一种测定柑橘木虱虫生真菌致病力的方法
阅读说明：本技术 一种测定柑橘木虱虫生真菌致病力的方法 (Method for determining pathogenicity of diaphorina citri endophytic fungi ) 是由 廖咏梅 黄桂香 黄元腾吉 朱文倩 黄世炎 白铭 于 2020-11-20 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种测定柑橘木虱虫生真菌致病力的方法,包含以下操作步骤：(1)虫生真菌孢子悬浮液的准备；(2)柑橘木虱的准备；(3)九里香的准备；(4)虫生真菌的致病力测定。本发明针对柑橘木虱喜爱九里香嫩梢的特点,通过透明塑料杯种植九里香幼苗,将接种虫生真菌后的柑橘木虱成虫倒入杯中,柑橘木虱可自行爬行到九里香嫩梢上取食,能较长时间维持柑橘木虱的活力；同时本发明所用的塑料杯体积小,便携、独立,能更加灵活地控制试验条件并观察试验结果,为实验室条件下研究柑橘木虱提供便利。(The invention discloses a method for determining pathogenicity of diaphorina citri endophytic fungi, which comprises the following operation steps: (1) preparing entomogenous fungi spore suspension; (2) preparing diaphorina citri; (3) preparing murraya paniculata; (4) and (3) determining the pathogenicity of the entomogenous fungi. According to the method, aiming at the characteristic that the murraya paniculata young tips are favored by the diaphorina citri, murraya paniculata seedlings are planted through the transparent plastic cup, the adult diaphorina citri inoculated with entomogenous fungi is poured into the cup, and the diaphorina citri can automatically climb to the murraya paniculata young tips to eat, so that the activity of the diaphorina citri can be maintained for a long time; meanwhile, the plastic cup used in the invention has small volume, is portable and independent, can more flexibly control the test conditions and observe the test results, and provides convenience for researching the diaphorina citri under the laboratory conditions.)
技术领域
本发明涉及柑橘木虱研究领域，具体地涉及一种测定柑橘木虱虫生真菌致病力的方法。
背景技术
柑橘木虱(Diaphorina citri Kuwayama)属于半翅目(Hemiptera)木虱科(Psyllidae)昆虫，具有刺吸式口器，主要以芸香科植物作为寄主。其若虫可以危害柑橘新梢，使新梢营养不良甚至枯萎，其若虫还可以大量排泄蜜露，诱发柑橘煤烟病，成虫通过飞翔扩散传播柑橘黄龙病。柑橘黄龙病由韧皮杆菌属(Liberobacter)候选亚洲韧皮杆菌(Candidatus Liberibacter asiaticus)引起，是一种侵染性病害，感染黄龙病的柑橘植株树势衰退，减产，甚至植株死亡。目前主要通过“三板斧”技术防治柑橘黄龙病，即种植无病苗、防治柑橘木虱、砍伐病树。防治柑橘木虱主要的方法是喷施化学药剂，但长期施用化学药剂容易引起柑橘木虱产生抗药性而导致柑橘木虱再猖獗、破坏果园生态平衡及因农药残留引起环境污染等问题。随着国家农业部农药、化肥施用量“双减”和“绿色植保”政策的贯彻落实，柑橘木虱生物防治的地位日趋显著。自然界中柑橘木虱除了多种动物天敌外，还有多种虫生真菌对柑橘木虱有致病的作用。
已报道的可侵染柑橘木虱的虫生真菌有宛氏拟青霉Paecilomyces varioti、玫烟色拟青霉Isaria fumosorosea、爪哇棒束孢Isaria javanica、球孢白僵菌Beauveriabassiana、金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae、桔形被毛孢Hirsutella citriformis、刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalliotae、渐狭蜡蚧菌Lecanicillium attenuatum等。自柑橘木虱上分离获得的虫生真菌，有体表腐生菌、致病菌及体内共生菌等，为了在分离获得的这些真菌中筛选对柑橘木虱有致病性的菌株，需将分离到的真菌接种到柑橘木虱成虫体表；由于柑橘木虱成虫个体小，难以观察接种虫生真菌后柑橘木虱的表现；同时，要获得准确的数据，必须保证未喷虫生真菌的对照柑橘木虱保持活力，那么柑橘木虱只有在活的寄主植株上正常取食才能保持活力。
九里香是一种芸香科灌木或小乔木，是柑橘木虱的重要寄主。因其抽梢能力强，枝叶鲜嫩，是科研工作中饲养柑橘木虱的理想寄主。如果用离体九里香枝条来饲养柑橘木虱，九里香枝条在离体条件下日渐衰弱，影响柑橘木虱的适口性，柑橘木虱会因缺乏营养而提早死亡，进而影响试验结果的准确性；如将九里香盆栽在养虫笼里来饲养柑橘木虱再接种虫生真菌，则因养虫笼内体积过大，而柑橘木虱个体太小，不易观察和统计柑橘木虱的死亡情况。
发明内容
本发明针对上述技术问题，发明一种测定柑橘木虱虫生真菌致病力的方法，旨在得到一种体积小且独立、便携，能更加灵活地控制试验条件并观察试验结果，为实验室条件下研究柑橘木虱虫生真菌的致病力提供便利的方法。
为实现上述目的，本发明提供的技术方案如下：
一种测定柑橘木虱虫生真菌致病力的方法，包含以下操作步骤：
(1)虫生真菌孢子悬浮液的准备：将供试真菌菌株在PDA培养基平板上培养，刮取菌丝及分生孢子，转移入含数粒玻璃珠的三角瓶中，倒入吐温-80溶液并充分震荡，用4层纱布过滤菌液，用血球计数板计数单位体积的分生孢子数量，换算出菌液的分生孢子浓度，根据试验需求，加入吐温-80溶液稀释，或将原液在4000×g下离心浓缩，获得目标浓度的分生孢子悬浮液，于4℃冰箱冷却待用；
(2)柑橘木虱的准备：在温室里种植九里香，繁殖柑橘木虱，用自封袋捕捉柑橘木虱成虫，每个自封袋装入柑橘木虱成虫30头，将装有柑橘木虱成虫的自封袋置于15℃左右的泡沫盒内使其低温麻痹；
(3)九里香的准备：将具有成熟叶片数5-7张的2株九里香幼苗用基质固定于杯底带孔的杯子中，固定九里香幼苗后，在基质表面覆盖浅色吸水纸并压实，利用浅色吸水纸与柑橘木虱成虫褐色体色的色差，以便观察和统计自九里香上掉落的柑橘木虱成虫，并防止柑橘木虱成虫因掉入基质空隙中而不易被发现；将定植好九里香的杯子放置在直径为9cm的一次性培养皿托盘中，将清水或改良版霍格兰营养液放入一次性培养皿托盘中，所述清水或改良版霍格兰营养液通过所述杯底的孔浸润到所述基质中，再通过基质间形成的毛细管作用传导至基质上表面，即得九里香种植杯；
(4)虫生真菌的致病力测定：将碎冰块放入杯子中，碎冰覆盖至杯口以下0.5cm，用双层纱布覆盖杯口并将纱布向下按压使之形成网兜状，将步骤(2)中在低温麻痹的柑橘木虱成虫倒进网兜状的纱布中，将步骤(1)中待用的虫生真菌的分生孢子悬浮液喷洒到柑橘木虱体表至体表充分湿润进行接种，以喷施吐温-80溶液作为对照，喷洒处理完成后，迅速将纱布取出并倒扣于步骤(3)中所得九里香种植杯的杯口上，用橡皮筋固定纱布，于室温放置30min，使柑橘木虱成虫恢复活力，并晾干柑橘木虱虫体上多余的分生孢子悬浮液或吐温-80溶液，待柑橘木虱成虫完全离开纱布分散到九里香苗之后，移走杯口上的纱布，用直径9cm的一次性培养皿盖扣于杯口，并在培养皿盖上插1个圆孔，以保持气体交换并在有盖状态下维持杯内的空气相对湿度在95％以上，将装有柑橘木虱成虫的九里香种植杯放置在温度27℃，光周期12D:12L，空气相对湿度70％-85％的环境中，接种后48h后移走培养皿盖，改用两层纱布包扎九里香种植杯的杯口，使杯内空气流通，湿度下降，避免高湿度影响柑橘木虱的正常活动，使柑橘木虱和九里香均可正常存活，每24h观察柑橘木虱成虫的死亡情况，连续观察记录10d，以柑橘木虱掉落侧躺，或受到刺激后触角不动记为死亡，及时挑取死亡的柑橘木虱进行保湿处理，观察体表是否有接种的虫生真菌产生。
优选地，步骤(1)中所述的培养为置于27℃恒温培养箱中培养10d。
优选地，步骤(1)、步骤(4)中所述的吐温-80溶液的质量浓度皆为0.1％。
优选地，步骤(2)中柑橘木虱成虫放入15℃温度下低温麻痹。
优选地，步骤(3)中所述的基质为珍珠岩：蛭石＝1:4的体积比混匀而成，总体积120mL-130mL。
优选地，步骤(3)中在装基质之前用烧红的金属条，在所述塑料杯底钻三个直径0.3cm的小孔用于渗水，即得杯底带孔的杯子；所述杯子口径为8cm、高度为13.5cm的透明聚丙烯塑料杯。
优选地，步骤(3)中所述的浅色吸水纸为白色吸水纸。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明针对柑橘木虱喜爱九里香嫩梢的特点，通过透明塑料杯种植九里香幼苗，将接种虫生真菌后的柑橘木虱成虫倒入杯中，柑橘木虱可自行爬行到九里香嫩梢上取食，能较长时间维持柑橘木虱的活力；同时本发明所用的塑料杯体积小，便携、独立，能更加灵活地控制试验条件并观察试验结果，为实验室条件下研究柑橘木虱提供便利。
附图说明
图1是喷雾处理后的柑橘木虱成虫采用本发明实施例1方法饲养图片。
图2是不同处理组采用本发明实施例1方法饲养柑橘木虱成虫的观察；其中，A为喷洒质量浓度为0.1％的吐温-80溶液的对照组(CK)，B为喷洒虫生真菌刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalloitae LJLZJ菌株的分生孢子悬浮液(浓度为5×107个孢子/mL)，C为喷洒虫生真菌棒曲霉Aspergillus clavatus BQM菌株的分生孢子悬浮液(浓度为5×107个孢子/mL)，D为喷洒虫生真菌淡紫紫孢霉Purpureocillium lilacinum DZZBM菌株的分生孢子悬浮液(浓度为5×107个孢子/mL)。
图3为不同处理组采用本发明实施例1方法饲养柑橘木虱成虫逐日平均死亡头数曲线图；其中，BQM曲线为棒曲霉Aspergillus clavatus BQM菌株；LJLZJ曲线为刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalloitae LJLZJ菌株；DZZBM曲线为淡紫紫孢霉Purpureocilliumlilacinum DZZBM菌株；CK曲线为未喷虫生真菌的对照。
具体实施方式
下面结合附图具体实施方式进行详细描述，但应当理解本发明的保护范围并不受具体实施方式的限制。实施例中采用的原料、试剂、菌株若无特殊说明，皆为市售所得。实施例中营养液为改良版霍格兰营养，为市售所得。
实施例1中使用的九里香幼苗的获得：采集成熟的九里香种子，以营养基质为载体在育苗盘中育苗，种子上覆盖1cm-2cm厚的营养基质，在种子破土前保持基质湿润，在25℃-30℃条件下，播种后8d-10d种子即破土。待幼苗长至高度7cm-9cm，叶片数5-7张、有1-2条幼嫩复叶叶柄后即可移栽。
实施例1
一种测定柑橘木虱虫生真菌致病力的方法，具体操作步骤如下：
(1)虫生真菌孢子悬浮液的准备：将供试3种虫生真菌(刀孢蜡蚧菌Lecanicilliumpsalloitae、淡紫紫孢霉Purpureocillium lilacinum和棒曲霉Aspergillus clavatus)的菌株在PDA培养基平板上，置于27℃恒温培养箱中培养10d，刮取菌丝及分生孢子，转移入含数粒玻璃珠的三角瓶中，倒入100mL质量浓度为0.1％的吐温-80溶液并充分震荡，用4层纱布过滤菌液，用血球计数板计数单位体积的分生孢子数量，换算出菌液的分生孢子浓度，根据试验需求，加入适量质量浓度为0.1％的吐温-80溶液稀释，获得浓度为5×107个孢子/mL的分生孢子悬浮液，于4℃冰箱冷却待用；
(2)柑橘木虱的准备：在温室里种植九里香，繁殖柑橘木虱，用自封袋捕捉柑橘木虱成虫，每个自封袋装入柑橘木虱成虫30头，将装有柑橘木虱成虫的自封袋置于装有冰块、温度为15℃左右的泡沫盒中使其低温麻痹；
(3)九里香的准备：将上述具有成熟叶片数5-7张的2株九里香幼苗用基质(珍珠岩：蛭石＝1:4的体积比混匀而成)固定于口径为8cm、高度为13.5cm的透明聚丙烯塑料杯中，装基质之前用烧红的金属条，在塑料杯底钻三个直径0.3cm的小孔用于渗水，固定九里香幼苗后，在基质表面覆盖白色吸水纸并压实，利用白色吸水纸与柑橘木虱成虫褐色体色的色差，以便观察和统计自九里香上掉落的柑橘木虱成虫，并防止柑橘木虱成虫因掉入基质空隙中而不易被发现；将定植好九里香的塑料杯放置在直径为9cm的一次性培养皿托盘中，将清水或改良版霍格兰营养液放入一次性培养皿托盘中(加在九里香种植杯底部的培养皿托盘中，可通过杯底的小孔及基质的毛细管作用，为九里香提供养分和水分，保证九里香在塑料杯中健康生长，还可以避免打开杯口来浇水或营养液引起柑橘木虱成虫的逃逸问题)，通过透明种植杯的底部小孔浸润到基质中，再通过基质间形成的毛细管作用传导至基质上表面，即得九里香种植杯；
(4)虫生真菌的致病力测定：将碎冰块放入口径8cm、深度13.5cm的塑料杯中，碎冰覆盖至杯口以下0.5cm，用双层纱布覆盖杯口并将纱布向下按压使之形成网兜状，将步骤(2)中在装有冰块、温度为15℃左右的泡沫盒中低温麻痹的柑橘木虱成虫倒进网兜状的纱布中(柑橘木虱在装有冰块、温度为15℃左右的泡沫盒中进行低温麻痹，置于冰上接种虫生真菌，所处温度变化有渐进过程，柑橘木虱易于恢复活力)，用手持喷瓶将步骤(1)中待用的虫生真菌的分生孢子悬浮液喷洒到柑橘木虱体表至体表充分湿润进行接种，以喷施质量浓度为0.1％的吐温-80溶液作为对照，喷洒处理完成后，迅速将纱布取出并倒扣于步骤(3)中所得九里种植杯的杯口上，用橡皮筋固定纱布，于室温放置30min，使柑橘木虱成虫恢复活力，并晾干柑橘木虱虫体上多余的分生孢子悬浮液或吐温-80溶液，待柑橘木虱成虫完全离开纱布分散到九里香苗之后，移走杯口上的纱布，用直径9cm的一次性培养皿盖扣于杯口，并在培养皿盖中央插1个圆孔，以保持气体交换并在有盖状态下维持杯内的空气相对湿度在95％以上，将装有柑橘木虱成虫的九里香种植杯放置在温度27℃，光周期12D:12L，空气相对湿度70％-85％的恒温光照培养箱中(如图1所示)，接种后48h后移走培养皿盖，改用两层纱布包扎九里香种植杯的杯口，使杯内空气流通，湿度下降，避免高湿度影响柑橘木虱的正常活动，使柑橘木虱和九里香均可正常存活，每24h观察柑橘木虱成虫的死亡情况，连续观察记录10d，以柑橘木虱掉落侧躺，或受到刺激后触角不动记为死亡(如图2所示)，及时挑取死亡的柑橘木虱进行保湿处理，观察体表是否有接种的虫生真菌产生。结果如表1，接种虫生真菌后柑橘木虱逐日死亡情况见图3。一个处理三个重复，一个重复30头柑橘木虱。
表1三种柑橘木虱虫生真菌对柑橘木虱的致病力测定
*1.以新复极差法计算不同处理间在显著性水平P＝0.05下的差异显著性，字母相同的处理间差异不显著，字母不同的处理间差异显著。
2.校正死亡率的计算公式为：
校正死亡率(％)＝[(处理死亡率-对照死亡率)/(1-对照死亡率)]×100
表1可见，本发明可以有效测定不同种类的虫生真菌对柑橘木虱的致病力，处理后10d，未喷虫生真菌的对照组柑橘木虱仍维持高的存活率，平均死亡率只有4.44％，符合常规毒力试验中对照组死亡率不得高于20％的要求；不同种类的虫生真菌的致病力差异显著，其中刀孢蜡蚧菌Lecanicillium psalloitae的致病力强，接种后4d的平均死亡率达到100％，淡紫紫孢霉Purpureocillium lilacinum的致病力中等，接种后10d的平均死亡率为44.33％，棒曲霉Aspergillus clavatus无致病力，接种后10d的平均死亡率仅为2.22％。
由于本发明方法所用的透明塑料杯体积小，便携独立，可以轻松控制试验条件，如温度、光照等；由于固定基质上铺设白色吸水纸，既可以防止柑橘木虱进入基质，同时又可以与柑橘木虱形成色差，而透明杯体更便于观察杯中的柑橘木虱情况；杯底钻有小孔，在培养皿托盘中加入清水或营养液，利用基质间孔隙的毛细管作用可以实现免揭纱布加水肥、避免柑橘木虱逃逸的目的。
前述对本发明的具体示例性实施方案的描述是为了说明和例证的目的。这些描述并非想将本发明限定为所公开的精确形式，并且很显然，根据上述教导，可以进行很多改变和变化。对示例性实施例进行选择和描述的目的在于解释本发明的特定原理及其实际应用，从而使得本领域的技术人员能够实现并利用本发明的各种不同的示例性实施方案以及各种不同的选择和改变。本发明的范围意在由权利要求书及其等同形式所限定。
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