一种低共熔溶剂提取结合大孔树脂纯化银杏叶中黄酮类化合物的方法
阅读说明：本技术 一种低共熔溶剂提取结合大孔树脂纯化银杏叶中黄酮类化合物的方法 (Method for extracting flavonoid compounds from ginkgo leaves by combining eutectic solvent with macroporous resin purification ) 是由 金君素 李吉超 于 2019-08-31 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种利用低共熔溶剂结合大孔树脂高效提取纯化银杏叶中黄酮类化合物的方法。针对目前工业上多采用60％乙醇提取银杏叶中黄酮工艺中存在的提取率低、流程繁琐、有机溶剂损失严重、溶剂易燃易爆等问题,开发了一种以胆碱类低共熔溶剂水溶液为提取剂,在一定的超声条件下从银杏叶中高效提取黄酮类化合物,结合大孔树脂纯化的方法,最后制备含量为24％以上的黄酮类化合物,本发明的优点是：与传统提取剂相比,低共熔溶剂不挥发、不易燃、损失少,该方法操作简便、提取率高、具有广泛的工业化应用前景。(The invention provides a method for efficiently extracting and purifying flavonoid compounds in ginkgo leaves by combining a eutectic solvent with macroporous resin. Aiming at the problems of low extraction rate, complicated flow, serious loss of organic solvent, inflammable and explosive solvent and the like existing in the process of extracting flavone from ginkgo leaves by adopting 60% ethanol in the prior industry, the invention develops a method for efficiently extracting flavonoid compounds from ginkgo leaves by taking choline eutectic solvent aqueous solution as an extracting agent under certain ultrasonic conditions and finally preparing the flavonoid compounds with the content of more than 24% by combining a macroporous resin purification method, and the method has the advantages that: compared with the traditional extractant, the eutectic solvent is non-volatile, non-flammable and less in loss, and the method is simple and convenient to operate, high in extraction rate and wide in industrial application prospect.)
技术领域
本发明涉及中药提取领域，更具体的说是涉及一种低共熔溶剂提取结合大孔树脂纯化银杏叶中黄酮类化合物的方法。
背景技术
银杏在医学上的使用最早可追溯到1596年李时珍所撰写的《本草纲目》，中医药上认为银杏叶具有活血化瘀、疏通脉络的疗效，在现代医疗主要应用于治疗心脑血管疾病，从银杏叶中提取有效成分始于20世纪，德国Schwabe公司研发的产品EGB761及其标准的制备方法一直延续到现在，目前已从银杏叶中分离得到140多种化学成分，其中黄酮类化合物作为黄酮类化合物中主要成分具有显著的生理活性，所以如何提高银杏叶中黄酮类化合物的提取效率是银杏产业的关键。
银杏叶中各类物质的极性不同，所以其在溶液中的溶解性存在了一定的差异。按照提取剂的种类，可将从银杏叶中提取黄酮类化合物的方法分为有机溶剂法、超(亚)临界CO2法和酶提取法。为了除去银杏叶中的脂溶性杂质如烷基酚、叶绿素，并且最大可能性的将银杏黄酮提取出来常使用一些极性较大的溶剂如水、甲醇、乙醇、丙酮或是它们的混合溶剂进行提取，该方法也是目前工业上广泛应用的提取技术，如李新舟等人以乙醇水溶液作为提取银杏叶中黄酮类化合物的最佳提取剂，参见：李新舟等,化学与生物工程,2014,31(03):31-34.专利CN106822194A中采用了60％乙醇溶液作为提取剂并结合索氏提取法在最优条件下的提取率仅为75％；有机溶剂提取的方法易于工业化，但所使用的溶剂挥发性强，易燃、易爆，存在一定的安全隐患，提取率相对较低，工业上一般分为2-4次提取，操作繁琐。超(亚)临界流体技术目前已被广泛的应用于植物组分的提取，如赵琦君等人确定了在35MPa的条件下用超临界CO2提取银杏叶中黄酮类化合物的方法，参见：赵琦君,江西林业科技,2009,36(03):27-28，该方法使用的溶剂绿色安全但对设备要求高。酶提取法利用纤维素酶在一定条件下分解银杏叶的纤维素和半纤维素，破坏细胞结构，使有效成分溶出，如张小清等研究了酶法与溶剂提取相结合提取银杏叶中活性成分银杏黄酮的工艺条件，参见：张小清,应用化工,2005,34(10):48-49，该方法主要的缺陷是酶在提取过程易失活且难以回收，成本昂贵。低共熔溶剂是一类由氢键供体和氢键受体构成的混合物，对天然产物中的有效成分有较强的溶解能力，所以近些年来将低共熔溶剂结合其他方法辅助萃取生物活性成分的研究开始逐渐展开，如专利CN108619202A中报道了一种低共熔溶剂提取，大孔树脂分离纯化牛蒡叶中黄酮类化合物的方法，可以分离富集有效成分；专利CN104887723A中报道了三元低共熔溶剂氯化胆碱-乙二醇-草酸结合超声辅助提取银杏叶中总黄酮的方法；专利CN107789376A中报道了采用亲水低共熔溶剂体系：氯化胆碱-乙酰丙酸-丙二酸和疏水低共熔溶剂体系甲基三辛基氯化铵-辛醇-辛酸同时提取银杏叶中多种有效成分的方法，总黄酮提取率为77.72％；专利CN107312047A中报道了用含低共熔溶剂的酒精水溶液提取再用混合大孔树脂梯度洗脱的方法可以从红景天中同步分离制备红景天苷和络塞维。
综上所述，相对于传统有机溶剂，低共熔溶剂作为一种新型的提取剂，对中草药中黄酮类化合物有较好的提取效果，本发明提供了一种低共熔溶剂提取结合大孔树脂纯化银杏叶中黄酮类化合物的方法可以充分提取银杏叶中黄酮类化合物并分离纯化，实现了资源的有效利用。
发明内容
本发明针对目前存在的上述问题，开发一种低共熔溶剂提取结合大孔树脂纯化银杏叶中黄酮类化合物的绿色化工工艺，所使用的提取剂不挥发，不易燃，再生容易，提取率高于传统有机溶剂，且整个工艺操作简便，周期短，易于工业化。
本发明的技术方案：一种低共熔溶剂提取结合大孔树脂纯化银杏叶中黄酮类化合物的方法，以银杏叶粉为原料，加入低共熔溶剂水溶液，在超声条件下强化提取黄酮类化合物，包括以下步骤：
1)将氯化胆与多元醇按照摩尔比为1:1-1:6在60℃加热的条件下进行合成至无色均一的胆碱类低共熔溶剂。
2)将干燥的银杏叶粉碎，过60目筛备用，提取剂为含水体积10％-60％的低共熔溶剂水溶液，将银杏叶粉与低共熔溶剂水溶液按1g:5mL-40mL混合均匀，在超声功率为250W，温度50℃-90℃条件下，提取10min-40min，离心取得上层银杏黄酮粗提液。提取液经盐酸水解之后过0.45μm微孔滤膜，用高效液相色谱仪测定槲皮素、山奈酚、异鼠李素峰面积，参考2015版《中国药典》计算总黄酮提取率。
3)0.5BV-3BV体积的提取液经过树脂柱吸附后，用0.5BV-2BV体积的5％-30％乙醇溶液洗脱除杂，再用体积为0.5BV-2BV的60％-95％乙醇溶液洗脱得到黄酮类化合物溶液，干燥后得到黄酮类化合物。
步骤1)中所述合成胆碱类低共熔溶剂所用的多元醇为乙二醇、1,2-丙二醇、丙三醇、1,3-丁二醇、1,4-丁二醇、1,2-戊二醇、1,5-戊二醇、二乙二醇、三乙二醇中的一种。
本发明的优点是：所使用的提取剂不挥发，不易燃，损失小，再生容易，操作简便，在最优条件下一次提取率达95％以上，工业上常用的60％乙醇溶剂一次提取率为75％-90％，低共熔溶剂的提取率高于传统有机溶剂，操作简单，易于工业化，可代替传统有机溶剂用于银杏黄酮类化合物的高效提取，而且提取液通过大孔树脂纯化后得到的黄酮类化合物含量高于24％，满足2015版《中国药典》中对银杏叶提取物中黄酮类化合物含量的要求。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步的阐述，但并不意味着对本发明保护范围的限制。
实施例1：
一种低共熔溶剂提取结合大孔树脂纯化银杏叶中黄酮类化合物的方法，包括以下步骤：
1)将一定质量的氯化胆碱和1,3-丁二醇按1:3摩尔比混合，在60℃下加热1h合成低共熔溶剂备用。
2)取过60目筛后的银杏叶粉末1g，加入6.4mL制备好的低共熔溶剂和1.6mL水混合均匀，在功率为250W温度为60℃条件下超声提取20min，提取液经过4000rpm离心分离10min后得到银杏黄酮提取液。将提取液经过盐酸水解后过0.45μm微孔滤膜，用高效液相色谱仪测定槲皮素、山奈酚、异鼠李素峰面积，参考2015版《中国药典》计算得总黄酮提取率为71.3％。
3)将干重为5g的AB-8大孔树脂装柱，加入2BV步骤2)的提取液以0.5mL每分钟进行动态吸附，吸附过后的树脂首先用过量的水冲洗除去附着在树脂上的低共熔溶剂，用2BV质量分数为20％的乙醇溶液洗脱除杂，之后用2.5BV质量分数为60％的乙醇溶液洗脱银杏黄酮，得到的银杏黄酮洗脱液经过干燥得到黄酮类化合物粉末59.1mg，经盐酸水解之后过0.45μm微孔滤膜用高效液相色谱仪测定参考2015版《中国药典》计算得其含量为25.37％。
实施例2：
一种低共熔溶剂提取结合大孔树脂纯化银杏叶中黄酮类化合物的方法，包括以下步骤：
1)将一定质量的氯化胆碱和乙二醇按1:4摩尔比混合，在60℃下加热1h合成低共熔溶剂备用。
2)取过60目筛后的银杏叶粉末1g，加入16mL制备好的低共熔溶剂和4mL水混合均匀，在功率为250W温度为60℃条件下超声提取20min，提取液经过4000rpm离心分离10min后得到银杏黄酮提取液。将提取液经过盐酸水解后过0.45μm微孔滤膜，用高效液相色谱仪测定槲皮素、山奈酚、异鼠李素峰面积，参考2015版《中国药典》计算得总黄酮提取率为93.3％。
3)将干重为5g的AB-8大孔树脂装柱，加入2.5BV步骤2)的提取液以0.5mL每分钟进行动态吸附，吸附过后的树脂首先用过量的水冲洗除去附着在树脂上的低共熔溶剂，用2BV质量分数为20％的乙醇溶液洗脱除杂，之后用3BV质量分数为90％的乙醇溶液洗脱银杏黄酮，得到的银杏黄酮洗脱液经过干燥得到黄酮类化合物粉末82.7mg，经盐酸水解之后过0.45μm微孔滤膜用高效液相色谱仪测定参考2015版《中国药典》计算得其含量为28.04％。
实施例3：
一种低共熔溶剂提取结合大孔树脂纯化银杏叶中黄酮类化合物的方法，包括以下步骤：
1)将一定质量的氯化胆碱和乙二醇按1:4摩尔比混合，在60℃下加热1h合成低共熔溶剂备用。
2)取过60目筛后的银杏叶粉末1g，加入12mL制备好的低共熔溶剂和3mL水混合均匀，在功率为250W温度为60℃条件下超声提取30min，提取液经过4000rpm离心分离10min后得到银杏黄酮提取液。将提取液经过盐酸水解后过0.45μm微孔滤膜，用高效液相色谱仪测定槲皮素、山奈酚、异鼠李素峰面积，参考2015版《中国药典》计算得总黄酮提取率为94.7％。
3)将干重为5g的D101大孔树脂装柱，加入2BV步骤2)的提取液以0.5mL每分钟进行动态吸附，吸附过后的树脂首先用过量的水冲洗除去附着在树脂上的低共熔溶剂，用2BV质量分数为20％的乙醇溶液洗脱除杂，之后用2.5BV质量分数为60％的乙醇溶液洗脱银杏黄酮，得到的银杏黄酮洗脱液经过干燥得到黄酮类化合物粉末76.8mg，经盐酸水解之后过0.45μm微孔滤膜用高效液相色谱仪测定参考2015版《中国药典》计算得其含量为26.21％。
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