例四中的检测试剂盒重复测试3次，按公式(1)计算相对偏差，结果如表1所示：

式中：

B――相对偏差；

xi――第i次的测定值；

T――参考物质标示值或各浓度样本定值。

表1

	第一次	第二次	第三次
				相对偏差(％)	7	7	8

实施例六

用实施例四中的检测试剂盒分别对高(＞50％)、中(30％-50％)、低(＜30％)3个浓度水平样本进行测定，各测试10次，计算测量值的平均值和标准差(s)，按公式(2)计算变异系数(CV％)，结果如表2所示：

表2

根据表1及表2，所得数据符合：相对偏差在15.0％范围内；重复性试验使用高、中、低三个浓度水平的样本，高浓度样本变异系数(CV)应≤10％，中浓度样本变异系数(CV)应≤10％，低浓度样本变异系数(CV)应≤15％，故检测试剂盒本身合格。

对上述实施例一到实施例四、对比例一到三的检测试剂盒进行检测使用，结果如下：

表3：实施例一到实施例四数据

	实施例一	实施例二	实施例三	实施例四
					检测总时长(min)	25	22	19	17
反应后溶液pH	6	5	5	5

表4：对比例一到对比例三

针对上述表3、表4，可见，在实施例一到四中，随着各项成分份量的增加，其检测试剂盒的效果变强，使得其检测总时长逐步降低，其反应后溶液的pH至也逐步降低。

在其他数值均相同的实施例四与对比例一到三中：

对比例一中未在补充试剂中加入硫酸软骨素，明显可见的，其反应后的溶液pH值为8，而实施例四仅为5，二者相差巨大，可见硫酸软骨素对检测试剂溶液的pH值环境存在巨大的影响，同时由于反应环境pH值的变化，导致其适宜反应环境缺失，提高了检测总时长；

在对比例二中，补充试剂中加入了硫酸软骨素，但未见丙烯酸树脂，使得该对比例中的检测总时长明显增加，达到42min，而对比例四仅为17min，可见硫酸软骨素可有效的提高D-二聚体检测试剂盒的检测速率；

对比例三中，未加入补充试剂，其检测总时长为48min，且反应后溶液的最终pH至为8，无论是检测总时长还是最终pH均偏大，pH值同时影响到其检测反应环境，导致总时长相较对比例二也偏大。

综上，本发明中通过丙烯酸树脂可有效的加速检测试剂盒检测时的反应促凝，快速实现凝集，得到透光率变化，且通过设置硫酸软骨素可为凝集反应的环境进行及时pH调整，为凝集反应的进行提供环境，辅助实现快速检测，高效的得到D-二聚体检测数据。

以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。