生物传感器装置和方法
阅读说明：本技术 生物传感器装置和方法 (Biosensor device and method ) 是由 A·V·克拉里塞克 C·卡拉和 N·艾代米尔 J·特拉凡斯-赛迪克 R·卡德加 N·O·V 于 2019-06-13 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种传感器装置,其包括与基底处于电连通的包含OrX和Orco的昆虫气味受体复合物,其中所述传感器装置被配置成检测所述基底的电特性的变化。本发明还提供了传感器装置部件,其包括与基底处于电连通的包含OrX和Orco的昆虫气味受体复合物。本发明还提供了用于制造和使用所述传感器装置和传感器装置部件的方法。本发明还提供了使用所述传感器检测分析物的方法。(The present invention provides a sensor device comprising an insect scent receptor complex comprising OrX and Orco in electrical communication with a substrate, wherein the sensor device is configured to detect a change in an electrical characteristic of the substrate. The invention also provides a sensor device component comprising an insect scent receptor complex comprising OrX and Orco in electrical communication with a substrate. Methods for making and using the sensor devices and sensor device components are also provided. The invention also provides methods of detecting an analyte using the sensor.)
技术领域
本发明涉及用于检测分析物的传感器和方法。
背景技术
对分析物，例如挥发性有机化合物(VOC)和可溶性有机化学物质的实时检测对于健康和环境监测以及食品安全和水质是一项关键的挑战，并且有很强的驱动力来开发负担得起并且快速的分析物传感器。
方便、灵敏和特异性分析物传感器将具有多种应用，包括监测与食品质量/安全(调味剂、催熟、污染和腐败)、生物安全(害虫和疾病)、环境监测(有害污染物)、医疗诊断(例如呼吸诊断)和安全(非法化合物和爆炸物)相关的分析物。
昆虫嗅觉受体(OR)可以区分广泛的天然化学物质和合成化学物质，包括VOC在内。昆虫OR充当异聚配体门控阳离子通道(图1)，并且由被称为Orco的专一性辅助受体和气味特异性调节受体(OrX)构成。
昆虫OR在结构上和功能上与充当G蛋白偶联受体(GPCR)的哺乳动物OR和秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans)OR非常不同。
许多作者已经描述了使用爪蟾(Xenopus)卵母细胞2、昆虫细胞系3-5和人类HEK293细胞6对昆虫OR功能1进行的基于细胞的测定。然而，它们的应用主要限于鉴定昆虫OR的化合物特异性，其中一些用于鉴定用于害虫行为防治的激活性化合物和抑制性化合物7。
许多公开的专利文献描述了昆虫OR细胞测定8-13。全部都涉及用于测定用于害虫防治的新型激活性化合物和抑制性化合物的方法。就基于细胞的传感器而言，两篇出版物14-15描述了以基于细胞的传感器形式使用表达昆虫OR的细胞系。一篇公开展示了使用被转染了昆虫OR的爪蟾卵母细胞以使用双电极电压钳方法来检测气味剂14，而另一篇公开15描述了使表达信息素受体的细胞系在玻璃微流体芯片上生长并且通过使用荧光显微镜进行钙成像来检测信息素结合。
可商购获得的便携式挥发物传感技术限于电子/化学电子鼻，其性能在灵敏度和特异性方面明显不如昆虫嗅觉系统。此外，据申请人所知，没有基于上述基于昆虫OR的系统的商业产品。其它技术，如离子迁移谱仪和质谱仪提供了相对于电子鼻提高的灵敏度和特异性，但是对于购买来说非常昂贵，需要大量的使用者培训并且没有非常高的移动性。
因此，本发明的目的在于提供一种改进的传感器装置，其利用至少一种昆虫受体和/或至少为公众提供有用的选择。
发明内容
本发明提供了一种传感器装置，其包括与所述传感器的显示表面/基底偶联、包含OrX和Orco的昆虫气味受体复合物。据申请人所知，这是第一次将纯化的昆虫气味受体复合物(OrX/Orco)功能性地固定在传感器显示表面/基底上。
本申请的发明人已经惊人地证实了所述新型传感器相对于先前使用的基于昆虫OR的系统提供了非常显著的灵敏度增加。
传感器装置
在第一个方面，本发明提供了一种传感器装置，所述传感器装置包括与基底处于电连通、包含OrX和Orco的昆虫气味受体复合物，其中所述传感器装置被配置成检测所述基底的电特性的变化。
在一个实施方案中，所述电特性的变化由昆虫气味受体复合物中的OrX与分析物之间的相互作用引起。
在另一个实施方案中，所述相互作用是分析物与昆虫气味受体复合物中的OrX的结合。
在另一个实施方案中，所述分析物与OrX互补。
在另一个实施方案中，分析物与OrX之间的相互作用是特异性的。
分析物的检测
因此，在一个实施方案中，所述传感器能够通过检测所述基底的电特性的变化来检测分析物与OrX的结合。
在另一个实施方案中，所述传感器能够在环境中检测与昆虫气味受体复合物中的昆虫OrX结合的分析物的存在。
优选的是，检测对于分析物是特异性的。
电连通
在一个实施方案中，处于电连通意指昆虫气味受体复合物能够影响所述基底的电特性。
在另一个实施方案中，分析物与昆虫气味受体复合物中的OrX之间的相互作用引起昆虫气味受体复合物中的构象变化。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物中的构象变化引起基底的电特性的变化。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物形成对分析物的存在或不存在敏感的离子通道。
昆虫气味受体复合物与基底的偶联
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物与基底偶联。
昆虫气味受体复合物的呈现
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物以能够响应于与分析物的相互作用而发生构象变化的形式存在。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物存在于膜模拟物中。
所述膜模拟物可以选自脂质体、两亲化合物(amphipole)、洗涤剂胶束、纳米囊泡、脂质双层以及纳米盘。
所述膜模拟物可包含诸如脂质分子等两亲性分子。优选地，所述两亲性分子包括磷脂分子。
优选的是，所述膜模拟物是人工的。
所述昆虫气味受体复合物也可以存在于表面活性剂中，所述表面活性剂可以是离子的或非离子的。
检测的灵敏度
在一个实施方案中，所述传感器可以检测以下浓度的分析物的存在：小于1×10- 3M，优选地小于1×10-3M，更优选地小于1×10-4M，更优选地小于1×10-5M，更优选地小于1×10-6M，更优选地小于1×10-7M，更优选地小于1×10-8M，更优选地小于1×10-9M，更优选地小于1×10-10M，更优选地小于1×10-11M，更优选地小于1×10-12M，更优选地小于1×10-13M，更优选地小于1×10-14M，更优选地小于1×10-15M，更优选地小于1×10-16M，更优选地小于1×10-17M，更优选地小于1×10-18M，更优选地小于1×10-19M，更优选地小于1×10-20M。
基底
在一个实施方案中，所述基底选自以下各项中的至少一种或由以下各项中的至少一种构成：电极、半导体材料、碳纳米管(CNT)、石墨烯、氧化物、掺杂硅、导电聚合物、谐振器部件、棱镜上的惰性金属表面。
在一个实施方案中，所述谐振器部件是以下各项或由以下各项构成：压电材料、至少一种压电晶体、石英晶体。在一个优选的实施方案中，所述谐振器部件是石英晶体谐振器。
电特性
在一个实施方案中，所述电特性选自以下各项中的至少一种：电导率、电阻、复电阻、阻抗、电化学阻抗、电化学电位、表面等离子体谐振、电流和由交变电场引起的振荡的谐振频率。
检测器部件
在另一个实施方案中，所述传感器包括检测器部件，其测量所述基底的电特性的变化。
电化学阻抗谱(EIS)传感器装置
在所述传感器装置的一个实施方案中，所述基底是电化学电池的工作电极。
在一个实施方案中，除了工作电极之外，所述电化学电池还包括对电极。
在另一个实施方案中，所述电化学电池还包括参比电极。
在另一个实施方案中，所述电化学电池还包括恒电位仪。
在另一个实施方案中，所述电特性是电化学阻抗。
因此，在一个实施方案中，所述传感器装置包括与电化学电池的工作电极处于电连通的包含OrX和Orco的昆虫气味受体复合物，其中传感器装置被配置成检测所述工作电极的电化学阻抗的变化。
EIS传感器装置的工作电极
在一个实施方案中，所述工作电极由金构成或涂有金。
EIS传感器装置中昆虫气味受体复合物的呈现
所述昆虫气味受体复合物可以存在于如上文所述的膜模拟物中。
在一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物存在于脂质体中。
在另一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物存在于人工脂质体中。
在另一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物存在于脂质双层中。
在另一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物存在于人工脂质双层中。
在另一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物存在于纳米盘中。
昆虫气味受体复合物与EIS传感器装置中的电极的偶联
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物与工作电极偶联。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由接头分子与工作电极偶联。
在另一个实施方案中，所述接头分子足够短以允许昆虫气味受体复合物与电极之间的电连通。
在一个实施方案中，所述接头分子足够短以防止电极与昆虫受体复合物隔离。
在另一个实施方案中，所述接头分子选自16-巯基十六烷酸(16-MHDA)、6-巯基十六烷酸(6-MHDA)和6-巯基己酸(MHA)。
在一个优选的实施方案中，所述接头分子是6-巯基己酸(MHA)。
在另一个实施方案中，所述接头是自组装单层(SAM)的一部分。
因此，在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过由接头分子构成的SAM层与电极偶联。
在一个优选的实施方案中，昆虫气味受体复合物通过由6-巯基己酸(MHA)接头分子构成的SAM层与电极偶联。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过EDC/NHS上的酯与昆虫气味受体复合物中蛋白质上的胺之间的相互作用与工作电极偶联。这些胺存在于OrX和Orco两者上。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过EDC/NHS上的酯与膜模拟物中脂质(POPC、POPE、POPS)上的胺之间的相互作用与工作电极偶联。
在EIS传感器中检测分析物
在另一个实施方案中，所述传感器能够检测分析物与昆虫气味受体复合物的结合。
在另一个实施方案中，所述传感器能够在环境中检测与昆虫气味受体复合物结合的分析物的存在。
优选的是，检测对于分析物是特异性的。
在另一个实施方案中，分析物与昆虫OrX的结合使工作电极的电化学阻抗发生变化。
在一个优选的实施方案中，在分析物与昆虫OrX结合时，工作电极的电化学阻抗降低。
在一个优选的实施方案中，在由传感器检测到的分析物的量或与昆虫OrX结合的分析物的量发生变化时，工作电极的电化学阻抗降低。
检测器部件
在另一个实施方案中，所述传感器包括检测器部件。在另一个实施方案中，所述检测器部件检测或测量工作电极的电化学阻抗的变化。
基于半导体的传感器装置
在传感器装置的一个实施方案中，所述基底是半导体材料。可以使用任何合适的半导体材料。
在传感器装置的一个实施方案中，所述半导体材料是以下各项中的至少一种或由以下各项中的至少一种构成：石墨烯、氧化物、掺杂硅、导电聚合物和碳纳米管(CNT)。
碳纳米管-场效应晶体管(CNT-FET)传感器装置
在一个实施方案中，所述基底由碳纳米管(CNT)构成。所述碳纳米管(CNT)可以是单壁、双壁或多壁或其组合。在一个优选的实施方案中，所述碳纳米管(CNT)是单壁。
在另一个实施方案中，所述基底形成碳纳米管-场效应晶体管(CNT-FET)设备的沟道。
在一个实施方案中，所述CNT-FET设备包括源电极和漏电极。
在另一个实施方案中，所述沟道存在于或形成于源电极与漏电极之间。
在另一个实施方案中，所述沟道与源电极和漏电极处于电连通。
因此，在一个方面，本发明提供了一种传感器装置，其包括与碳纳米管-场效应晶体管(CNT-FET)设备的沟道中的至少一个碳纳米管处于电连通的昆虫气味受体复合物。
在另一个实施方案中，所述碳纳米管-场效应晶体管(CNT-FET)设备还包括栅电极。
CNT-FET传感器装置中昆虫气味受体复合物的呈现
所述昆虫气味受体复合物可以存在于如上文所述的膜模拟物中。
在一个优选的实施方案中，所述昆虫气味受体复合物存在于纳米盘中。
昆虫气味受体复合物与碳纳米管(CNT)的偶联
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物与沟道中的碳纳米管偶联。
在另一个实施方案中，所述偶联使昆虫气味受体复合物与碳纳米管处于电连通。
昆虫气味受体复合物功能化
在一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物被功能化以促进与CNT的偶联。
在一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物用his标签功能化。
因此，在一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物包含his标签。
在一个实施方案中，Orx蛋白包含his标签。
优选的是，his标签在OrX蛋白的N末端处。
在另一个实施方案中，Orco蛋白包含his标签。
优选的是，His标签在Orco蛋白的N-末端。
在另一个实施方案中，OrX和Orco蛋白两者均包含如上所述的his标签。
CNT功能化
在一个实施方案中，CNT被功能化以促进与昆虫气味受体复合物的偶联。
在另一个实施方案中，CNT用镍(Ni)-次氮基三乙酸(NTA)功能化。
偶联
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由his标签亲和结合与CNT偶联。
因此，在一个实施方案中，his标记的昆虫气味复合物与Ni-NTA功能化的CNT结合。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过PBASE上的酯与昆虫气味受体复合物中蛋白质上的胺之间的相互作用与CNT偶联。这些胺存在于OrX和Orco两者上。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过PBASE上的酯与膜模拟物中脂质(POPC、POPE、POPS)上的胺之间的相互作用与CNT偶联。
在CNT-FET传感器中检测分析物
在另一个实施方案中，所述传感器能够检测分析物与昆虫OrX的结合。
在另一个实施方案中，所述传感器能够在环境中检测与昆虫OrX结合的分析物的存在。
优选的是，对分析物的检测是特异性的。
在另一个实施方案中，分析物与昆虫OrX的结合使CNT-FET设备中的源增益电流发生变化。
在一个优选的实施方案中，在分析物与昆虫OrX结合时，源增益电流减小。
在一个优选的实施方案中，随着由传感器检测到的分析物的量或与昆虫OrX结合的分析物的量增加，源增益电流减小得越多。
检测器部件
在另一个实施方案中，所述传感器包括检测器部件。在另一个实施方案中，所述检测器部件检测或测量源漏电流的变化。
石墨烯场效应晶体管(GFET)传感器装置
在一个实施方案中，基底由石墨烯(G)片构成。石墨烯可以是单层、双层或多层或其组合。在优选的实施方案中，石墨烯是单层。
在另一个实施方案中，基底形成石墨烯场效应晶体管(GFET)设备的沟道。
在一个实施方案中，GFET设备包括源电极和漏电极。
在另一个实施方案中，在源电极和漏电极之间存在或形成沟道。
在另一个实施方案中，沟道与源电极和漏电极电连通。
因此，一方面，本发明提供了一种传感器装置，其包括与石墨烯场效应晶体管(GFET)设备的沟道中的石墨烯电连通的昆虫气味受体复合物。
在另一个实施方案中，石墨烯场效应晶体管(GFET)设备还包括栅电极。
GFET传感器装置中昆虫气味受体复合物的呈现
如上所述，昆虫气味受体复合物可以存在于膜模拟物中。
在一个优选的实施方案中，昆虫气味剂受体复合物存在于脂质体中。
昆虫气味受体复合物与石墨烯的偶联
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物与沟道中的石墨烯偶联。
在另一个实施方案中，偶联使昆虫气味受体复合物与石墨烯电连通。
昆虫气味受体复合物功能化
在一个实施方案中，昆虫气味剂受体复合物被功能化以促进与石墨烯的偶联。
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物用his标签功能化。
因此，在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物包含his标签。
在一个实施方案中，OrX蛋白包含his标签。
优选的是，his标签在OrX蛋白的N-末端处。
在另一个实施方案中，Orco蛋白包含his标签。
优选的是，his标签在Orco蛋白的N-末端处。
在另一个实施方案中，OrX和Orco蛋白两者均包含如上所述的his标签。
石墨烯功能化
在一个实施方案中，石墨烯被功能化以促进与昆虫气味受体复合物的偶联。
在另一个实施方案中，石墨烯用1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PBASE)功能化。
偶联
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由his标签亲和结合与石墨烯偶联。
因此，在一个实施方案中，his标记的昆虫气味复合物与PBASE功能化的石墨烯结合。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过PBASE上的酯与昆虫气味受体复合物中蛋白质上的胺之间的相互作用与石墨烯偶联。这些胺存在于OrX和Orco两者上。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过PBASE上的酯与膜模拟物中脂质(POPC、POPE、POPS)上的胺之间的相互作用与石墨烯偶联。
在GFET传感器中检测分析物
在另一个实施方案中，传感器能够检测分析物与昆虫OrX的结合。
在另一个实施方案中，传感器能够在环境中检测与昆虫OrX结合的分析物的存在。
优选的是，对分析物的检测是特异性的。
在另一个实施方案中，分析物与昆虫OrX的结合使GFET设备中的源增益电流发生变化。
在一个优选的实施方案中，当分析物与昆虫OrX结合时，源增益电流降低。
在一个优选实施方案中，随着由传感器检测到的或与昆虫OrX结合的分析物的量增加，源增益电流降低越多。
检测器部件
在另一个实施方案中，传感器包括检测器部件。在另一个实施方案中，检测器部件检测或测量源漏电流的变化。
石英晶体微量天平(QCM)传感器装置
在传感器装置的一个实施方案中，所述基底是石英晶体微量天平中的谐振器部件。
在一个实施方案中，所述谐振器部件是以下各项或由以下各项构成：压电材料、至少一种压电晶体和至少一种石英晶体。在一个优选的实施方案中，所述谐振器部件是石英晶体谐振器。
在一个实施方案中，所述石英晶体涂有金。
电特性
在一个实施方案中，所述电特性是由向谐振器部件施加的交变电场引起的振荡的谐振频率。
QCM传感器装置的电极
在一个实施方案中，所述谐振器部件具有与它的相对侧中的两个附接的电极。
在一个实施方案中，所述电极由金构成或涂有金。
QCM传感器装置中昆虫气味受体复合物的呈现
所述昆虫气味受体复合物可以存在于如上文所述的膜模拟物中。
在一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物存在于脂质体中。
在另一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物存在于人工脂质体中。
在另一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物存在于脂质双层中。
在另一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物存在于人工脂质双层中。
在一个优选的实施方案中，所述昆虫气味受体复合物存在于脂质体中。
昆虫气味受体复合物与QCM传感器装置中的谐振器部件的偶联
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物与谐振器部件偶联。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由接头分子与谐振器部件偶联。
在另一个实施方案中，所述接头分子足够短以允许昆虫气味受体复合物与谐振器部件之间的电连通。
在一个实施方案中，所述接头分子足够短以防止谐振器部件与昆虫气味受体复合物隔离。
在另一个实施方案中，所述接头分子选自16-巯基十六烷酸(16-MHDA)、6-巯基十六烷酸(6-MHDA)和6-巯基己酸(MHA)。
在一个优选的实施方案中，所述接头分子是6-巯基己酸(MHA)。
在另一个实施方案中，所述接头是自组装单层(SAM)的一部分。
因此，在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过由接头分子构成的SAM层与谐振器部件偶联。
在一个优选的实施方案中，昆虫气味受体复合物通过由6-巯基己酸(MHA)接头分子构成的SAM层与谐振器部件偶联。
使用QCM传感器检测分析物
在另一个实施方案中，所述传感器能够检测分析物与昆虫气味受体复合物中的昆虫OrX的结合。
在另一个实施方案中，所述传感器能够在环境中检测与昆虫OrX结合的分析物的存在。
优选的是，检测对于分析物是特异性的。
在另一个实施方案中，分析物与昆虫OrX的结合使由向谐振器部件施加的交变电场引起的谐振频率发生变化。
在一个实施方案中，在分析物与昆虫OrX结合时，谐振频率增加。
在另一个实施方案中，在分析物与昆虫OrX结合时，谐振频率降低。
检测器部件
在另一个实施方案中，所述传感器包括检测器部件。在另一个实施方案中，所述检测器部件检测或测量谐振器部件中由向谐振器部件施加的交变电场引起的谐振频率的变化。
在一个实施方案中，所述检测器部件是频率分析器。
双层传感器装置
在传感器装置的一个实施方案中，传感器包括：
膜模拟物，其包含两亲性分子、OrX蛋白和Orco蛋白；
第一基底，其包括设置在所述膜的第一侧的第一电极；和
第二基底，其包括设置在所述膜的第二侧的第二电极。
电特性
在一个实施方案中，电特性是电化学电位。在另一个实施方案中，电特性是电流。
双层传感器装置的电极
在一个实施方案中，基底是工作电极。在一实施方案中，传感器还包括对电极。
在另一个实施方案中，传感器还包括参比电极。
在另一个实施方案中，电化学电池还包括恒电位仪。
在一个实施方案中，一个或多个电极由银构成或涂有银。优选的是，电极的至少一部分被氯化银层覆盖。
双层传感器装置中昆虫气味受体复合物的呈现
优选将昆虫气味受体复合物置于如上所述的膜模拟物中。
优选的是，膜模拟物包含两亲性分子，例如脂质分子。优选的是，两亲性分子包括磷脂分子。
在另一个实施方案中，OrX和Orco是离子移变膜蛋白。OrX和Orco蛋白一起形成复合物。在一些实施方案中，复合物在分析物存在下形成。
使用双层传感器检测分析物
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物形成对分析物的存在或不存在敏感的离子通道。
优选的是，检测对于分析物是特异性的。
在另一个实施方案中，分析物的结合活化了昆虫气味受体复合物，导致离子跨膜流动。
优选的是，第一电极与所述膜的第一侧电接触，第二电极与所述膜的第二侧电接触。
在另一个实施方案中，传感器包括控制系统，该控制系统被配置为测量第一电极和第二电极之间的电特性，例如电流。
表面等离子体谐振(SPR)传感器装置
在传感器装置的一个实施方案中，基底是玻璃棱镜上的惰性金属表面。优选的是，金属表面是银或金的金属层。更优选的是，金属层的厚度为约50nm。
电特性
在一个实施方案中，电特性是表面等离子体谐振。
在SPR传感器装置中昆虫气味受体复合物的呈现
昆虫气味受体复合物可以存在于如上所述的膜模拟物中。
在一个实施方案中，昆虫气味剂受体复合物存在于脂质体例如人工脂质体或纳米盘中。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物存在于脂质双层，例如人工脂质双层中。
在一个优选的实施方案中，昆虫气味剂受体复合物存在于脂质体中。
SPR传感器设备中昆虫气味受体复合物与金属层的偶联
在一个实施方案中，昆虫气味剂受体复合物与金属表面偶联。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由N-末端半胱氨酸残基与金属表面直接偶联。
用SPR传感器检测分析物
在另一个实施方案中，传感器能够检测分析物与昆虫气味剂受体复合物中的昆虫OrX的结合。
在另一个实施方案中，传感器能够在环境中检测与昆虫OrX结合的分析物的存在。
优选的是，检测对于分析物是特异性的。
在另一个实施方案中，SPR传感器包括：
(a)结合了能够结合分析物的昆虫气味受体复合物的金属表面，
(b)用于在金属表面定向的光源激发光束，
(c)至少一个检测器，其能够检测来自光束、从金属表面被内部反射的光。
在另一个实施方案中，分析物与昆虫OrX的结合导致传感器的折射率发生变化。优选的是，通过测量表面等离子体谐振角或谐振波长的转变来检测该变化。
检测器部件
在另一个实施方案中，传感器包括检测器部件。
在另一个实施方案中，检测器部件检测或测量激发束谐振波长的时变(于固定的谐振角)或于固定波长的谐振角的时移。
使用本发明的传感器装置检测分析物结合的方法
在另一个方面，本发明提供了一种检测分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述分析物与本发明的传感器中的昆虫OrX结合；
b)检测基底的电特性的变化，
其中所述基底的电特性的变化表明检测到所述分析物。
使用本发明的传感器装置检测环境中分析物的存在的方法
在另一个方面，本发明提供了一种检测环境中分析物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将本发明的传感器暴露于含有所述分析物的环境；
b)使所述分析物与所述传感器中的昆虫OrX结合；
c)检测基底的电特性的变化，
其中所述基底的电特性的变化表明在所述环境中存在所述分析物。
使用本发明的EIS传感器装置检测分析物结合的方法
在另一个方面，本发明提供了一种检测分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述分析物与本发明的电化学电池中的昆虫OrX结合；
b)测量工作电极中电化学阻抗的变化，
其中电化学阻抗的变化表明检测到所述分析物。
使用本发明的EIS传感器装置检测环境中分析物的存在的方法
在另一个方面，本发明提供了一种检测环境中分析物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将本发明的传感器暴露于含有所述分析物的环境；
b)使所述分析物与本发明的电化学电池中的昆虫OrX结合；
c)测量工作电极的电化学阻抗的变化，
其中电化学阻抗的变化表明在所述环境中存在所述分析物。
使用本发明的CNT-FET传感器装置检测分析物结合的方法
在另一个方面，本发明提供了一种检测分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述分析物与本发明的传感器中的昆虫OrX结合；
b)测量所述CNT-FET设备中源增益电流的变化，
其中源增益电流的变化表明检测到所述分析物。
使用本发明的CNT-FET传感器装置检测环境中分析物的存在的方法
在另一个方面，本发明提供了一种检测环境中分析物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将本发明的传感器暴露于含有所述分析物的环境；
b)使所述分析物与所述传感器中的昆虫OrX结合；
c)测量所述CNT-FET设备中源增益电流的变化，
其中源增益电流的变化表明在所述环境中存在所述分析物。
使用本发明的石墨烯-FET(GFET)传感器装置检测分析物结合的方法
在另一方面，本发明提供了一种检测分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述分析物与本发明的传感器中的昆虫OrX结合，
b)测量所述GFET设备中源增益电流的变化，
其中，源增益电流的变化表明检测到所述分析物。
使用本发明的石墨烯-FET(GFET)传感器装置检测环境中分析物的存在的方法
在另一方面，本发明提供了一种检测环境中分析物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将本发明的传感器暴露于含有所述分析物的环境中，
b)使所述分析物与所述传感器中的昆虫OrX结合
c)测量所述GFET设备中源增益电流的变化，
其中，源增益电流的变化表明在所述环境中存在所述分析物。
使用本发明的QCM传感器装置检测分析物结合的方法
在另一个方面，本发明提供了一种检测分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述分析物与本发明的传感器中的昆虫OrX结合；
b)测量由向QCM设备中的谐振器部件施加的交变电场引起的谐振器部件中的谐振频率的变化，
其中谐振频率的变化表明检测到所述分析物。
使用本发明的QCM传感器装置检测环境中分析物的存在的方法
在另一个方面，本发明提供了一种检测环境中分析物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
d)将本发明的传感器暴露于含有所述分析物的环境；
e)使所述分析物与所述传感器中的昆虫OrX结合；
f)测量由向QCM设备中的谐振器部件施加的交变电场引起的谐振器部件的谐振频率的变化，
其中谐振频率的变化表明在所述环境中存在所述分析物。
使用本发明的SPR传感器装置检测分析物结合的方法
在另一方面，本发明提供了一种检测分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述分析物与本发明的传感器中的昆虫OrX结合，
b)测量表面等离子体谐振角或谐振波长的转变，
其中表面等离子体谐振角或谐振波长的变化表明检测到所述分析物。
使用本发明的SPR传感器装置检测环境中分析物的存在的方法
在另一方面，本发明提供了一种检测环境中分析物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将本发明的传感器暴露于含有所述分析物的环境中，
b)使所述分析物与所述传感器中的昆虫OrX结合，
c)测量表面等离子体谐振角或谐振波长的转变，
其中表面等离子体谐振角或谐振波长的变化表明在所述环境中存在所述分析物。
使用本发明的双层传感器装置检测分析物结合的方法
在另一方面，本发明提供了一种检测分析物的方法，所述方法包括以下步骤：
a)使所述分析物与本发明的传感器中的昆虫OrX结合，
b)获得经过第一电极和第二电极的电测量结果，
其中，电测量结果的变化表明检测到所述分析物。
使用本发明的双层传感器装置检测环境中分析物的存在的方法
在另一方面，本发明提供了一种检测环境中分析物的存在的方法，所述方法包括以下步骤：
a)将本发明的传感器暴露于含有所述分析物的环境中，
b)使所述分析物与本发明的传感器中的OrX结合，
c)获得经过第一电极和第二电极的电测量结果，
其中电测量结果的变化表明所述环境中存在所述分析物。
制造本发明的传感器装置的方法
在另一个方面，本发明提供了一种制造传感器装置的方法，所述方法包括以下步骤：在包含OrX和Orco的昆虫气味受体复合物与所述传感器装置的基底之间建立电连通，其中所述传感器装置被配置成检测所述基底的电特性的变化。
在一个实施方案中，所述方法包括使昆虫气味受体复合物与基底偶联的步骤。
在一个实施方案中，使昆虫气味受体复合物与基底偶联，之后将与昆虫气味受体复合物偶联的基底组装到传感器装置中。
优选的是，所述传感器的部件、偶联和功能如本文所述。
制造本发明的EIS传感器装置的方法
在一个实施方案中，所述基底是如本文所述的电化学电池的工作电极。
因此，在一个实施方案中，方法包括在昆虫气味受体复合物与电化学电池的工作电极之间建立电连通的步骤，其中电化学电池被配置成检测所述工作电极的电化学阻抗的变化，从而形成所述传感器装置。
在一个实施方案中，所述方法包括使昆虫气味受体复合物与工作电极偶联的步骤。
在一个实施方案中，使昆虫气味受体复合物与工作电极偶联，之后将与昆虫气味受体复合物偶联的工作电极组装到传感器装置中。
优选的是，所述传感器的部件、偶联和功能如本文所述。
昆虫气味受体复合物与电极的偶联。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由接头与电极偶联。
在一个实施方案中，接头分子足够短以允许昆虫气味受体复合物与电极之间的电连通。
在另一个实施方案中，接头分子足够短以防止电极与昆虫气味受体复合物隔离。
在另一个实施方案中，所述接头分子选自16-巯基十六烷酸(16-MHDA)、6-巯基十六烷酸(6-MHDA)和6-巯基己酸(MHA)。
在一个优选的实施方案中，所述接头分子是6-巯基己酸(MHA)。
在另一个实施方案中，所述接头是自组装单层(SAM)的一部分。
因此，在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过由接头分子构成的SAM层与电极偶联。
在一个优选的实施方案中，昆虫气味受体复合物通过由6-巯基己酸(MHA)接头分子构成的SAM层与电极偶联。
在另一个实施方案中，在偶联昆虫气味受体复合物之前，进行接头或MHA的羧基的活化。
优选的是，在使昆虫气味受体复合物与电极偶联之前，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的溶液进行接头或MHA的羧基的活化。
制造本发明的CNT-FET传感器装置的方法
在一个实施方案中，所述基底是如本文所述的CNT-FET设备的沟道。
因此，在一个实施方案中，方法包括以下步骤：在昆虫气味受体复合物与CNT-FET设备的沟道之间建立电连通，其中所述CNT-FET设备被配置成检测所述CNT-FET设备的源增益电流的变化，从而形成所述传感器装置。
在一个实施方案中，所述方法包括使昆虫气味受体复合物与沟道偶联的步骤。
在一个实施方案中，使昆虫气味受体复合物与沟道偶联，之后将与昆虫气味受体复合物偶联的沟道组装到传感器装置中。
优选的是，所述传感器的部件、偶联和功能如本文所述。
昆虫气味受体复合物与碳纳米管(CNT)的偶联
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物与沟道中的碳纳米管偶联。
昆虫气味受体复合物功能化
在一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物被功能化以促进与CNT的偶联。
在一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物用his标签功能化。
因此，在一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物包含his标签。
在一个实施方案中，Orx蛋白包含his标签。
优选的是，his标签在OrX蛋白的N末端处。
在另一个实施方案中，Orco蛋白包含his标签。
优选的是，his标签在Orco蛋白的N-末端处。
在另一个实施方案中，OrX和Orco蛋白二者均包含如上所述的his标签。
CNT功能化
在一个实施方案中，CNT被功能化以促进与昆虫气味受体复合物的偶联。
在另一个实施方案中，CNT用镍(Ni)-次氮基三乙酸(NTA)功能化。
偶联
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由his标签亲和结合与CNT偶联。
因此，在一个实施方案中，his标记的昆虫气味受体复合物与Ni-NTA功能化的CNT结合。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过PBASE上的酯与昆虫气味受体复合物中蛋白质上的胺之间的相互作用与CNT偶联。这些胺存在于OrX和Orco两者上。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过PBASE上的酯与膜模拟物中脂质(POPC、POPE、POPS)上的胺之间的相互作用与CNT偶联。
制造本发明的GFET传感器装置的方法
在一个实施方案中，基底是如本文所述的GFET设备的沟道。
因此，在一个实施方案中，方法包括以下步骤：在昆虫气味受体复合物与GFET设备的通道之间建立电连通，其中GFET设备被配置为检测GFET设备的源增益电流的变化，由此形成传感器装置。
在一个实施方案中，所述方法包括使昆虫气味受体复合物与所述沟道偶联的步骤。
在一个实施方案中，将昆虫气味剂受体复合与所述沟道偶联，之后将与昆虫气味受体复合物偶联的沟道组装到所述传感器装置中。
优选的是，传感器的部件、偶联和功能如本文所述。
昆虫气味受体复合物与石墨烯的偶联
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物与沟道中的石墨烯偶联。
昆虫气味受体复合物功能化
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物被功能化以促进与石墨烯的偶联。
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物用his标签功能化。
因此，在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物包含his标签。
在一个实施方案中，OrX蛋白包含his标签。
优选的是，his标签在OrX蛋白的N-末端处。
在另一个实施方案中，Orco蛋白包含his标签。
优选的是，his标签在Orco蛋白的N-末端处。
在另一个实施方案中，OrX和Orco蛋白二者均包含如上所述的his标签。
石墨烯功能化
在一个实施方案中，石墨烯被功能化以促进与昆虫气味受体复合物的偶联。
在另一个实施方案中，石墨烯用1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PBASE)功能化。
偶联
在另一个实施方案中，昆虫气味剂受体复合物经由his标签亲和结合与石墨烯偶联。
因此，在一个实施方案中，his标记的昆虫气味受体复合物与PBASE功能化的石墨烯结合。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过PBASE上的酯与昆虫气味受体复合物中蛋白质上的胺之间的相互作用与石墨烯偶联。这些胺存在于OrX和Orco两者上。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过PBASE上的酯与膜模拟物中脂质(POPC、POPE、POPS)上的胺之间的相互作用与石墨烯偶联。
制造本发明的QCM传感器装置的方法
在一个实施方案中，所述基底是石英晶体微量天平的石英晶体谐振器。
因此，在一个实施方案中，方法包括在昆虫气味受体复合物与石英晶体微量天平的谐振器部件之间建立电连通的步骤，其中石英晶体微量天平被配置成检测由向QCM设备中的谐振器部件施加的交变电场引起的谐振器部件的谐振频率的变化，从而形成所述传感器装置。
在一个实施方案中，所述方法包括使昆虫气味受体复合物与谐振器部件偶联的步骤。
在一个实施方案中，使昆虫气味受体复合物与谐振器部件偶联，之后将与昆虫气味受体复合物偶联的工作谐振器部件组装到传感器装置中。
优选的是，所述谐振器部件是石英晶体谐振器。
优选的是，所述传感器的部件、偶联和功能如本文所述。
昆虫气味受体复合物与谐振器部件的偶联
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由接头与谐振器部件偶联。
在一个实施方案中，接头分子足够短以允许昆虫气味受体复合物与谐振器部件之间的电连通。
在另一个实施方案中，接头分子足够短以防止谐振器部件与受体隔离。
在另一个实施方案中，所述接头分子选自16-巯基十六烷酸(16-MHDA)、6-巯基十六烷酸(6-MHDA)和6-巯基己酸(MHA)。
在一个优选的实施方案中，所述接头分子是6-巯基己酸(MHA)。
在另一个实施方案中，所述接头是自组装单层(SAM)的一部分。
因此，在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过由接头分子构成的SAM层与谐振器部件偶联。
在一个优选的实施方案中，昆虫气味受体复合物通过由6-巯基己酸(MHA)接头分子构成的SAM层与谐振器部件偶联。
在另一个实施方案中，在偶联昆虫气味受体复合物之前，进行接头或MHA的羧基的活化。
优选的是，在使昆虫气味受体复合体与谐振器部件偶联之前，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的溶液进行接头或MHA的羧基的活化。
具体实施方式
申请人的发明首次成功地将昆虫气味受体的嗅觉能力与方便的传感器形式相结合。
除了提高的便利性之外，相对于基于使用昆虫OR的先前测定系统，本发明的传感器装置还惊人地提供了检测灵敏度的显著的改进。
昆虫气味受体复合物
昆虫气味受体(OR)是形成配体门控非选择性阳离子通道的七次跨膜蛋白的新颖家族的成员。高度保守的昆虫气味辅助受体(Orco)被认为在体内形成活性通道，具有由一组配体结合亚基(OrX)赋予的气味特异性，如图1中所示。
优选的是，检测对于分析物是特异性的。
在体内，昆虫OrX蛋白的N末端位于细胞质内，而C末端位于细胞外。这种拓扑结构与哺乳动物G蛋白偶联受体(GPCR)的拓扑结构相反。此外，不同于哺乳动物GPCR，昆虫OR充当配体门控非选择性阳离子通道，并且在很大程度上独立于G蛋白进行信号转导16-17。
Hopf等,201518进一步论述了昆虫OR的预测结构和它们与哺乳动物GPCR的无关性。
昆虫Orx
也可以被描述为OrX多肽的昆虫OrX蛋白是本领域技术人员公知的。用于本发明中的合适的OrX序列包括来自以下各项的那些：黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)OR基因家族(19)，其可以检测广泛的VOC(20-22)；冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)OR基因家族(23)，其可以检测广泛的VOC(24-25)；以及来自其它昆虫物种的OR基因家族，关于已知的OR家族的最新列表，参见Montagne 2015(1)的表I。在一个实施方案中，昆虫OrX蛋白包含这些参考文献1、19和23中公开的序列或其变体或功能片段。
昆虫气味辅助受体(Orco)
昆虫气味辅助受体(Orco)蛋白(也称为Or83b26)，也可以描述为Orco多肽，是本领域技术人员众所周知的。用于本发明的合适的Orco序列包括黑腹果蝇Orco基因家族(19)、冈比亚按蚊Orco基因家族(23、27)以及来自其他昆虫物种的Orco基因家族，有关已知Orco家族的最新列表，请参见Montagne 2015(1)的表1。在一个实施方案中，昆虫Orco蛋白包含在参考文献1、19和23、27中公开的序列，或其变体或功能片段。
OrX蛋白的性质
在一个实施方案中，受体复合物中的OrX是重组表达的蛋白质。
在一个优选的实施方案中，所述OrX已经在重组表达之后被纯化。
在一个实施方案中，OrX不是直接从昆虫嗅细胞中纯化而来。
在另一个实施方案中，OrX不存在于传感器装置中的昆虫嗅细胞中。
Orco蛋白的性质
在一个实施方案中，受体复合物中的Orco是重组表达的蛋白质。
在一个优选的实施方案中，Orco已经在重组表达之后被纯化。
在一个实施方案中，Orco不是直接从昆虫嗅细胞中纯化而来。
在另一个实施方案中，Orco不存在于传感器装置中的昆虫嗅细胞中。
用于本发明的传感器装置中的基底
用于本发明的传感器装置中的基底可以是其中可以测量电特性的变化的任何基底。优选的是，电特性的变化是由OrX与分析物之间的相互作用所引起。
所述基底还可以提供可以与昆虫气味受体复合物偶联的表面。
合适的基底包括以下各项中的至少一种或由以下各项中的至少一种构成：电极、半导体材料、碳纳米管(CNT)、石墨烯、氧化物、掺杂硅、导电聚合物、谐振器部件、棱镜上的惰性金属表面。
在一个实施方案中，谐振器部件是以下各项或由以下各项构成：压电材料、至少一种压电晶体和石英晶体。在一个优选的实施方案中，所述谐振器部件是石英晶体谐振器。
在本发明的传感器装置中测量的电特性
在一个实施方案中，所述电特性选自以下各项中的至少一种：电导率、电阻、复电阻、阻抗、电化学阻抗、电化学电位、表面等离子体谐振、电流和由交变电场引起的振荡的谐振频率。
EIS装置
在一个实施方案中，本发明的传感器装置被配置成检测化学电池的工作电极的电化学阻抗的变化。因此，在该实施方案中，传感器装置被配置用于电化学阻抗谱法(EIS)。
电化学阻抗谱法(EIS)
电化学阻抗谱法是本领域技术人员公知的，并且长期以来一直被用于研究电化学系统。对于阻抗测量，应用小的正弦交流电压探针(通常2mV-10mV)并且确定电流响应。同相电流响应确定阻抗的实部(电阻)分量，而异相电流响应确定虚部(电容)分量。交流探针电压应当小到足以使得系统响应呈线性，从而允许简单的等效电路分析。阻抗法是非常强大的，这是因为它们能够表征广泛不同的时间常数的物理化学过程，对高频率下的电子转移和低频率下的质量转移进行采样。
阻抗结果通常被拟合成电阻器和电容器的等效电路，如常常用于解释简单电化学系统的Randles电路。Randles电路[Rs+CPE/(Rct+W)]包括与恒相位元件(CPE)串联并且与电荷转移电阻(Rct)和瓦尔堡扩散元件(Warburg diffusion element)(W)并联的溶液电阻(Rs)。
如果分析物影响这些等效电路参数中的一个或多个并且这些参数不受干扰物质的影响，则阻抗法可以用于分析物检测。
可以用于测量有效扩散系数的瓦尔堡阻抗对分析应用很少有用。最常用于分析物检测的等效电路元件是Rct和CPE。测量的电容通常来自几个元件的串联组合，如与金(Au)电极上的传感层结合的分析物。
电化学阻抗谱(EIS)装置
EIS装置通常包括电化学电池，所述电化学电池具有：
·工作电极(WE)
·对电极(CE)
·参比电极(RE)
·恒电位仪/恒电流仪(PGSTAT)
根据应用，仪器与电化学电池的连接可以(或必须)以不同的方式设置。
在恒电位模式下，恒电位仪/恒电流仪(PGSTAT)将准确地控制对电极(CE)对工作电极(WE)的电位，因此工作电极(WE)与参比电极(RE)之间的电位差是明确的，并且对应于由用户指定的值。在恒电流模式下，控制WE与CE之间的电流。连续监测RE与WE之间的电位差和CE与WE之间流动的电流。通过使用PGSTAT，在测量期间的任何时候，通过使用负反馈机制准确地控制由用户指定的值(即施加的电位或电流)。
对电极(CE)是用于闭合电化学电池中的电流电路的电极。它通常由惰性材料(例如Pt、Au、石墨、玻璃碳)制成并且通常，它不参与电化学反应。由于电流在WE与CE之间流动，因此CE(电子源/冷阱)的总表面积必须高于WE的面积，因此它不会是所研究的电化学过程的动力学中的限制因素。
参比电极(RE)是具有稳定并且公知的电极电位的电极并且它用作电化学电池中的参比点以用于电位控制和测量。参比电极电位的高稳定性通常通过使用氧化还原系统来达到，所述氧化还原系统具有恒定(缓冲或饱和)浓度的氧化还原反应的每一个参与者。此外，通过参比电极的电流保持接近零(理想地是零)，这是通过使用CE来闭合电池中的电流电路以及使用静电计上非常高的输入阻抗(>100GOhm)实现的。
工作电极(WE)是电化学系统中的电极，在所述电极上发生所关注的反应。常见的工作电极可以由惰性材料制成，例如Au、Ag、Pt、玻璃碳(GC)和Hg滴和膜。
EIS装置还可以包括用于测量工作电极的电特性的变化的部件。举例来说，该部件可以是频率分析器。频率分析器可以与恒电位仪/恒电流仪连接。
CNT-FET装置
在一个实施方案中，本发明的传感器装置被配置成检测CNT-FET设备的源增益电流的变化。
碳纳米管场效应晶体管(CNT-FET)
碳纳米管场效应晶体管(CNT-FET)是利用单个碳纳米管或碳纳米管阵列作为沟道材料代替传统金属氧化物半导体场效应晶体管(MOS-FET)结构中的体硅的场效应晶体管。
CNT-FET装置
CNT-FET装置典型地包括：
a)源电极(SE)
b)漏电极(DE)
c)栅电极(GE)，和
d)至少一个由碳纳米管(CNT)构成的沟道
栅电极用于控制穿过源电极和漏电极的电流。当栅电极接通时，电流能够通过沟道穿过源电极和漏电极被调制。
电极通常由至少一种金属构成。优选的金属包括但不限于：铂、金、铬、铜、铝、镍、钯和钛。
在一个优选的实施方案中，沟道由碳纳米管构成。
CNT-FET装置还可以包括用于测量源漏电流的变化的部件。
GFET装置
在一个实施方案中，本发明的传感器装置被配置为检测GFET设备的源增益电流的变化。
石墨烯场效应晶体管(GFET)
碳纳米管场效应晶体管(GFET)是一种利用石墨烯作为沟道材料来代替体传统的金属氧化物半导体场效应晶体管(MOS-FET)结构中的体硅的场效应晶体管。
GFET装置
GFET装置件典型地包括：
e)源电极(SE)
f)漏电极(DE)
g)栅电极(GE)，以及
h)至少一个由石墨烯构成的沟道。
栅电极用于控制跨源电极和漏电极之间的电流。当栅电极打开时，能够调制通过沟道、跨源电极和漏电极的电流。
电极典型地由至少一种金属构成。优选的金属包括但不限于：铂、金、铬、铜、铝、镍、钯和钛。
在一个优选的实施方案中，沟道由碳纳米管构成。
GFET装置还可以包括测量源漏电流变化的部件。
QCM装置
在一个实施方案中，本发明的传感器装置被配置成检测石英晶体微量天平(QCM)中的谐振器部件的谐振振荡频率的变化。
在一个实施方案中，所述谐振器部件是以下各项或由以下各项构成：压电材料、至少一种压电晶体和至少一种石英晶体。在一个优选的实施方案中，所述谐振器部件是石英晶体谐振器。
在一个实施方案中，所述石英晶体涂有金。
石英晶体微量天平(QCM)
石英晶体微量天平(QCM)技术是本领域技术人员公知的，并且通过测量石英晶体谐振器的频率变化来测量每单位面积的质量变化。由于声谐振器的表面处氧化物生长/衰减或膜沉积而添加或去除小的质量会干扰谐振。QCM可以在真空下、在气相中和在液体环境中使用。它在确定分子(特别是蛋白质)对用识别位点功能化的表面的亲和力方面是非常有效的。QCM也被用于研究生物分子之间的相互作用。容易进行高精度频率测量，因此，容易测量低至低于1μg/cm2的水平的质量密度。除了测量频率之外，常常还测量耗散因数(相当于谐振带宽)以帮助分析。耗散因数是谐振的品质因数的倒数Q-1＝w/fr；它定量系统中的阻尼并且与样品的粘弹性特性有关。
石英是经历压电效应的晶体家族的一个成员。施加电压与机械变形之间的关系是公知的；这允许通过电学手段探测声谐振。向石英晶体施加交流电将引起振荡。使用适当切割的晶体的电极之间的交流电，产生驻波型切变波。作为频率与带宽的比率的Q因数可以高达106。这样的窄谐振产生高度稳定的振荡器和确定谐振频率的高准确度。QCM利用这种简易性和精度进行传感。常用设备允许晶体上低至1Hz的分辨率，具有在4MHz-6MHz范围内的基波谐振频率。
石英晶体的振荡频率部分地取决于晶体的厚度。在正常操作期间，所有其它影响变量保持恒定；因此，厚度的变化直接与频率的变化相关联。当质量沉积在晶体的表面上时，厚度增加；因此，振荡频率从初始值减小。使用一些简化假设，该频率变化可以被定量并且使用绍尔布赖方程(Sauerbrey equation)精确地与质量变化相关联。
石英晶体微量天平(QCM)装置
QCM的典型设置含有水冷管、保持单元、通过微点馈通的频率传感设备、振荡源以及测量和记录装置。
QCM由具有蒸镀到两侧上的电极的谐振器部件(通常是薄压电板)组成。由于压电效应，跨电极的交流电压引起剪切变形，反之亦然。机电耦合提供了一种通过电学手段检测声谐振的简单方法。否则，它不太重要。
双层装置
双层装置的典型设置将诸如脂质双层和蛋白质等生物成分与电子设备结合起来，以响应来自目标分析物或分析物家族的刺激而提供输出信号。
所述双层装置包括昆虫气味受体复合物，该复合物形成被安装在电路中的被分析物控制(活化/灭活)的离子通道，其中分析物与OrX的结合导致利用所述电路测量的、流过所述离子通道的电流。
SPR装置
SPR装置的典型设置包括：
(a)提供能够结合分析物的金属传感器表面的传感器：
(b)用于金属表面定向的光源激发光束，
(c)至少一个检测器，其能够检测来自光束、从传感器表面内部反射的光。
SPR装置包括与金属表面偶联的昆虫气味受体复合物，其中分析物与昆虫OrX的结合导致传感器折射率的变化。优选的是，可以通过测量表面等离子体谐振角或谐振波长的转变来检测所述变化。
本发明的传感器装置
在第一个方面，本发明提供了一种传感器装置，所述传感器装置包括与基底处于电连通的包含OrX和Orco的昆虫气味受体复合物，其中所述传感器装置被配置成检测所述基底的电特性的变化。
传感器部件
在另一个方面，本发明提供了一种用于传感器装置的部件，所述部件包括与如本文所限定的基底处于电连通的包含OrX和Orco的昆虫气味受体复合物。该部件可用于添加到根据本发明的传感器装置中。
在一个方面，本发明提供了一种传感器装置部件，其包括与基底处于电连通的包含OrX和Orco的昆虫气味受体复合物。
在一个方面，本发明提供了一种传感器装置，其包括本发明的传感器装置部件，其中所述传感器装置被配置成检测基底的电特性的变化。
在另一个方面，本发明提供了一种制造传感器装置部件的方法，所述方法包括在包含OrX和Orco的昆虫气味受体复合物与基底之间建立电连通的步骤。
在另一个方面，本发明提供了一种组装传感器装置的方法，所述方法包括将本发明的传感器装置部件添加到传感器装置中，其中组装的传感器装置被配置成检测基底的电特性的变化。
在传感器装置部件和传感器装置的某些实施方案中，昆虫气味受体复合物、电连通、基底、配置和检测如本文所述。
电化学阻抗谱(EIS)设备
在一个实施方案中，所述传感器装置包括电化学电池。
在一个实施方案中，所述电化学电池包括至少两个电极。
在另一个实施方案中，所述电化学电池至少包括：
a)工作电极(WE)，和
b)对电极(CE)。
在一个优选的实施方案中，所述电化学电池还包括参比电极(RE)。
在另一个实施方案中，所述电化学电池包括恒电位仪/恒电流仪(PGSTAT)。
在一个优选的实施方案中，所述电化学电池包括所有以下各项：
a)工作电极(WE)，
b)对电极(CE)，
c)参比电极(RE)，和
d)恒电位仪/恒电流仪(PGSTAT)。
对电极
在一个实施方案中，所述对电极由以下材料构成或涂有以下材料，所述材料选自铂(Pt)、金(Au)、石墨或玻璃碳(GC)。
优选的是，所述对电极由铂(Pt)构成。
优选的是，所述对电极是铂(Pt)线。
参比电极
优选的是，参比电极是银/氯化银(Ag/AgCl)参比电极。
工作电极
在一个实施方案中，电化学阻抗谱(EIS)设备包括至少一个工作电极。
所述电极可以由任何合适的材料构成或涂有任何合适的材料。所述电极可以由以下材料构成或涂有以下材料，所述材料选自金(Au)、银(Ag)、铂(Pt)、碳纳米管(CNT)和玻璃碳(GC)。
在一个优选的实施方案中，所述电极由金构成或涂有金。
恒电位仪/恒电流仪(PGSTAT)
优选的是，恒电位仪/恒电流仪(PGSTAT)以恒电位模式使用。
检测器部件
在另一个实施方案中，所述传感器包括检测器部件。所述检测器部件检测或测量基底的电特性的变化。
在一个实施方案中，所述检测器部件是频率分析器。在另一个实施方案中，频率分析器与恒电位仪/恒电流仪(PGSTAT)连接。
昆虫OrX蛋白的制备
用于重组表达和纯化昆虫OrX和Orco蛋白的方法是本领域技术人员已知的28。
昆虫OrX制备的呈现
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物以能够响应于与分析物的相互作用而发生构象变化的形式存在。
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物存在于膜模拟物中。
顾名思义，膜模拟物模拟了天然膜，并且可以负载呈与体内发现的构象相同或相似的构象的受体。
所述膜模拟物可以选自脂质体、两亲化合物、洗涤剂胶束、纳米囊泡、脂质双层以及纳米盘。
优选的是，所述膜模拟物是人工的。
在一个实施方案中，所述膜模拟物是脂质体。
在一个实施方案中，所述膜模拟物是人工脂质体。
在另一个实施方案中，所述膜模拟物是脂质双层。
在另一个实施方案中，所述膜模拟物是人工脂质双层。
用于在脂质体中重构昆虫受体蛋白(OrX和Orco)的方法是本领域已知的28。
在工作电极上形成包含昆虫气味受体复合物的脂质双层
不希望受理论所束缚，申请人假定在一些实施方案中，当将脂质体中的昆虫气味受体复合物施用于工作电极时，所述脂质体改变结构以在电极上形成脂质双层。申请人假定昆虫气味受体复合物以与在体内细胞膜中发现的构象相似或相同的构象嵌入脂质双层中，以使得配体/分析物可进入OrX受体的配体/分析物结合结构域。
不希望受理论所束缚，申请人假定在其它实施方案中，脂质体在与工作电极结合时保持为脂质体。这在图2中举例说明。
昆虫气味受体复合物与基底的偶联
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物与基底偶联。
用于使蛋白质与基底偶联的许多方法是本领域技术人员已知的。这样的方法包括使用共价化学偶联、光化学交联、表面涂布/改性、金表面化学、蛋白质亲和标签、生物素-链霉亲和素连接、抗体固定以及工程化表面结合肽序列。
用于本发明的装置中的OrX和Orco蛋白还可以包括胺基、组氨酸标签或用于使昆虫气味受体复合物与基底偶联的一些其它功能化。在具有胺基的蛋白质的情况下，用户可以使用胺基置换与基底偶联的离去基团以使蛋白质与基底结合。所述偶联不一定需要通过亲核试剂-离去基团反应来完成，这是因为偶联可以通过共价键(例如酰胺键)、离子键、氢键键合或金属配位进行。作为配位的一个实例，OrX或Orco蛋白可以通过组氨酸标签与镍之间的配位而与基底偶联。OrX或Orco蛋白也可以通过半胱氨酸残基与基底偶联。在一些实施方案中，待天然连接的OrX或Orco蛋白包括半胱氨酸残基。这可以是天然存在的，或这样的残基可以被有意地掺入天然蛋白或重组蛋白中。另外的信息可以见于WO2012050646中。
在一些实施方案中，基底的表面包含使基底与跨膜蛋白连接的官能团。在一个非限制性实例中，材料的表面可以用羧化重氮盐功能化，其自发地与诸如碳纳米管的基底形成共价键。胺和酰胺官能化被认为是合适的，如同酚/芳族官能团也是合适的。
用于EIS的接头
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由接头与电极偶联。
在一个实施方案中，接头分子足够短以允许昆虫气味受体复合物与电极之间的电连通。
在另一个实施方案中，接头分子足够短以防止电极与受体隔离。
在另一个实施方案中，所述接头分子选自16-巯基十六烷酸(16-MHDA)、6-巯基十六烷酸(6-MHDA)和6-巯基己酸(MHA)。
在一个优选的实施方案中，所述接头是6-巯基己酸(MHA)。
在另一个实施方案中，接头是自组装单层(SAM)的一部分。
因此，在一个实施方案中，所述SAM层由6-巯基己酸(MHA)构成。
在另一个实施方案中，在偶联昆虫气味受体复合物之前，进行MHA的羧基的活化。
优选的是，在使昆虫气味受体复合物与电极偶联之前，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的溶液进行MHA的羧基的活化。
分析物的检测
在另一个实施方案中，所述传感器能够检测分析物与昆虫OrX的结合。
在另一个实施方案中，所述传感器能够在环境中检测与昆虫OrX结合的分析物的存在。
优选的是，对分析物的检测是特异性的。
在另一个实施方案中，分析物与昆虫OrX的结合使工作电极的电化学阻抗发生变化。
碳纳米管场效应晶体管(CNT-FET)设备
优选的是，碳纳米管场效应晶体管(CNT-FET)设备包括至少两个端子。在另一个实施方案中，CNT-FET设备至少包括源电极和漏电极。
在一个实施方案中，所述CNT-FET设备包括：
a)源电极
b)漏电极
c)栅电极
d)至少一个由碳纳米管(CNT)构成的沟道
优选的是，所述栅电极是银/氯化银(Ag/AgCl)线。
检测器部件
在另一个实施方案中，所述传感器包括检测器部件。所述检测器部件检测或测量源漏电流的变化。
电特性的变化可以使用手动操作或在计算机控制下操作的常规电子仪器测量。举例来说，计算机化的实验室设置可能包括National Instrument PCI-6722DAQ板以施加偏压和各种栅压值。然后可以使用Keithley 6485皮安计来测量电流，从而提供全I-Vg曲线。在其中希望测量位于单个基底上的许多装置的情况下，可以使用开关矩阵(Keithley7001)或其它多路复用器。
也可以使用Agilent 4156C参数分析器进行所有电测量。所述参数分析器具有优异的灵敏度并且可以在毫微微安尺度上准确测量电流。
昆虫气味受体复合物的呈现
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物以能够响应于与分析物的相互作用而发生构象变化的形式存在。
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物存在于膜模拟物中。
顾名思义，膜模拟物模拟了天然膜，并且可以负载呈与体内发现的构象相同或相似的构象的受体。
所述膜模拟物可以选自脂质体、两亲化合物、洗涤剂胶束、纳米囊泡、脂质双层以及纳米盘。
优选的是，所述膜模拟物是人工的。
在一个优选的实施方案中，所述膜模拟物是纳米盘。
昆虫气味受体复合物与本发明的CNT-FET装置中的沟道的偶联
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物与沟道中的碳纳米管偶联。
昆虫气味受体复合物功能化
在一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物被功能化以促进与CNT的偶联。
在一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物用his标签功能化。
因此，在一个实施方案中，所述昆虫气味受体复合物包含his标签。
在一个实施方案中，OrX蛋白包含his标签。
优选的是，his标签在OrX蛋白的N末端处。
在另一个实施方案中，Orco蛋白包含his标签。
优选的是，his标签在Orco蛋白的N-末端处。
在另一个实施方案中，OrX和Orco蛋白均包含如上所述的his标签。
CNT功能化
在一个实施方案中，CNT被功能化以促进与昆虫气味受体复合物的偶联。
在另一个实施方案中，CNT用镍(Ni)-次氮基三乙酸(NTA)功能化。
偶联
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由his标签亲和结合与CNT偶联。
因此，在一个实施方案中，his标记的昆虫气味受体复合物与Ni-NTA功能化的CNT结合。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过PBASE上的酯与昆虫气味受体复合物中蛋白质上的胺之间的相互作用与CNT偶联。这些胺存在于OrX和Orco两者上。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过PBASE上的酯与膜模拟物中脂质(POPC、POPE、POPS)上的胺之间的相互作用与CNT偶联。
分析物的检测
在另一个实施方案中，所述传感器能够检测分析物与昆虫OrX的结合。
在另一个实施方案中，所述传感器能够在环境中检测与昆虫OrX结合的分析物的存在。
优选的是，对分析物的检测是特异性的。
在另一个实施方案中，分析物与昆虫OR的结合使本发明的CNT-FET设备的沟道中的电源增益电流发生变化。
石墨烯场效应晶体管(GFET)设备
优选的是，石墨烯场效应晶体管(GFET)设备包括至少两个端子。在另一个实施方案中，GFET设备至少包括源电极和漏电极。
在一个实施方案中，GFET设备包括：
e)源电极
f)漏电极
g)栅电极
h)至少一个由石墨烯构成的沟道。
优选的是，栅电极是银/氯化银(Ag/AgCl)线。
检测器部件
在另一个实施方案中，传感器包括检测器部件。检测器部件检测或测量源漏电流的变化。
可以使用手动或在计算机控制下操作的常规电子仪器来测量电特性的变化。例如，计算机化的实验室设置可能包括National Instrument PCI-6722DAQ板，用于施加偏置电压和各种栅电压值。然后可以使用Keithley 6485皮安计测量电流，从而提供完整的I-Vg曲线。在希望测量位于单个基底上的许多装置的情况下，可以使用开关矩阵(Keithley7001)或其他复用器。
Agilent 4156C参数分析仪也可用于所有电测量。参数分析仪具有出色的灵敏度，并且可以在毫微微安尺度上准确测量电流。
昆虫气味受体复合物的呈现
在另一个实施方案中，昆虫气味剂受体复合物以能够响应于与分析物的相互作用而发生构象变化的形式存在。
在一个实施方案中，昆虫气味剂受体复合物存在于膜模拟物中。
顾名思义，膜模拟物模仿天然膜，并且可以负载呈与体内发现的构象相同或相似的构象的受体。
膜模拟物可以选自脂质体、两亲化合物、洗涤剂胶束、纳米囊泡、脂质双层和纳米盘。
优选的是，膜模拟物是人工的。
在一个优选的实施方案中，膜模拟物是脂质体。
本发明的GFET装置中昆虫气味受体复合物与沟道的偶联
在一个实施方案中，昆虫气味剂受体复合物与沟道中的石墨烯偶联。
昆虫气味受体复合物功能化
在一个实施方案中，昆虫气味剂受体复合物被功能化以促进与石墨烯的偶联。
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物用his标签功能化。
因此，在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物包含his标签。
在一个实施方案中，OrX蛋白包含his标签。
优选的是，his标签在OrX蛋白的N-末端处。
在另一个实施方案中，Orco蛋白包含his标签。
优选的是，his标签在Orco蛋白的N-末端处。
在另一个实施方案中，OrX和Orco蛋白二者均包含如上所述的his标签。
石墨烯功能化
在一个实施方案中，石墨烯被功能化以促进昆虫气味受体复合物的偶联。
在另一个实施方案中，石墨烯用1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PBASE)功能化。
偶联
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由his标签亲和结合与石墨烯偶联。
因此，在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过PBASE上的酯与昆虫气味受体复合物中蛋白质上的胺之间的相互作用与石墨烯偶联。这些胺存在于OrX和Orco两者上。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物通过PBASE上的酯与膜模拟物中脂质(POPC、POPE、POPS)上的胺之间的相互作用与石墨烯偶联。
分析物的检测
在另一个实施方案中，传感器能够检测分析物与昆虫OrX的结合。
在另一个实施方案中，传感器能够在环境中检测与昆虫OrX结合的分析物的存在。
优选的是，对分析物的检测是特异性的。
在另一个实施方案中，分析物与昆虫OR的结合使本发明的GFET装置沟道中的电源增益电流发生变化。
石英晶体微量天平(QCM)设备
优选的是，石英晶体微量天平(QCM)设备包括：
a)谐振器部件
b)振荡源部件
c)频率传感部件
谐振器部件
在一个实施方案中，所述谐振器部件是以下各项或由以下各项构成：压电材料、至少一种压电晶体和至少一种石英晶体。在一个优选的实施方案中，所述谐振器部件是石英晶体谐振器。
在一个实施方案中，所述石英晶体涂有金。
在一个实施方案中，所述谐振器部件具有与它的相对侧中的两个附接的电极。
在一个实施方案中，所述电极由金构成或涂有金。
在一个优选的实施方案中，所述谐振器部件与至少一个昆虫气味受体复合物处于电连通。
振荡源部件
在一个实施方案中，所述振荡源部件被配置成向所述谐振器部件施加交变电场。
在一个实施方案中，经由与谐振器部件的相对侧附接的电极施加交变电场。
频率传感部件
在一个实施方案中，所述频率传感部件被配置成测量谐振器部件的振荡频率。在一个实施方案中，所述频率传感部件被配置成测量谐振器部件的振荡频率的变化。
昆虫气味受体复合物的呈现
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物以能够响应于与分析物的相互作用而发生构象变化的形式存在。
在一个实施方案中，昆虫气味受体复合物存在于膜模拟物中。
顾名思义，膜模拟物模拟了天然膜，并且可以负载呈与体内发现的构象相同或相似的构象的受体。
所述膜模拟物可以选自脂质体、两亲化合物、洗涤剂胶束、纳米囊泡、脂质双层以及纳米盘。
优选的是，所述膜模拟物是人工的。
在一个优选的实施方案中，所述膜模拟物是脂质体。
在另一个实施方案中，所述膜模拟物是脂质双层。
在另一个实施方案中，所述膜模拟物是人工脂质双层。
用于在脂质体中重构昆虫受体的方法是本领域已知的28。
在谐振器部件上形成包含昆虫气味受体复合物的脂质双层
不希望受理论所束缚，申请人假定在一些实施方案中，当将脂质体中的昆虫气味受体复合物施用于工作电极时，所述脂质体改变结构以在谐振器部件上形成脂质双层。申请人假定昆虫气味受体复合物以与在体内细胞膜中发现的构象相似或相同的构象嵌入脂质双层中，以使得配体/分析物可进入受体的配体/分析物结合结构域。
不希望受理论所束缚，申请人假定在其它实施方案中，脂质体在与工作电极结合时保持为脂质体。这在图2中举例说明。
用于QCM的接头
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由接头与谐振器部件偶联。
在一个实施方案中，接头分子足够短以允许昆虫气味受体复合物与谐振器部件之间的电连通。
在另一个实施方案中，接头分子足够短以防止谐振器部件与昆虫气味受体复合物隔离。
在另一个实施方案中，所述接头分子选自16-巯基十六烷酸(16-MHDA)、6-巯基十六烷酸(6-MHDA)和6-巯基己酸(MHA)。
在一个优选的实施方案中，所述接头是6-巯基己酸(MHA)。
在另一个实施方案中，接头是自组装单层(SAM)的一部分。
因此，在一个实施方案中，所述SAM层由6-巯基己酸(MHA)构成。
在另一个实施方案中，在偶联昆虫气味受体复合物之前，进行MHA的羧基的活化。
优选的是，在使昆虫OrX与电极偶联之前，使用1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)和N-羟基丁二酰亚胺(NHS)的溶液进行MHA的羧基的活化。
分析物的检测
在另一个实施方案中，所述传感器能够检测分析物与昆虫气味受体复合物中的昆虫OrX的结合。
在另一个实施方案中，所述传感器能够在环境中检测与昆虫OrX结合的分析物的存在。
优选的是，对分析物的检测是特异性的。
在另一个实施方案中，分析物与昆虫OrX的结合使由向谐振器部件施加的交变电场引起的谐振器部件的谐振频率发生变化。
双层装置
在传感器装置的一个实施方案中，传感器包括：
膜模拟物，其包含两亲性分子、OrX蛋白和Orco蛋白。
第一基底，其包括设置在膜的第一侧的第一电极；和
第二基底，其包括设置在膜的第二侧的第二电极。
电特性
在一个实施方案中，电特性是电化学电位。在另一个实施方案中，电特性是电流。
双层传感器装置的电极
在一个实施方案中，基底是工作电极。在一个实施方案中，传感器还包括对电极。
在另一个实施方案中，传感器还包括参比电极。
在另一个实施方案中，电化学电池还包括恒电位仪。
在一个实施方案中，一个或多个电极由银构成或涂有银。
在传感器装置的双层中昆虫气味受体复合物的呈现
如上所述，优选将昆虫气味受体复合物置于膜模拟物中。
在另一个实施方案中，人造膜的第一侧接触包含第一介质的第一体积。
在另一个实施方案中，人造膜的第二侧接触包含第二介质的第二体积。第二介质可以与第一介质相同或不同。
优选的是，第一介质和/或第二介质是流体介质，优选液体介质。
第一介质和/或第二介质可以是亲水介质，优选是水性介质。
可替代的是，第一介质和/或第二介质可以是疏水介质。在该替代配置中，膜双层的两亲性分子的疏水基团与介质接触。
在另一个实施方案中，第一介质和/或第二介质包含溶液中的离子，优选水溶液中的离子；优选金属离子；优选第一或第二族金属离子。质子(H+)和K+、Na+、Ca2+离子是优选的。如果第一介质和第二介质中的离子都存在，则它们可以相同或不同。
在另一个实施方案中，第一体积和/或第二体积包含聚合物网络，所述聚合物网络可以与或可以不与双层直接接触。优选的是，聚合物网络包含水凝胶或由水凝胶组成。
在另一个实施方案中，第一体积包含直径为至少100nm，优选至少200nm的第一介质的液滴，和/或第二体积包含直径至少为100nm，优选至少200nm的第二介质的液滴。
在另一个实施方案中，第一体积和/或第二体积包含分别围绕第一介质或第二介质的两亲性分子层。第一介质和/或第二介质不必被完全包围。
在另一个实施方案中，两亲性分子层可以覆盖第一和/或第二体积的全部或部分。两亲性分子的层通常是单层。
因此，在优选的实施方案中，人造双层可以是形成的液滴界面双层，其中分别围绕第一和第二体积的两亲性分子层是接触的。在其他实施方案中，它可以是平面双层。
优选的是，膜包含两亲性分子，例如脂质分子。优选的是，两亲性分子包括磷脂分子。优选的脂质分子包括DPhPC(1,2-二植烷酰基-sn-甘油-3-磷酸胆碱)、POPS(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-L-丝氨酸)、POPC(1-棕榈酰基-2-油酰基-甘油-3-磷酸胆碱)、POPE(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸乙醇胺)、胆固醇、聚乙二醇(PEG)脂质、POPG(1-棕榈酰基-2-油酰基-sn-甘油-3-磷酸-(1'-rac-甘油))及其盐。
在另一个实施方案中，将膜以及第一体积(如果存在的话)和第二体积(如果存在的话)置于疏水介质中，优选其中疏水介质包含油。
在另一个实施方案中，OrX和Orco是离子移变膜蛋白。OrX和Orco蛋白一起形成复合物。在一些实施方案中，复合物在分析物存在下形成。
使用双层传感器检测分析物
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物形成对分析物的存在或不存在敏感的离子通道。
优选的是，检测对于分析物是特异性的。
在另一个实施方案中，分析物的结合活化了昆虫气味受体复合物，导致离子跨膜流动。
优选的是，第一电极与膜的第一侧电接触，第二电极与膜的第二侧电接触。
在另一个实施方案中，传感器包括控制系统，所述控制系统被配置为测量第一电极与第二电极之间的电特性，例如电流。
在另一个实施方案中，传感器还包括输出系统，其中指示系统被配置为指示已经检测到分析物。可以通过本领域已知的任何系统来指示分析物的检测，例如警报、电信号、图形用户界面等。指示系统还可以指示分析物的存在或不存在、分析物的浓度等。
传感方法
在另一个实施方案中，提供了使用本文公开的传感器检测分析物的方法，其中所述传感器包括：
a)包含两亲性分子、Orx蛋白和Orco蛋白的膜；
b)第一基底，其包括设置在膜的第一侧的第一电极；和
c)第二基底，其包括设置在膜的第二侧的第二电极；
其中，所述方法包括：
a)使所述分析物与所述膜接触；和
b)获得跨所述第一电极和第二电极的电测量结果。
分析物与昆虫气味受体复合物的接触导致离子流过由昆虫气味受体复合物形成的离子通道。在不受理论束缚的情况下，据信当分析物与OrX相互作用时，该通道对离子的渗透性发生改变。离子通过第一电极与第二电极之间离子通道的流动使电流在电极之间流动。
优选的是，所述方法包括检测在第一电极与第二电极之间流动的电流。电流水平指示离子通道的状态，并可以指示结合或结合的分析物种类。优选的是，电流的变化指示分析物的结合。
电流的变化可以测量为随时间的变化。此类测量可涉及一系列离散测量或连续测量。进行多次测量或连续测量使得能够检测更复杂的信号，所述复杂的信号经分解可以指示例如是否存在多种分析物。
在另一个实施方案中，所述方法包括任选的另外的步骤，包括：i)确定是否存在分析物，ii)确定存在哪种分析物，和/或iii)确定分析物的浓度。
在另一个实施方案中，所述方法在第一电极与第二电极之间施加电位。在一些实施方案中，电位可以为零。
在另一个实施方案中，所述方法包括检测通过由Orco和OrX蛋白形成的复合物的跨膜离子流动。
在另一个实施方案中，所述方法包括使分析物与膜接触，包括形成包含Orco蛋白、Orx蛋白和分析物的复合物。
在另一个实施方案中，所述方法包括检测分析物与Orco和Orx蛋白之间的相互作用。
在另一个实施方案中，膜的第一侧接触包含第一介质的第一体积，并且所述方法包括将分析物引入第一体积。
在另一个实施方案中，传感器是如本文所定义的传感器，并且其中所述方法包括获得跨各第一电极和第二电极的复合电测量结果，优选检测在第二电极与各第一电极之间流动的复合电流。
表面等离子体谐振(SPR)传感器设备
使用表面等离子体谐振(SPR)检测小的可溶性分析物是众所周知的(参见例如，"Advances in Biosensors-Vol 5.2003"Ed.Bansi D.Malhotra&Anthony P.F.Turner,Pub.Jai Press Ltd,London)。
表面等离子体(SP)是指沿着电介质(例如石英玻璃)与金属(例如银或金)之间的界面传播的相干电子振荡以及诸如光等电磁波。在某些条件下(由波长、极化和/或入射角限定)，金属表面的自由电子吸收入射光子并将其转换为表面等离子体波。当可见光子的频率与对抗金属带正电的核的回复力而振荡的表面电子的固有频率相匹配时，可以建立称为表面等离子体谐振(SPR)的谐振条件。
通过测量光的最小反射角(或最大吸收角)，表面等离子体谐振条件可用于检测分析物与偶联至金属表面的昆虫气味受体复合物的结合。例如，分析物与昆虫气味受体复合物的结合可以在金属表面引起扰动，进而可以引起SPR条件的改变。可以将这种改变作为基底反射率的变化进行测量，并形成一些基于SPR的测量技术的基础，这些测量技术适用于测量多种目标分子的存在。在传感器装置的一个实施方案中，基底是玻璃棱镜上的惰性金属表面。优选的是，金属表面是银或金的金属层。更优选的是，金属层的厚度可以为约50nm。
电特性
在一个实施方案中，电特性是表面等离子体谐振。
在SPR传感器装置中昆虫气味受体复合物的呈现
如上所述，昆虫气味受体复合物可以存在于膜模拟物中。
在一个实施方案中，昆虫气味剂受体复合物存在于脂质体例如人工脂质体或纳米盘中。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物存在于脂质双层，例如人工脂质双层中。
在一个优选的实施方案中，昆虫气味剂受体复合物存在于脂质体中。
昆虫气味受体复合物与SPR传感器设备中金属层的偶联
在一实施方案中，昆虫气味剂受体复合物与金属表面偶联。
在另一个实施方案中，昆虫气味受体复合物经由N-末端半胱氨酸残基与金属表面直接偶联。
使用SPR传感器检测分析物
在另一个实施方案中，传感器能够检测分析物与昆虫气味剂受体复合物中的昆虫OrX的结合。
在另一个实施方案中，传感器能够在环境中检测与昆虫OrX结合的分析物的存在。
优选的是，检测对于分析物是特异性的。
在另一个实施方案中，SPR传感器包括：
(a)结合了能够结合分析物的昆虫气味受体复合物的金属表面，
(b)用于在金属表面定向的光源激发光束，
(c)至少一个检测器，其能够检测来自光束、从金属表面被内部反射的光。
在另一个实施方案中，SPR传感器任选地包括光束调制工具，由此以受控的方式影响激发束，从而从传感器表面发射的光的水平被大大提高。
光束调制工具可以是可操作的，以相对于金属表面在一定角度范围内转移激发光束。激发位移工具可以包括光束反射镜和用于使所述镜振动的工具。激发光束可以包括线性光束、扇形光束或楔形光束。
或者，光束调制工具可以是可操作的，以便调节激发光束的波长。
在另一个实施方案中，分析物与昆虫OrX的结合导致传感器的折射率发生变化。优选的是，通过测量表面等离子体谐振角或谐振波长的转变来检测这种变化。
检测器部件
在另一个实施方案中，传感器包括检测器部件。
在另一实施方案中，检测器部件检测或测量激发光束的谐振波长的时变(以固定的谐振角)或以固定波长的谐振角的时移。
检测的灵敏度
如上文所述，本发明的传感器工作得出乎意料地好。申请人已经证实，本发明的传感器装置比涉及使用昆虫气味受体复合物的已知测定中的任一种都要显著更加灵敏。
在一个实施方案中，所述传感器可以检测以下浓度的分析物的存在：小于1×10- 3M，优选地小于1×10-3M，更优选地小于1×10-4M，更优选地小于1×10-5M，更优选地小于1×10-6M，更优选地小于1×10-7M，更优选地小于1×10-8M，更优选地小于1×10-9M，更优选地小于1×10-10M，更优选地小于1×10-11M，更优选地小于1×10-12M，更优选地小于1×10-13M，更优选地小于1×10-14M，更优选地小于1×10-15M，更优选地小于1×10-16M，更优选地小于1×10-17M，更优选地小于1×10-18M。
动态范围
在一个实施方案中，所述传感器具有用于检测至少2个，优选地至少3个，更优选地至少4个，更优选地至少5个，更优选地至少6个，更优选地至少7个，更优选地至少8个，更优选地至少9个，更优选地至少10个数量级的分析物浓度的分析物的动态范围。
本发明的传感器的其它优势
在便利性、便携性、稳定性、快速检测、灵敏度和易于测量方面，所述传感器或本发明相对于先前已知的基于昆虫OR的系统/测定提供了许多潜在优势。
分析物介质
所述分析物可以在气体或液体介质中。
任选的捕捉部件
所述传感器装置可以另外包括捕捉分析物并且向受体呈递分析物的部件。在一些实施方案中，该部件可用于捕捉挥发性分析物以向OrX呈递。这可能涉及使用微通道来处理液相或气相中的靶VOC(29)。微流体系统已经被设计成将靶分子在液相(30-31)和气相(31-33)中输送到传感器表面。
多重化(Multiplexing)
本发明考虑了在昆虫气味受体复合物中使用多种不同OrX蛋白的多重方法。以这种方式，用户可以构建对多种分析物灵敏的多重化装置。这样的多重化装置可以包括数十个、数百个或甚至数千个如本文所述的传感器。多重装置还可以包括与相同的昆虫气味受体复合物偶联的两个或更多个传感器以将“双重检查”引入到装置中。
本发明还考虑使用具有多个传感器基底的芯片，各所述传感器基底在昆虫气味受体复合物中各自包含不同的或相同的受体。本发明的传感器装置部件可以是这样的芯片。
使用本发明的传感器装置的方法
如上文所述，本发明提供了使用本发明的传感器装置来检测分析物和/或环境中分析物的存在的方法。
对照和校准
用户可以将装置的电特性与在所述装置暴露于对照、已知分析物或这两者时测量的相应电特性进行比较。用户还可以生成样品中一种或多种分析物的存在的估计值。这可以通过将在样品中观测到的电特性与对应于从对照或具有已知量的所关注的分析物的标准收集的数据点的该电特性的校准曲线进行比较来实现。以这种方式，用户可以估计已经与装置接触的样品中存在的分析物的浓度。
用户可以构建对应于装置暴露于一种或多种已知分析物的装置的一个或多个电特性的文库。举例来说，用户可以构建代表当装置暴露于各种浓度的分析物时观测到的电特性的结果的文库。
制造本发明的传感器装置的方法
传感器装置
在另一个方面，本发明提供了一种制造传感器装置的方法，所述方法包括以下步骤：在昆虫气味受体复合物与所述传感器装置的基底之间建立电连通，其中所述传感器装置被配置成检测所述基底的电特性的变化。
在一个实施方案中，所述方法包括使昆虫气味受体复合物与基底偶联的步骤。
在一个实施方案中，使昆虫气味受体复合物与基底偶联，之后将昆虫气味受体复合物偶联的基底组装到传感器装置中。
优选的是，所述传感器的部件、偶联和功能如本文所述。
传感器部件
在另一个方面，本发明提供了一种用于制造用于传感器装置的部件的方法，所述部件包括与如本文所限定的基底处于电连通的昆虫气味受体复合物。所述方法包括在昆虫气味受体复合物与基底之间建立电连通，如本文所述。该部件可用于添加到根据本发明的传感器装置中。
在另一个实施方案中，本发明提供了一种用于制造传感器装置的方法，所述方法包括将所述部件添加到其它部件中，如本文所述，以制造根据本发明的传感器装置。
制造本发明的EIS传感器装置的方法
在一个实施方案中，所述基底是如本文所述的电化学电池的工作电极。
因此，在一个实施方案中，方法包括在昆虫气味受体复合物与电化学电池的工作电极之间建立电连通的步骤，其中电化学电池被配置成检测所述工作电极的电化学阻抗的变化，从而形成所述传感器装置。
举例来说，用于制造本发明的EIS装置的合适方法描述于实施例部分中。该实施例不意图限制本发明的范围。
制造本发明的CNT-FET传感器装置的方法
在一个实施方案中，所述基底是如本文所述的CNT-FET设备的沟道。
因此，在一个实施方案中，方法包括在昆虫气味受体复合物与CNT-FET设备的沟道之间建立电连通的步骤，其中CNT-FET设备的沟道被配置成检测CNT-FET设备的源增益电流的变化，从而形成传感器装置。
举例来说，用于制造本发明的CNT-FET装置的合适方法描述于实施例部分中。该实施例不意图限制本发明的范围。
制造本发明的石墨烯FET(GFET)传感器装置的方法
在一个实施方案中，基底是如本文所述的GFET设备的沟道。
因此，在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：在昆虫气味受体复合物与GFET设备的沟道之间建立电连通，其中，GFET设备的沟道被配置为检测GFET设备的源增益电流的变化，从而形成传感器装置。
举例来说，在实施例部分中描述了用于制造本发明的GFET装置的合适方法。该实施例无意限制本发明的范围。
制造本发明的QCM传感器装置的方法
在一个实施方案中，所述基底是如本文所述的石英晶体微量天平(QCM)的谐振器部件。
因此，在一个实施方案中，方法包括在昆虫气味受体复合物与石英晶体微量天平(QCM)的谐振器部件之间建立电连通的步骤，其中QCM被配置成检测由向谐振器部件施加的交变电场引起的振荡的谐振频率的变化，从而形成传感器装置。
举例来说，用于制造本发明的QCM装置的合适方法描述于实施例部分中。该实施例不意图限制本发明的范围。
制造本发明的双层传感器装置的方法
在一个实施方案中，基底是本文所述的电化学电池的工作电极。
因此，在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：在昆虫气味受体复合物与电化学电池的工作电极之间建立电连通，其中，电化学电池被配置为检测工作电极与第二电极之间的电特性的变化，从而形成传感器装置。
举例来说，在实例部分中描述了用于制造本发明的双层装置的合适方法。该实施例无意限制本发明的范围。
制造本发明的SPR传感器装置的方法
在一个实施方案中，基底是如本文所述的棱镜上的惰性金属表面。
因此，在一个实施方案中，所述方法包括以下步骤：使昆虫气味受体复合物与金属表面偶联，其中，该装置被配置为检测基底折射率的变化，从而形成传感器装置。
举例来说，在实施例部分中描述了用于制造本发明的SPR装置的合适方法。该实施例无意限制本发明的范围。
一般定义和方法
OrX和Orco蛋白/多肽和片段
如本文所用的术语“多肽”包括任何长度的氨基酸链，但是优选地至少5个氨基酸，包括全长蛋白质，其中氨基酸残基通过共价肽键连接。用于本发明中的多肽优选地使用重组或合成技术部分或全部产生。
多肽的“片段”是多肽的子序列，其优选地发挥所述多肽的功能和/或提供所述多肽的三维结构。
如本文所用，OrX多肽的“功能片段”是OrX的子序列，其可以发挥结合分析物的功能并且在分析物结合时导致其形成了一部分的昆虫气味受体复合物的构象变化，其中所述构象变化引起与功能片段结合的基底的电特性的变化。在一个实施方案中，所述构象变化是昆虫气味受体复合物中离子通道的开放。
如本文所用，Orco多肽的“功能片段”是Orco的子序列，其可以发挥昆虫气味辅助受体功能，并且在分析物与昆虫气味受体复合物中的OrX结合时发生构象变化，其中所述构象变化引起与功能片段结合的基底的电特性发生变化。在一实施方案中，构象变化是昆虫气味受体复合物中离子通道的开放。术语“重组”指的是多核苷酸序列，其从在它的天然环境中围绕它的序列中去除和/或与在它的天然环境中不存在的序列重组。
“重组”多肽序列是通过从“重组”多核苷酸序列翻译而产生的。
变体
OrX或Orco多肽的变体指的是与特异性鉴定的序列不同的多肽序列，其中缺失、取代或添加一个或多个氨基酸残基。变体可以是天然存在的等位基因变体或非天然存在的变体。变体可以来自相同物种或其它物种并且可以包括同源物、旁系同源物和直系同源物。在某些实施方案中，所鉴定的多肽的变体具有与本发明的多肽或多肽相同或相似的生物活性。
优选的是，OrX多肽变体可以发挥结合分析物的功能，并且在结合时引起其形成了一部分的昆虫气味受体复合物的构象变化，其中所述构象变化引起与功能片段结合的基底的电特性发生变化。在一实施方案中，所述构象变化是昆虫气味受体复合物中离子通道的开放。
优选的是，OrX多肽变体可以发挥昆虫气味辅助受体的功能，并且在分析物与昆虫气味受体复合物中的OrX结合时发生构象变化，其中所述构象变化引起与功能片段结合的基底的电特性发生变化。在一实施方案中，构象变化是昆虫气味受体复合物中离子通道的开放。
变体多肽序列优选地表现出与本发明的序列至少70％，更优选地至少80％，更优选地至少90％，更优选地至少95％，更优选地至少96％，更优选地至少97％，更优选地至少98％，并且最优选地至少99％的同一性。同一性优选地在所鉴定的多肽的整个长度上计算。
多肽序列同一性可以通过以下方式确定。使用BLASTP(来自BLAST程序套件，第2.2.5版[2002年11月])在bl2seq中将主题多肽序列与候选多肽序列进行比较，所述BLASTP可从万维网上的NCBI网站ftp://ftp.ncbi.nih.gov/blast/公开获得。
多肽序列同一性也可以使用全局序列比对程序在候选多核苷酸序列与主题多核苷酸序列之间的重叠的整个长度上计算。如上文所述的EMBOSS-needle(可在http:/www.ebi.ac.uk/emboss/align/获得)和GAP(Huang,X.(1994),On Global SequenceAlignment(关于全局序列比对),Computer Applications in the Biosciences 10,227-235)也是用于计算多肽序列同一性的合适的全局序列比对程序。
用于计算多肽序列同一性％的优选方法是基于使用Clustal X比对待比较的序列(Jeanmougin等,1998,Trends Biochem.Sci.23,403-405)。
所述多肽序列的不显著改变它的生物活性的一个或几个氨基酸的保守取代也包括在本发明中。本领域技术人员将知晓进行表型沉默氨基酸取代的方法(参见例如Bowie等,1990,Science 247,1306)。
用于产生多肽的方法
用于本发明中的多肽，包括变体多肽，可以使用本领域公知的肽合成方法制备，例如使用固相技术的直接肽合成(例如Stewart等,1969,in Solid-Phase PeptideSynthesis(《固相肽合成》),加利福尼亚州旧金山的WH弗里曼公司(WH Freeman Co,SanFrancisco California))或自动化合成，例如使用Applied Biosystems 431A肽合成器(加利福尼亚州的福斯特城(Foster City,California))。在这样的合成期间也可以产生多肽的突变形式。
优选的是，如下所述，将多肽和变体多肽在合适的宿主细胞中重组表达并且从细胞中分离。用于表达多肽的多核苷酸可以方便地通过本领域技术人员公知的方法合成。所述多核苷酸序列可以是天然存在的或可以改编自天然存在的序列，例如通过针对其中重组表达序列的细胞使用优选的密码子。
用于产生构建体和载体的方法
用于本发明中的遗传构建体包含编码用于本发明中的OrX或Orco多肽的一个或多个多核苷酸序列，并且可以用于转化例如细菌、真菌、昆虫、哺乳动物或植物生物体。
用于产生和使用遗传构建体和载体的方法是本领域公知的并且一般描述于Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》),第2版,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),1987；Ausubel等,Current Protocols inMolecular Biology(《最新分子生物学方案》),格林出版社(Greene Publishing),1987中。
用于产生包含多核苷酸、构建体或载体的宿主细胞的方法
包含多核苷酸的宿主细胞可用于本领域公知的方法中(例如Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual(《分子克隆：实验室手册》),第2版,冷泉港出版社,1987；Ausubel等,Current Protocols in Molecular Biology(《最新分子生物学方案》),格林出版社,1987)以用于重组产生用于本发明中的多肽。这样的方法可以包括在适用于或有助于表达本发明的多肽的条件下在适当的培养基中培养宿主细胞。然后可以通过本领域公知的方法从介质、宿主细胞或培养基中分离可以任选地分泌到培养物中的表达的重组多肽(例如Deutscher编著,1990,Methods in Enzymology(《酶学方法》),第182卷,Guide to Protein Purification(《蛋白质纯化指南》))。
如本说明书中所用的术语‘包含’意指‘至少部分地由……组成’。当解释本说明书中包括术语‘包含’的每一个语句时，不同于以该术语开头的特征的那些特征也可以存在。相关术语，例如‘包含(comprise)’和‘包含(comprises)’将以相同方式解释。
意图在提到本文所公开的数值范围(例如1至10)时，还包括提到该范围内的所有有理数(例如1、1.1、2、3、3.9、4、5、6、6.5、7、8、9和10)以及该范围内有理数的任何范围(例如2至8、1.5至5.5和3.1至4.7)，并且因此，本文明确公开的所有范围的所有子范围在此被明确公开。这些只是具体意图的实例，并且所列举的最低值与最高值之间数值的所有可能的组合均被认为在本申请中以类似方式明确地陈述。
应当了解的是，选择性实施方案或配置可以包括在本说明书中示出、描述或提到的部分、要素或特征中的两个或更多个的任何或所有组合。
本发明也可以被广泛地认为在于本申请的说明书中单独或共同提到或指示的部分、要素和特征以及任何两个或更多个所述部分、要素或特征的任何或所有组合。
对于本发明相关领域的技术人员来说，将在不脱离如所附权利要求中所限定的本发明的范围的情况下想到本发明的结构的许多变化和广泛不同的实施方案和应用。本文中的公开内容和描述仅是说明性的而不意图在任何意义上具有限制性。在本文提到在本发明相关领域中具有已知等同方案的特定整体的情况下，这些已知的等同方案被认为并入本文中，如同单独阐述一般。
附图说明
参考所附的非限制性附图将更好地理解本发明，在所述附图中：
图1：昆虫OR膜复合物的示意图，其包含气味结合OrX亚基和Orco亚基以产生配体门控非选择性阳离子通道。橙色圆形代表结合的气味剂。
图2：EIS传感器制备的示意图，从电极清洁开始，继而形成SAM并且通过使脂质体共价连接到SAM层上来完成。从在三端电化学设置中进行的EIS测量获得电化学读数。带有蓝色图形的圆形代表与脂质体整合的昆虫OrX或OrX/Orco复合体，并且红色图形代表VOC配体。
图3分别示出了裸金表面、SAM改性的金表面、与NHS-EDC偶联的金表面和固定有Or22a/脂质体的金表面的AFM高度图像(a-d)、由高度图像上的标记线指示的粗糙度轮廓(e-h)和三维图像(i-l)。
图4.(A)Or10a脂质体功能化的电极相对于浓度为1aM至100μM的靶配体水杨酸甲酯(metsal)的阻抗变化。实验数据以符号表示，等效电路拟合曲线以实线表示。(B)用Or10a脂质体功能化的金电极响应于靶配体水杨酸甲酯和对照配体己酸甲酯的剂量响应曲线。还用空脂质体功能化的金电极进行靶配体和对照配体结合测量。使用四次重复的标准偏差生成误差棒。
图5.(A)Or10a/Orco脂质体功能化的电极相对于浓度为1aM至100μM的靶配体水杨酸甲酯(metsal)的阻抗变化。实验数据以符号表示，等效电路拟合曲线以实线表示。(B)用Or10a/Orco脂质体功能化的金电极响应于靶配体水杨酸甲酯的剂量响应曲线。还用空脂质体和Orco脂质体功能化的金电极进行靶配体结合测量，证明无效响应。使用四次重复的标准偏差生成误差棒。
图6.(A)Or22a脂质体功能化的电极相对于浓度为1aM至100μM的靶配体己酸甲酯(methex)的阻抗变化。实验数据以符号表示，等效电路拟合曲线以实线表示。(B)用Or22a脂质体功能化的金电极响应于靶配体己酸甲酯和对照配体水杨酸甲酯的剂量响应曲线。还用空脂质体功能化的金电极进行了靶配体和对照配体的结合测量。使用四次重复的标准偏差生成误差棒。
图7.(A)Or22a/Orco脂质体功能化的电极相对于浓度为1aM至100μM的靶配体己酸甲酯(methex)的阻抗变化。实验数据以符号表示，等效电路拟合曲线以实线表示。(B)用Or22a/Orco脂质体功能化的金电极响应于靶配体己酸甲酯的剂量响应曲线。还用空脂质体和Orco脂质体功能化的金电极进行靶配体结合测量，证明无效响应。使用四次重复的标准偏差生成误差棒。
图8.(A)脂质体中Or35a功能化的电极相对于浓度为1aM至100μM的靶配体E2-己烯醛的阻抗变化。实验数据以符号表示，等效电路拟合曲线以实线表示。(B)用Or35a脂质体功能化的金电极响应于靶配体E2-己烯醛和对照配体水杨酸甲酯的剂量响应曲线。还用空脂质体功能化的金电极进行了靶配体和对照配体的结合测量。使用四次重复的标准偏差生成误差棒。
图9.(A)脂质体中Or35a/Orco功能化的电极相对于浓度为1aM至100μM的靶配体E2-己烯醛的阻抗变化。实验数据以符号表示，等效电路拟合曲线以实线表示。B)用Or35a/Orco脂质体功能化的金电极响应于靶配体E2-己烯醛的剂量响应曲线。还用空脂质体和Orco脂质体功能化的金电极进行靶配体结合测量，证明无效响应。使用四次重复的标准偏差生成误差棒。
图10.(a)Or10a+/-Orco、(b)Or22a+/-Orco和(c)Or35a+/-Orco脂质体响应于靶标和对照配体的EIS剂量响应曲线的概要。所有三个剂量反应曲线均表明，Orco的存在导致每个OrX受体以更高的灵敏度结合其靶标化合物，从而使剂量响应曲线向左漂移。使用四次重复的标准偏差生成误差棒。
图11.(A)在进行SAM和NHS/EDC改性、Or10a脂质体(顶部)或Or10a/Orco脂质体(底部)固定，并随后结合靶配体水杨酸甲酯(metsal)时带有耗散的石英晶体微量天平(QCM-D)的频率变化。(B)显示了随着水杨酸甲酯浓度的增加(具有1％DMSO的缓冲液，1.6、8、20、40、100、200、500和1000μM)，对于Or10a脂质体(顶部)或Or10a/Orco脂质体(底部)固定的QCM-D传感器的频率变化的特写视图。(C)剂量响应曲线，显示了当暴露于Or10a脂质体或Or10a/Orco脂质体固定的金晶体时，检测到靶配体水杨酸甲酯和对照配体己酸甲酯(methex)。误差棒；使用两次重复生成标准差(SD)。
图12：在Si/SiO2基底上制造GFET涉及的关键步骤，(a)涂有石墨烯的Si/SiO2基底，(b)蚀刻不需要的石墨烯层(c)Si/SiO2基底上的石墨烯沟道，(d)电极沉积，和(e)电极封装。
图13：脂质体固定在石墨烯上的示意图：(a)使用π-π相互作用在石墨烯上的PBASE功能化(b)将PBASE功能化的CNT与脂质体一起孵育(c)使用亲核取代反应将脂质体与PBASE束缚在一起。
图14：固定在石墨烯沟道上的(a)Or10a脂质体，(b)Or10a/Orco脂质体，(c)Or22a脂质体，(d)Or22a/Orco脂质体，(e)空脂质体和(f)Orco脂质体的AFM图像。
图15：GFET装置示意图和传输特性。(a)在SiO2/Si基底上制造的FET的装置示意图和电路连接，其带有封装的源电极和漏电极，用于液栅测量。(对于CNT网络FET选择100mV的Vds，对于GFET选择1mV的Vds)。(b)Or10a脂质体、(c)Or10a/Orco脂质体、(d)Or22a脂质体、(e)Or22a/Orco脂质体、(f)空脂质体和(g)Orco脂质体功能化前(圆形)后(方形)实际GFET的转移特性曲线(对于所有测量，保持1mV的Vds)。
图16.在添加浓度渐增的靶配体(Or10a-水杨酸甲酯(MeSal)、Or22a–己酸甲酯(MeHex))的情况下，(a)Or10a和(b)Or22a、(c)Or10a+Orco和(d)Or22a+Orco脂质体固定的GFET传感器的归一化实时传感响应。
图17.使用(a)Or10a、(b)Or10a+Orco、(c)Or22a和(d)Or22a+Orco脂质体时，靶配体(Or10a-水杨酸甲酯(MeSal)、Or22a-己酸甲酯(MeHex)和对照配体(Or10a和Or22a-E2-己烯醛(E2Hex))的归一化剂量响应曲线。还显示了空脂质体(a,c)和仅Orco脂质体(b,d)缺乏对靶配体的响应。对于Or22a(e)和Or10a(f)，当脂质体中存在Orco时，可以看到它们各自的剂量响应曲线向左漂移。
图18.用于双层传感器设备的PMMA平台概述。(A)四室阵列设计。(B)沉积在原始PMMA形状的基底和操纵电极(蓝色)上的液滴(红色和绿色)之间的液滴界面双层(DIB)形成的示意图。PMMA形状显示为完全透明，以充分显示电极在该形状内的位置。
图19.来自含有(a)Or22a或(b)Or22a/Orco和10mM己酸甲酯(Or22a的已知活化剂)的液滴界面双层(DIB)的离子通道记录。在含1mg/ml DPhPC的1:1十一烷硅油混合物中的两个水滴之间形成DIB，并使用浮动电极装置测量离子通道的形成。如所示改变保持电位。对于上述试验，对于Na+的反转电位为46mM。以10kHz对数据进行采样并以0.8kHz过滤。
图20.来自含有Or22a/Orco和10μM己酸甲酯的液滴界面双层(DIB)的离子通道记录。在含有1mg/ml DPhPC的1:1十一烷硅油混合物中的两个水滴之间形成DIB，并使用浮动电极装置测量离子通道的形成。在本实验中，Na+的反转电位为46mV，保持电位为-100mV。数据以10kHz采样并以0.8kHz滤波。
图21.(A)来自含有Or71a、Orco和10μM 4-乙基愈创木酚(已知的Or71a激动剂)的液滴界面双层(DIB)的离子通道记录。如使用浮动电极装置所测量，在含有1mg/ml DPhPC的1:1十一烷硅油混合物中的两个水滴之间形成DIB。在此实验中，Na+的反转电位为-46mV。以10kHz对数据进行采样，并以0.8kHz过滤。(B)第二离子通道记录，如(A)中所述。
实施例1：用电阻抗谱法(EIS)举例说明本发明的传感器
本发明人得出的先前未公开的数据(导致PCT/IB2017/058181中描述的发明)表明，令人惊讶的是，OrX可以单独用于能够检测分析物特异性结合的电子传感器装置中，从而对现有技术的基于昆虫OR的传感器系统做出了显著改进。
本申请的数据表明，除了OrX之外，还包括Orco令人惊讶地提供了对现有技术的基于昆虫OR的传感器系统和申请人先前制造、形成PCT/IB2017/058181主题发明的基于OrX(单独)的电子传感器装置的进一步显著改进。
概要
申请人展示了使用昆虫OrX序列的方便、灵敏的传感器装置。两个OrX受体(Or10a、Or22a)19各自独立或与Orco一起嵌入脂质体中28，并在金电极上功能化，以在进一步优化的实验条件下进行EIS测量。从fM浓度开始，每个OrX功能化的金电极均显示出对其靶配体的明显电子响应(Or10a对水杨酸甲酯响应，Or22a对己酸甲酯响应)20。脂质体中Orco的存在对OrX响应具有累加或放大作用，从而提高了最大响应水平，并提高了OrX对其靶配体的灵敏度。通过测试每个OrX脂质体和OrX/Orco脂质体功能化的电极对非响应配体的响应，可以验证结合的特异性。为了进一步确保特异性，还测试了空脂质体功能化的金电极对靶配体的响应。
1.0 实验方法
1.1 材料
6-巯基己酸(MHA)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺)(EDC)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)片剂、水杨酸甲酯和己酸甲酯从西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)获得。从BASi购买了直径为1.6mm的金(Au)圆盘电极、盘绕铂(Pt)线电极和无泄漏银/氯化银(Ag/AgCl)电极，用于电化学测量。
1.2纯化的OrX和Orco亚基的制备
纯化程序是Carraher等201328中详述的程序的变体。为了对来自杆状病毒感染的Sf9细胞的蛋白质进行his标签亲和纯化，以0.1的MOI用杆状病毒感染500mL(2×106个/mL)，并且在27℃孵育72小时。通过在室温下以3800g离心10分钟来收集细胞沉淀物，然后重悬在40mL含有25U/mL的Benzonase(核酸酶)的重悬缓冲液A(20mM Tris/HCl(pH 7.5)、100mM NaCl、1×蛋白酶抑制剂混合物(德国罗氏诊断有限公司(Roche Diagnostics GmbH,Germany)))中，然后通过在10,000psi-15,000psi下在Emulsiflex C5乳化器(德国的Avestin公司)上通过两次来裂解。然后将样品以1000g离心5分钟以去除全细胞和细胞核。去除上清液并且在4℃以100,000g旋转1小时。将膜沉淀物重悬在40mL含有1％重量/体积的洗涤剂(Fos-胆碱14(FC14))的缓冲液A中，并且在室温下以10rpm旋转1小时。然后在18℃将样品以100,000g离心1小时。去除上清液并且加到1mL NiNTA柱(通用电气医疗公司(GEHealthcare))上。将柱在十倍柱体积的含有300mM NaCl和20mM咪唑的缓冲液B(20mM Tris/HCl(pH 7.5)、3.6mM FC-14)中洗涤，并且在另外十倍柱体积的含有100mM NaCl和50mM咪唑的缓冲液B中洗涤。用四倍柱体积的含有100mM NaCl和500mM咪唑的缓冲液B洗脱蛋白质。在考马斯染色的SDS-PAGE凝胶和蛋白质印迹上评估纯度。
使用最终的尺寸排阻色谱(SEC)步骤完成纯化。汇集来自NiNTA纯化的洗脱级分，并且以20,000g离心5分钟以去除聚集体和污染物。然后，将5mL样品注入到与Akta-Pure色谱系统(通用电气医疗公司)连接的Superdex 200 16/60柱(通用电气医疗公司)上。将样品在含有100mM NaCl的缓冲液B中以1mL/min运行，收集2mL级分并且使用100kDa MWCOVivaspin2过滤单元(德国哥廷根的赛多利斯公司(Sartorius,Goettingen Germany))浓缩并且储存在-80℃。
1.3脂质体结合的OR亚基的制备
使用磷脂溶液制备脂质体，所述磷脂溶液通过在N2气流下在小玻璃管中蒸发含有以下各项的溶液，然后在真空下干燥1小时而产生：5:3:3:1摩尔：摩尔比的磷脂酰乙醇胺(PE)、磷脂酰丝氨酸(PS)、磷脂酰胆碱(PC)和胆固醇(CH)。
通过涡旋5分钟将这些脂质重悬在1mL再水化缓冲液(10mM HEPES(pH 7.5)、300mMNaCl)中，继而在Microson超声细胞破碎仪(美国的Medisonic公司)上以20％功率超声处理5次，持续10秒-20秒，在每一个超声处理步骤之间将样品在冰上放置1分钟。为了促进脂质体的形成，通过将管从液氮转移到40℃水浴中进行10个冷冻/解冻步骤。
然后通过使用Avestin LiposoFAST挤出机单元(德国的Avestin公司)将脂质溶液通过100nm聚碳酸酯膜11次来对脂质体进行尺寸设定。以最终体积的10％添加甘油，并且将10mg/mL的等分试样在液氮中快速冷冻并储存在-80℃。
以与Geertsma等(2008)34的方案类似的方式将纯化的OrX和Orco亚基19重构到合成脂质体中。
在使用之前，将脂质体在冰上解冻，然后通过在室温下与0.2％CHAPS一起孵育15分钟来使其不稳定。然后，将200μg纯化的气味受体28添加到1mg脂质体中，并在室温下以10rpm旋转1小时。通过四次添加25mg的Bio-Beads SM-2(美国的伯乐公司(Bio-Rad,USA))并且分别在4℃孵育30分钟、2小时、过夜和再孵育2小时来去除过量的洗涤剂。在每个孵育期后去除Bio-Beads。通过以100,000g离心1小时使与OrX或OrX/Orco整合的脂质体沉淀，并且将其重悬在500μL再水化缓冲液中。使用Accudenz(美国的精准化工科技公司(AccurateChemical&Scientific Corporation,USA))通过密度梯度超速离心(DGU)来评估OrX和Orco于脂质体中的整合。通过添加等体积的80％Accudenz溶液使整合的脂质体达到40％Accudenz，将其放置在超速离心管的底部，并且用30％Accudenz溶液和DGU缓冲液(25mMHEPES(pH 7.5)、100mM NaCl、10％甘油)覆盖。然后将样品在4℃以100,000g离心4小时。脂质体由于密度低会在Accudenz DGU之后漂浮到梯度的顶部。
1.4电极制备
将金圆盘电极(1.6mm直径)在氧化铝抛光垫上用抛光氧化铝浆料抛光，对于每一个电极抛光1分钟。将抛光的电极用去离子水(Milli-Q，18.2MΩcm)冲洗，继而在乙醇(LR级)和去离子水中超声处理直到残留的氧化铝浆料从电极完全去除为止。在三端电化学电池(Ag/AgCl(3M NaCl，相对于SHE 0.209V)参比电极、作为对电极的盘绕铂线和作为工作电极的金圆盘)中使用PalmSens3恒电位仪，使用0.1M氢氧化钠(NaOH)电解质溶液，将计时安培分析法在-1.4V下施用到所有超声处理的电极上，持续30秒，以解吸电极表面上存在的硫醇的SAM。然后，将电极再次用去离子水冲洗并且连续在乙醇和去离子水中超声处理。最终，在0.5M硫酸(H2SO4)溶液中以50mV/s的扫描速率，在-0.2V与1.6V之间将循环伏安法进行10个循环以去除任何其它杂质(三电极电池，Ag/AgCl(在3M NaCl中，相对于SHE 0.209V)参比电极、作为对电极的盘绕铂线和作为工作电极的金圆盘)。
1.5自组装单层(SAM)的制备和活化
通过将1.36μl的MHA溶解在5ml乙醇(AR级)中来制备2mM MHA。将清洁的电极浸入MHA溶液中并孵育过夜。第二天，将所有电极用乙醇和去离子水充分洗涤以去除未反应的酸。在2ml PBS(pH值＝6.5)溶液中制备2:1摩尔比的EDC:NHS(100mM EDC、50mM NHS)。然后，在28℃将电极在该溶液中浸没1小时以活化MHA的羧基(COOH)。
1.6OrX和OrX/Orco结合脂质体在电极上的固定
通过将1片PBS浸入200ml milli-Q水中(根据制造商的说明书)来制备PBS溶液，并且使用0.2μm注射器式过滤器过滤。用pH计测量所制备的缓冲溶液的pH值。将OrX脂质体或OrX/Orco脂质体在PBS缓冲溶液(pH值＝7.4)中稀释100倍，并且在室温下将COOH活化的电极在该缓冲溶液中孵育1小时。然后，将电极用PBS缓冲溶液彻底洗涤以洗去任何未结合的脂质体。
1.7靶气味剂溶液的制备和孵育
使用PBS(pH值＝7.4)作为电解质进行电化学测量。在电化学测量之前将PBS缓冲液脱气约30分钟。通过在含有1％DMSO的PBS溶液中进行连续稀释，制备浓度为1aM-1μM的气味剂溶液。将OR固定的各电极在相关气味剂溶液中孵育约30分钟，并在进行EIS测量之前用PBS轻轻洗涤。
1.8电化学阻抗谱(EIS)测量
使用PalmSens恒电位仪，以-0.7的固定电压，在三电极电池中进行EIS测量，该三电极电池含有Ag/AgCl(3M NaCl，相对于SHE 0.209V)参比电极、作为对电极的盘绕铂线以及作为工作电极的金圆盘。使用脱气的PBS作为电解质。
2.0结果
昆虫嗅觉受体由与细胞膜中的Orco亚基复合的OrX亚基构成，产生一个离子通道(图1)17。在这项研究中，作者研究了Orco对嵌入脂质体中的OrX的配体结合活性的影响。图2呈现了实验程序，由以下组成：沉积6-巯基己酸(MHA)的自组装单层(SAM)，用N-羟基琥珀酰亚胺/1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(NHS/EDC)偶联活化-COOH端基，ORs/脂质体的共价连接以及通过EIS监测的靶气味分子的结合。将清洁的金表面与MHA孵育过夜，以构建具有羧酸端基的SAM，如图所示。通过将金表面暴露在EDC/NHS溶液中以形成N-羟基琥珀酰亚胺酯，进一步活化SAM的-COOH端基，然后其可以连接到生物分子上。最后，将电极用OrX/脂质体溶液孵育，使囊泡共价连接于金表面。
作者使用原子力显微术(AFM)验证了脂质体可以固定在金表面。图3表明，从裸金表面到OR结合脂质体固定表面，可以看到表面形态和粗糙度特征的变化。裸金表面(图3(a))显示了各种尺寸的密集堆积的扁平金纳米晶体，表面粗糙度约为2nm。在SAM改性(图3(b))和NHS/EDC活化SAM改性的金表面(图3(c))后，观察到的表面形态变化可忽略不计。当将OrX脂质体引入EDC/NHS活化的SAM改性的金表面时(图3(d))时，表面形态的变化是显著的，表明圆形脂质体固定在表面上。在整个表面上观察到天然形式的大小可变的圆形脂质体，即未观察到破裂或双层形成，这也表明OR被很好地保留在脂质体膜中。表面粗糙度值(>30nm)的大幅增加也表明，含有OR的脂质体已成功连接于NHS/EDC活化的SAM改性的金表面上。
在靶配体或对照配体以递增浓度(1aM至100μM)孵育前后，在用OrX脂质体(Or10a或Or22a)、OrX/Orco脂质体或空脂质体功能化的金电极上进行EIS测量。通过将传感器响应定义为相对于log[C(配体)]的-(ΔRp/Rop)，获得剂量响应曲线。图4a展示了当暴露于含有Or10a的各种浓度的已知靶配体之一即水杨酸甲酯的溶液时有关Or10a脂质体功能化传感器的奈奎斯特曲线(Nyquist plot)的EIS响应。奈奎斯特曲线显示，在添加浓度渐增的水杨酸甲酯后，EIS响应下降。通过绘制相对于对log[(配体)浓度]的极化电的变化阻-(ΔRp/Rop)作为传感器响应，获得剂量响应曲线(图4b)。在此，Rp是Or10a脂质体-靶相互作用后的极化电阻，Rop是Or10a脂质体-靶相互作用之前的极化电阻。Or10a脂质体传感器对水杨酸甲酯有响应，检测限(LOD)为0.1pM，对对照配体己酸甲酯的响应则可忽略不计。用空脂质体功能化的传感器对阳性配体和阴性配体表现出可忽略不计的响应，这表明OR是检测气味剂的关键要素。
图5a展示了Or10a/Orco脂质体功能化传感器在暴露于各种浓度的其靶配体即水杨酸甲酯后的EIS响应。图5b比较了Or10a/Orco脂质体与Or10脂质体、Orco脂质体和空脂质体的水杨酸甲酯剂量响应曲线。Or10a/Orco脂质体显示出比Or10a脂质体大的最大响应，并且还显示出更高的灵敏度，这反映在剂量响应曲线向左漂移和1fM的检测下限中。Orco脂质体和空脂质体都对水杨酸甲酯表现出可以忽略不计的响应。
作者研究了Orco对另一个示例性受体Or22a的影响。图6a展示了Or22a脂质体功能化传感器暴露于各种浓度的其靶配体之一己酸甲酯时的EIS响应。同样，在添加浓度渐增的己酸甲酯后，奈奎斯特曲线显示出EIS响应降低。剂量响应曲线(图6b)显示Or22a脂质体传感器对己酸甲酯有响应，检测限(LOD)为1fM，对对照配体水杨酸甲酯的响应则可以忽略。用空脂质体功能化的传感器对阳性配体和负性配体的响应可忽略不计，这表明OR是检测气味剂的关键要素。
图7a展示了Or22a/Orco脂质体功能化传感器暴露于各种浓度下的其靶配体己酸甲酯时的EIS响应。图7b比较了Or22a/Orco脂质体与Or22a脂质体、Orco脂质体和空脂质体的己酸甲酯剂量响应曲线。正如预期的那样，Or22a/Orco脂质体显示出比Or22a脂质体大的最大响应，并且也显示出更高的灵敏度，这再次反映在剂量响应曲线向左漂移和0.1fM的检测下限中。Orco脂质体和空脂质体都对己酸甲酯表现出可忽略不计的响应。
3.0讨论
申请人首先测试了不同的自组装单层(SAM层)，然后确定6-巯基己酸(MHA)作为将脂质体结合到金电极表面上的最佳长度的接头。以前，使用16-巯基十六烷酸(16-MHDA)来功能化金表面，并将脂质体结合到金电极上。该实验的结果未显示出高灵敏度，这表明脂质体距离电极表面太远而无法产生可检测信号。为了克服这一障碍，申请人改为使用较短的6-巯基己酸。申请人假定，这种较短的接头会在金与脂质体之间提供更快的电子转移，因此，可以以更灵敏的方式监测表面上发生的任何事件。对于将哺乳动物气味受体固定在粗细胞膜上的两篇论文，他们使用16-巯基十六烷酸(16-MHDA)35或6-巯基十六烷酸(6-MHDA)36来形成SAM。
比较数据显示，此处公开的昆虫OrX/Orco-EIS生物传感器模式比OrX-EIS生物传感器和已与昆虫气味受体一起使用的其他传感器模式更灵敏。表1总结了有关基于气味受体的装置的公开数据。本发明的装置提供的灵敏度是基于细胞的传感器的100-100,000倍。
表1：昆虫气味受体传感器装置数据的比较。
*表示已经根据在所引用的参考文献中的图表上绘制的剂量响应数据的目视评估估计了值。
表2总结了从细胞测定获得的数据。本发明的昆虫OrX-EIS传感器和OrX/Orco-EIS数据比在HEK293细胞和爪蟾卵母细胞中表达的OrX/Orco更灵敏。注意到在这些系统中，一些信息素受体(PR)表现出比正常气味受体低得多的灵敏度，这是可以预期的，因为这些受体针对它们的信息素靶分子受到精细调节。
表2：昆虫ORX/Orco细胞测定数据的概述。
*表示已经根据在图表上绘制的剂量响应数据的目视评估来估计值。
4.0结论
这项研究已经证明，在基于电子装置平台的嗅觉生物传感器中存在Orco的情况下提高了OrX的识别能力。与OrX脂质体相比，与Orco亚基一起嵌入在金电极上功能化的脂质体中的OrX显示出提高的灵敏度(低于fM)和最大响应。与空脂质体功能化电极的结果相比，未观察到对靶配体的明显阻抗响应。还通过测试对来自OrX脂质体功能化电极的对对照配体的响应，验证了每个OrX的特异性结合。
实施例2-用电阻抗谱法(EIS)进一步举例说明本发明的传感器
概要
申请人进一步证明使用另外的昆虫OrX序列的方便、灵敏的传感器装置。将Or35a19独自或与Orco一起嵌入脂质体中28，并在金电极上功能化，以与实施例1类似的方式进行EIS测量。如之前在实施例1中对Or10a和Or22a受体所见，脂质体中Orco的存在对Or35a响应具有累加或放大作用，从而提高了OrX对其靶配体的灵敏度。
1.实验方法
1.1材料
6-巯基己酸(MHA)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)片剂、水杨酸甲酯和己酸甲酯从西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)获得。1.6mm直径的金(Au)圆盘电极、盘绕铂(Pt)线电极和无泄漏银/氯化银(Ag/AgCl)电极购自BASi公司，用于电化学测量。
1.2纯化的Or35a和Orco亚基的制备
如实施例1第1.2节所述制备Or35a和Orco亚基。
1.3OR结合脂质体的制备
按照实施例1第1.3节所述制备Or35a脂质体，并进行以下改动：
在使用之前，将1mg脂质体(500μl，2mg/ml)在冰上解冻，然后通过在室温下与0.2％CHAPS一起孵育15分钟来使其去稳定化。然后添加50μg纯化的Or35a/Orco，并在室温下以10rpm旋转1小时。通过添加500mg Bio-Beads SM-2(美国的伯乐公司(Bio-Rad,USA))并在4℃下孵育过夜，去除过量洗涤剂。将管的两端刺穿，并通过在5000g下离心1分钟将Or35a/Orco整合的脂质体与Bio-Beads分离。将所有Or35a/Orco整合的脂质体样品通过Western blot进行分析，然后分装并保存在-80℃。使用Accudenz(Accurate Chemical&Scientific Corporation,USA)通过密度梯度超速离心(DGU)评估Or35a/Orco在脂质体中的整合。通过添加等体积的80％Accudenz溶液，将Or35a/Orco整合的脂质体引入40％Accudenz，置于超速离心管底部，并覆盖30％Accudenz溶液和DGU缓冲液(25mM HEPES pH7.5、100mM NaCl、10％甘油)。然后将样品在4℃下以100,000g离心4小时。脂质体由于密度低而在Accudenz DGU之后漂浮到梯度的顶部。
2.结果
申请人通过进行如实验1第2.0节所述的EIS测量，研究了Orco对嵌入脂质体中的Or35a的配体结合活性的影响。
图8a展示了当OR35a脂质体功能化传感器暴露于各种浓度的其靶配体之一E2-己烯醛时的EIS响应。再次，奈奎斯特曲线显示添加浓度渐增的E2己烯醛后EIS响应降低。剂量响应曲线(图8)显示，Or35a脂质体传感器对E2己烯醛有响应，检测限(LOD)为10fM，对对照配体水杨酸甲酯的响应可忽略不计。用空脂质体功能化的传感器对阳性配体和对照配体的的响应可忽略不计，这表明OR是检测气味剂的关键要素。
图9a展示了OR35a/Orco脂质体功能化传感器暴露于各种浓度的其靶配体E2-己烯醛时的EIS响应。图9b比较了Or35a/Orco脂质体与Or35a脂质体、Orco脂质体和空脂质体的E2-己烯醛剂量响应曲线。正如预期的那样，Or35a/Orco脂质体显示出比Or22a脂质体更大的最大响应，并且还显示出更高的灵敏度，这再次反映在剂量响应曲线向左漂移和0.1fM的检测下限中。Orco脂质体和空脂质体都对己酸甲酯表现出可忽略不计的响应。
图10清楚地总结了实施例1和2测试的基于OrX和OrX/Orco的EIS生物传感器的剂量响应曲线向左漂移。基于OrX和OrX/Orco的EIS生物传感器的剂量响应方程式、EC50和检测范围总结在表3中。对于在实施例1和实施例2中测试的受体，在Orco存在下，所得传感器以较低的LOD和EC 50值形式显示出传感器响应的改善。
表3.基于OrX和OrX/Orco的EIS生物传感器的剂量响应方程式、EC50和检测范围。
3.结论
这项研究表明，在基于电子装置平台的嗅觉生物传感器中存在Orco的情况下提高了Or35a的识别能力。与Or35a脂质体相比，与Orco亚基一起嵌入在金电极上功能化的脂质体中的Or35a显示出提高的灵敏度(低于fM)。与来自空脂质体功能化电极的结果相比，未观察到对靶配体的明显阻抗响应。还通过测试对来自Or35a脂质体功能化电极的对对照配体的响应，验证了Or35a的特异性结合。
实施例3–用石英晶体微量天平(QCM)压电换能器举例说明本发明的传感器
概要
申请人已经在存在和不存在Orco序列的情况下使用嵌入脂质体中的黑腹果蝇Or10a19序列产生了方便的压电传感器装置。带耗散监测的石英晶体微量天平(QCM-D)是一种质量敏感型压电传感器，其振荡频率随晶体上的质量负载而变化。通过用与QCM-D传感器偶联的Or10a脂质体和Or10a/Orco脂质体监测QCM-D传感器的振荡频率变化，检测Or10a与靶配体水杨酸甲酯之间的相互作用。发现Or10a/Orco脂质体比Or10a脂质体对水杨酸甲酯的响应更大。该结果表明，脂质体中Orco亚基的存在对OrX的响应具有累加响应，从而放大了其对配体结合的响应。通过测试与QCM-D传感器偶联的Or10a脂质体和Or10a/Orco脂质体对对照配体己酸甲酯的响应，验证了结合的特异性，而响应却可以忽略不计。
1.实验方法
1.1.材料
6-巯基己酸(MHA)、N-羟基丁二酰亚胺(NHS)、1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)、磷酸盐缓冲盐水(PBS)片剂和水杨酸甲酯从西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)获得。金(100nm)传感器晶体(QSX301)购自ATA Scientific Instruments。
1.2OR结合脂质体的制备
1.2.1纯化的OR亚基的制备
如实施例1第1.2节所述制备OR亚基。
1.2.2OR结合脂质体的制备
如实施例1第1.3节所述制备Or22a脂质体。
1.3石英晶体微量天平(QCM)的制备和数据收集
将金(100nm)传感器晶体各自分别在乙醇和Milli-Q水中超声处理15分钟。将5:1:1体积比的Milli-Q水、氨(25％)和过氧化氢(30％)加热到75℃，持续5分钟，然后将超声处理的晶体置于加热的溶液中，持续5分钟。然后从溶液中取出晶体，并用Milli-Q水冲洗，然后用氮气干燥。通过将清洁的金晶体暴露在2mM的MHA乙醇溶液中过夜，对其进行硫醇功能化，然后用乙醇溶液洗涤，以去除过量或松散结合的分子。使用在2ml PBS(pH＝6.5)溶液中2:1摩尔：摩尔比的EDC:NHS(100mM EDC，50mM NHS)来制备NHS/EDC。将每种OrX/脂质体原液在PBS缓冲液(pH＝7.4)中稀释100倍，用于QCM-D测量。然后将SAM功能化的晶体置于Q-sense分析仪(Biolin Scientific)室中，并与NHS/EDC、Or10a/脂质体或Or10a/Orco脂质体以及各种浓度的己酸甲酯(1.6μM、8μM、20μM、40μM、100μM、200μM、500μM和1000μM)在含有1％DMSO的PBS缓冲溶液中流动，以测量频率(Δf)和耗散ΔD)值的变化。
2.结果
图11(a)显示了SAM和NHS/EDC改性，然后将Or10a脂质体或Or10a/Orco脂质体固定在石英晶体上，然后结合了靶配体水杨酸甲酯后的频率变化。当晶体上发生结合事件时，这会导致质量增加，从而降低振荡频率53。因此，传感器的质量随着SAM、NHS/EDC和Or10a脂质体或Or10a/Orco固定而增加。然而，在水杨酸甲酯结合的情况下，观察到两种类型的脂质体的频率均增加(图11(b))。不希望受到理论的束缚，本发明人提出，传感器上的这种质量损失是由于水杨酸甲酯与Or10a受体的结合导致水和离子从Or10a脂质体内部释放所致，即Or10a正在形成功能性离子通道。同样，水杨酸甲酯与Or10a受体的结合导致水和离子从Or10a/Orco脂质体内部释放，即Or10a/Orco正在形成功能性离子通道。但是，Or10a/Orco脂质体表现出的频率变化大得多，表明Orco亚基正在放大来自Or10a亚基的响应。对两种脂质体的剂量响应曲线的比较表明，Or10a/Orco脂质体在较高的水杨酸甲酯浓度下作出的响应更强(图11c)。在这两种情况下，这种频率的增加随着己酸甲酯浓度在1.6至1000μM之间增加而发生，这表明水杨酸甲酯特异性结合Or10a受体，因为使用对照配体己酸甲酯未观察到这种频率的增加(图11c)。在相当于万亿分之一(ppt)浓度的μM水平对配体结合的检测与使用秀丽隐杆线虫(C.elegans)ODR-1054时观察到的检测相当。
3.结论
这项研究证明了在基于电子装置平台的嗅觉生物传感器中OrXs的识别能力。在石英晶体微量天平(QCM)压电传感器上功能化的脂质体中的OrX能够特异性检测其靶配体。OrX与Orco的组合显示出对它们的靶配体的更强响应，表明Orco对OrX对其配体的响应具有累加或放大作用。该响应是OrX特异性的，因为未观察到对对照配体的明显压电响应。OrX/Orco脂质体功能化的QCM具有特异性和灵敏地检测它们的靶配体的巨大前景。
实施例4–对具有石墨烯场效应晶体管(GFET)的传感器进行举例说明
概要
本申请人已经使用了在不存在和存在Orco的情况下嵌入脂质体中的黑腹果蝇Or10a和Or22a序列产生了方便的GFET传感器设备19。实验结果表明了利用GFET平台的昆虫OR的体外传感。从pM浓度开始，每个OrX功能化的GFET都对其靶配体显示出明显的电子响应(Or10a对水杨酸甲酯，Or22a对己酸甲酯)20。脂质体中Orco的存在对OrX响应具有累加或放大作用，从而提高OrX对其降低至fM浓度的靶配体的灵敏度。通过测试每个OrX脂质体和OrX/Orco脂质体功能化的GFET对非响应配体的响应，验证了结合的特异性。为了进一步确保特异性，还测试了空脂质体功能化的GFET对靶配体的响应。
1.实验方法
1.1材料
实验用的氮气(≤99.99％)和氧气(99.7％)购自新西兰BOC有限公司(BOClimited New Zealand)。所用去离子(DI)水(18.2MΩ)从Sartorius(611VF)DI水厂获得。对于GFET制造，从美国加利福尼亚州的Advanced Chemical Supplier购买了在300nmSiO2/p型Si基底上含有机械转移的CVD石墨烯的晶片。正性光刻胶AZ1518购自德国的Microchem；使用1-1-芘丁酸N-羟基琥珀酰亚胺酯(PBASE)(95％，西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich))作为分子接头，将OrX和OrX/Orco脂质体束缚在存在于GFET器件上的石墨烯表面。
1.2OR结合脂质体的制备
1.2.1纯化的OR亚基的制备
如实施例1第1.2节所述制备OR亚基。
1. 1.2.2OR结合脂质体的制备
如实施例1第1.3节所述制备OR脂质体。
1.3GFET传感器的制备
本研究中使用的GFET由在美国ACS Suppliers的300nm SiO2涂覆的Si基底上预沉积的石墨烯膜制造。FET由宽度为100μm、长度为40μm的沟道组成。图12示意性地说明了在Si/SiO2基底上制造GFET所涉及的关键步骤。源电极和漏电极通过光刻法来限定，并通过连续沉积Cr和Au形成。然后，使用AZ1518光刻胶封装漏电极和源电极，并且将宽度为100μm、长度为10μm的沟道对环境开放，以进行门控和功能化。
为了制造GFET，从美国加利福尼亚州的Advanced Chemical Supplier购买了在300nm SiO2/p型Si基底上含有机械转移的CVD石墨烯的晶片。首先将晶片切割成尺寸为12mm×12mm的正方形芯片。芯片用丙酮和IPA冲洗，以去除石墨烯表面上的污染物。然后使用Angstrom Engineering-Nex Dep 200蒸发器通过热蒸发进行比对标记沉积。将该装置安装在旋转台上，并加载铬和金金属源。镀铬钨棒(Kurt J.Lesker Company)用作铬源。将金丝条(99.99％，Kurt J.Lesker Company)加载到钨舟(Kurt J.Lesker Company)中，并加载到蒸发室中。将蒸发室抽真空至2×10-6mTorr，并依次蒸发5nm的铬和50nm的金。将蒸发室冷却并用氮气排气。通过将该装置在丙酮中浸泡10分钟，然后在IPA中洗涤，然后用氮气干燥，进行剥离。使用AZ1518光刻胶限定沟道区域，并使用200W氧等离子体在600mTorr下使用反应离子蚀刻机(Oxford Instruments，Plasmalab 80Plus)蚀刻芯片其余部分上的石墨烯膜1分钟。然后在通过光刻法限定顶接触(top contact)后，通过连续热蒸发5nm Cr和50nm Au沉积顶接触。电极由AZ 1518光刻胶封装。将封装的石墨烯FET在50W氧等离子体下在200mTorr压力和20SCCM氧气流量下清洁一分钟，以去除石墨烯沟道上的残留光刻胶。然后将该装置在电炉上于200℃硬烘烤10分钟，并在丙酮和IPA中洗涤，然后功能化。
1.4GFET上OrX和OrX/Orco脂质体的功能化
如图13所示，使用PBASE作为分子接头，经由非共价途径将OR脂质体功能化到石墨烯表面。用1x PBS(pH7.4)以1:10的比例稀释OR脂质体。将清洁的GFET浸入1mM PBASE甲醇溶液中，持续1小时。将该装置在甲醇中洗涤3次，然后在1x PBS中洗涤3次，以分别去除沟道中过量的PBASE和残留甲醇。用1x PBS(pH 7.4)将OR脂质体以1:10稀释，并将100μL的OR稀释液置于石墨烯沟道中，并在密闭的皮氏培养皿中于室温孵育1小时。在OR脂质体功能化之后，将该装置在1x PBS中洗涤10秒钟，然后进行测量。
使用桌面AFM(Nanosurf,NaioAFM)通过AFM验证OR脂质体在石墨烯表面的连接。使用轻敲模式在动态作用力下进行成像。OR脂质体功能化后的AFM图像在空气中进行。在DI水中洗涤功能化的石墨烯FET，并将过量的水排干。在成像之前，在氮气流下干燥功能化的装置。Gwydion(V.2.47)和SPIP软件包用于分析AFM图像。图14显示了固定在石墨烯表面上的Or10a、Or10a/Orco、Or22a、Or22a/Orco、空脂质体和Orco脂质体。本研究中使用的脂质体的平均大小估计为128±43nm。AFM图像证实，脂质体的球形结构在功能化后得以保留。
1.4OR脂质体GFET的电表征
使用如在图15(a)中示意的顶部液栅形态进行OR脂质体功能化GFET的电传感器测量。使用PDMS孔将电解质约束到沟道区域。使用Agilent4156C参数分析仪和带有显微操纵器的Rucker and Kolls探针台对装置进行电表征。Ag/AgCl标准电极用作液栅测量的栅电极。在Vds＝1mV下测量了不同石墨烯FET的转移特性(图15(b)至(g))，同时将液栅电压Vlg从-0.5V扫至1V，间隔为20mV。
1.5OR脂质体GFET传感器测量
将安装了PDMS孔的OR脂质体固定的GFET装置置于探针台上，并通过显微操纵器进行源电极和漏电极连接。将100μl含1％二甲基亚砜(DMSO)的PBS加入孔中，并将Ag/AgCl标准电极置于缓冲液中。因为配体在水性缓冲液中不稳定，因此通过将配体溶于DMSO中制备浓度为100mM的配体原液。将原液储存在4℃。通过在含1％DMSO的1x PBS缓冲液中稀释原液以将浓度设置为10fM至100pM，来制备用于传感的配体溶液。以三分钟的间隔将配体溶液添加到PDMS孔中，使终浓度为1fM到10pM。通过以1秒的间隔连续测量Ids来进行实时传感器测量。在整个测量过程中，经由Ag/AgCl参比电极，将栅电压Vlg保持在0V。
2.结果
测试了OR脂质体功能化GFET传感器的传感性能。具有或不具有辅助受体Orco的OR脂质体用于传感测试。通过固定Or10a、Or10a/Orco、Or22a和Or22a/Orco脂质体来制造四套传感器并进行测试。
针对阳性配体水杨酸甲酯测试了Or10a和Or10a/Orco脂质体传感器。针对阳性配体己酸甲酯测试了Or22a和Or22a/Orco脂质体传感器。还使用E2-己烯醛作为配体对照测试了这些传感器。针对水杨酸甲酯和己酸甲酯，测试了空脂质体和Orco脂质体功能化的GFET传感器的响应，作为对照。一式三份进行每个实验，以减少实验误差和测量误差。
图16显示了在添加浓度渐增的阳性配体情况下所有4种传感器的归一化的实时传感响应。其显示，具有和不具有Orco的每个基于脂质体的传感器都产生了对阳性配体而不是对照配体特异性的剂量依赖性响应。空脂质体或含有Orco的脂质体均不响应阳性配体，从而证实了选择性结合是由于OrX的存在所致。图17总结了Orco的存在对每个OrX对其阳性配体的响应的影响。Orco的存在会导致灵敏度提高，如通过其剂量响应曲线向左漂移以及其LOD从pM降至100fM来证明。表4总结了OrX和OrX/Orco组合的Ec50和检测范围。
表4.基于OrX和OrX/Orco的GFET生物传感器的剂量响应方程式、EC50和检测范围。
3.结论
这项研究已经表明，在基于GFET装置的嗅觉生物传感器中存在Orco的情况下提高了Or10和Or22a的灵敏度。与独自在脂质体中的受体相比，与Orco亚基一起嵌入在石墨烯上功能化的脂质体中的Or10a和Or22a两者均显示提高的灵敏度(fM)。与来自空脂质体和Orco脂质体功能化石墨烯的结果相比，未观察到对靶配体的明显电子响应。这证实，尽管Orco不直接参与配体结合，但它在脂质体中的存在进一步减弱了OrX对其靶配体的灵敏度。
实施例5–对具有液滴界面双层(DIB)的双层传感器装置进行举例说明
概要
申请人已经证明，功能性离子移变嗅觉受体(OR)已经加入蛋白脂质体中并且与人工双层融合，其中可以以电学方式测量气味剂的可逆结合。
1.实验方法
1.1材料
磷酸盐缓冲盐水(PBS)片剂、水杨酸甲酯和己酸甲酯从西格玛-奥德里奇公司(Sigma-Aldrich)获得。所有脂质均来自Avanti极性脂质。除非另有说明，否则所有其他化学药品均购自英国默克公司(Merk UK)。整个过程中使用双蒸馏“超纯水”(Millipore,Milli-Q:18.2MΩcm)。
1.2纯化的OrX和Orco亚基的制备
按照实施例1第1.2节中的描述制备OrX和Orco亚基，但进行以下改变：
膜沉淀物重悬后，将样品以100,000g在4℃而不是18℃离心1小时。
1.3OR结合脂质体的制备
如实施例1第1.3节所述制备OR结合脂质体，但进行以下改变：
过夜进行与Bio-Beads的孵育步骤。
1.4脂滴的制备
将DPhPC(Avanti,4ME 16:0PC)溶解在氯仿中并分装，然后在氮气流下干燥以形成薄脂膜。然后将薄脂膜在真空下的干燥器中放置14小时，然后将等分试样在<-20℃的氩气下保存。使用前，加入十一烷(英国默克公司(Merck,UK))以溶解脂质，制成10mg/ml的溶液。将溶液在AR20硅油(英国默克公司(Merck,UK))和十一烷中稀释(以使最终的AR20硅油十一烷比例为1:1)制成1mg/ml溶液。使用前，先使用0.22μm过滤器过滤十一烷和AR20硅油。
1.5电极制备
将银电极(0.5mm直径，>99％纯度，默克公司)切割成适当的长度，并用细砂纸制备，然后在次氯酸钠溶液(Fluka，UK)中孵育1小时。然后将电极在ddH2O中洗涤，然后再插入到电生理阵列孔中或固定在操纵器上。
1.6电生理阵列
使用计算机辅助设计软件(FreeCAD，https://www.freecadweb.org/)设计由聚(甲基丙烯酸甲酯)(PMMA)制成的多孔阵列，并使用减法计算机数控(CNC)机(RolandModela MDX-40A)研磨。图18显示了此PMMA平台的概述。(A)显示了阵列的4室设计。(B)显示了沉积在原始PMMA形状的基底和操纵电极(蓝色)上的液滴(红色和绿色)之间的DIB形成示意图。PMMA形状显示为完全透明，以充分显示该形状内电极的位置。
1.7电生理设置
在法拉第笼内使用Pico2(美国的特凯拉(Tecella,USA))放大器进行电生理记录。
1.8液滴界面双层形成
在形成于PMMA室内的两个液滴之间形成双层，所述PMMA室填充有十一烷和AR20硅油(1:1比例)中的1mg/ml的DPhPC。此过程的第一步是将50nl的液滴沉积到位于孔基底的银静止电极上。该液滴的组成为含有300mM NaCl的水溶液、10mM的HEPES(pH 7.4)，含有气味受体蛋白质于蛋白脂质体中(由蛋白脂质体制剂以1:20稀释)以及0.1-1μM的气味剂。将第二液滴滴到第二银电极上，该第二银电极使用YOU-3操纵器(日本成茂市(Narishige,Japan))固定在油和脂质混合物中。第二个液滴的总体积为50nl，含有50mM NaCl和10mMHEPES(pH 7.4)。两个液滴均使用0.5μl注射器(美国汉密尔顿(Hamilton,USA))沉积。为了确保在每个液滴周围形成稳定的磷脂单层，将液滴在电极上静置5分钟，然后使用YOU-3操纵器将其轻轻聚在一起。一旦液滴接触，就会在1分钟内自发形成双层(如通过视觉评估和双层电容的增加所确定，所述双层电容的增加使用Pico2放大器利用电容电压方案来测量)。有源沟道的插入取决于将电压保持在50mV时的电流变化。此过程最多需要45分钟。如果此时看不到插入，则放弃实验。在22.0±1.5℃下进行液滴界面双层实验。
1.9记录参数
使用带有内置数字化仪的Pico2或eONE-HS放大器(分别是美国的特凯拉(Tecella,USA)和意大利的Elements(Elements Italy))记录电流，该放大器以无间隙采集模式工作，采样频率为20kHz，使用0.8或1.5kHz低通滤波器。所有实验均使用电压钳方法进行。将跨膜电压保持在-200mV至200mV的各种电位下。
1.10手动数据分析
使用ANA(热那亚的Pusch博士(Dr Pusch,Genoa))、EDR(意大利的Elements(Elements,Italy))和WinWCP(Strathclyde大学的Dempster博士(Dr Dempster,University of Strathclyde))分析数据。当观察到的电流振幅逐步增加时，测量单沟道电流。在不同保持电位下测量电流时，基准电流可能处于不同水平。为了弥补这一点，通常的做法是相对于基准线给出电流变化。在保持电位低于电化学平衡值时，沟道开口显示为向下偏转。相反，当保持电位大于反转电位时，通道开口显示为从基线向上偏转。
2.结果
图19显示了，如使用浮动电极设置(参见图18)测量的、来自液滴界面双层(DIB)的离子通道记录，所述液滴界面双层(DIB)在含有1mg/ml DPhPC的1:1十一烷硅油混合物中在两个水性液滴之间形成。将仅含有Or22a(图19a)和含有Or22a/Orco(图19b)的蛋白脂质体与DIB融合，以允许插入受体亚基。所使用的溶液含有10mM HEPES(pH 7.4，NaOH)、300mMNaCl或50mM NaCl，并补充有10μM己酸甲酯即已知的Or22a激动剂。对于仅Or22a的DIB实验(图19a)，使保持电位在+/-150mV、+/-100mV和+/-50mV之间变化。在任何保持电位下均未观察到离子通道活性，这表明Or22a自身无法形成活性离子通道。对于Or22a/Orco DIB实验(图19b)，使保持电位在+/-100mV，+/-50mV和+/-25mV之间变化。在这种情况下，在+/-100mV、+/-50mV和-25mV处观察到离子通道活性，表明Or22a与Orco组合时可以形成活性配体门控离子通道。图20显示了在-100mV的保持电位下获得的第二个独立的Or22a/Orco DIB实验。在这种情况下，可能由于多个Or22a/Orco沟道复合物的插入，而确定了多个开放状态。
图21显示了如在0mV(图21a)和-100mV(图21b)的保持电位下使用浮动电极设置(参见图18)测量的、来自液滴界面双层(DIB)的两个离子通道记录，所述液滴界面双层(DIB)在含有1mg/ml DPhPC的1:1十一烷硅油混合物中的两个水性液滴之间形成。将含有Orco/Or71a的蛋白脂质体与DIB融合，以允许插入受体亚基。所使用的溶液含有10mM HEPES(pH 7.4,NaOH)、300mM NaCl或50mM NaCl，并补充有10μM靶配体即4-乙基愈创木酚。两个DIB实验均表明，在Orco存在的情况下，Or71a可以形成活性配体门控离子通道。
3.结论
这项研究进一步证实，Orco的存在影响基于电子装置平台的嗅觉生物传感器中OrX的灵敏度。在这种情况下，当将两个OrX(Or22a和Or71a)独立地与Orco亚基插入脂质双层时，两个OrX/Orco复合物在OrX的靶配体存在下均表现出离子通道活性。但是，在没有Orco的情况下，这种配体门控活性并未显示出来，从而突出了Orco在形成活性离子通道中的作用。该数据证明了在基于脂质双层的传感器装置中使用OrX/Orco复合物来基于其离子通道活性响应检测具体挥发性有机化合物的潜力。
实施例6-使用表面等离子体谐振成像举例说明传感器
概要
申请人描述了一种方便的SPRi传感器装置，该装置使用在不存在和存在Orco序列的情况下嵌入膜模拟物中的昆虫气味受体(OrX)亚基，所述膜模拟物包括脂质体和纳米盘。每个OrX功能化SPR传感器均显示对其靶配体的明显电子响应。膜模拟物中Orco的存在对OrX响应具有累加或放大作用，从而提高了OrX对其靶配体的灵敏度。通过测试每个OrX和OrX/Orco官能化的SPRi传感器对非响应配体的响应，验证了结合的特异性。
1.实验方法
1.2OR结合脂质体和纳米盘的制备
1.2.1纯化的OR亚基的制备
如实施例1第1.2节所述制备OrX和Orco亚基。OrX和Orco亚基在其N末端具有改造的半胱氨酸残基，从而使其与SPRi棱镜的金表面直接偶联。
1.2.2OR结合脂质体的制备
如实施例1第1.3节所述制备OrX和Orco脂质体。
1.2.3OR结合纳米盘的制备
使用由Bayburt等2010和200355,56改良的方案制备纳米盘。以MSP:蛋白质:脂质为1:0.2:150的比率形成纳米盘。从100mg/mL的原液中取出所需量的脂质，并在恒定的氮气流下干燥，然后在真空下进一步干燥过夜。将脂质重悬于所需体积的缓冲液(20mM Tris/HClpH 7.5、100mM NaCl、50mM胆酸钠)中，并进行超声处理，从而得到浓度为20mg/mL的透明脂质原液。将洗涤剂缓冲液中纯化的气味受体蛋白与MSP1E3D1和POPC脂质按所需比率混合，并在冰上孵育1小时。为了通过从系统中去除去污剂来开始重构，将Bio-Beads SM2(Bio-Rad#1523920)以1:1的重量:体积比添加到样品中，并将混合物在4℃下连续旋转孵育过夜。然后去除Bio-Beads，将合并的纳米盘在-80℃冷冻直至需要。
1.3OrX和OrX/Orco SPRi传感器的制备
根据Hurot等2019用来固定脊椎动物气味结合蛋白(OBP)的方案57，将脂质体或纳米盘中的OrX和OrX/Orco作为固定斑点(defined spot)固定在SPRi棱镜的金表面上。OrX和OrX/Orco复合物直接经由N末端半胱氨酸残基固定。固定以适当的密度进行，以确保脂质体或纳米盘在金表面上的自组装，从而产生脂质体或纳米盘单层。这可防止脂质体或纳米盘的其他无序层的形成，从而防止靶配体进入直接连接于金层上的OrX或OrX/Orco复合物的结合口袋中。获得完全覆盖金表面的单层，以阻止靶配体与金表面的非特异性结合。
1.4检测和分析通过OrX和OrX/Orco SPRi传感器的配体结合
使用合适的SPRi设备检测VOC与OrX和OrX/Orco脂质体或纳米盘的结合，并按Hurot等201957的描述进行分析。将OrX或OrX/Orco固定的金表面暴露于不同浓度(fM至nM)的靶配体或对照配体。配体结合被测量为与添加配体之前的基线相比的反射率变化。一式三份进行每个实验，以减少实验误差和测量误差。
2.结果
针对OrX亚基特异性阳性配体和OrX不应结合的对照配体测试OrX和OrX/Orco脂质体或纳米盘功能化SPRi传感器的传感性能。还针对阳性配体测试了空脂质体和Orco脂质体或空纳米盘和Orco纳米盘功能化SPRi传感器的响应。
在两种膜展示形式的情况下，OrX亚基自身与阳性配体灵敏地结合，从而产生剂量响应曲线，但对对照配体没有响应。当还存在Orco亚基时，预期Orco的存在会导致灵敏度增加，如通过其剂量响应曲线向左漂移和其LOD降低来证明。空脂质体和含有Orco的脂质体均不响应阳性配体，从而证实选择性结合是由于存在OrX所致。
3.结论
预期这项研究证明了在基于SPRi装置的嗅觉生物传感器中存在Orco时提高了OrX的灵敏度。相信，与单独的OrX受体相比，与Orco亚基一起嵌入在SPRi玻璃棱镜的金表面上功能化的脂质体或纳米盘中的OrX会显示出提高的灵敏度。分别与空脂质体或纳米盘和含有Orco的脂质体或纳米盘的结果相比，未观察到对靶配体的明显电子反应。预期这证实了，尽管Orco不直接参与配体结合，但它在脂质体中的存在进一步减弱了OrX对其靶配体的灵敏度。
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