具体实施方式

本发明人经过广泛而深入地研究，首次意外地发现一类抗PD-1纳米抗体，实验结果表明，本发明的纳米抗体与PD-1分子有较好的结合活性，同时能够阻断PD-1与PD-L1的相互作用，具有良好的抗肿瘤活性。在此基础上完成了本发明。

具体地，本发明利用人源的PD-1抗原蛋白免疫骆驼，获得高质量的免疫纳米抗体基因文库。然后将PD-1蛋白分子偶联在酶标板上，展示PD-1蛋白的正确空间结构，以此形式的抗原利用噬菌体展示技术筛选免疫纳米抗体基因库(骆驼重链抗体噬菌体展示基因库)，从而获得了PD-1特异性的纳米抗体基因。再将此基因转至哺乳动物细胞中，从而获得了能在哺乳动物细胞中高效表达的的纳米抗体株。然后通过ELISA、流式细胞术、荧光素酶报告基因检测系统等方法鉴定出具有阻断活性的PD-1纳米抗体，通过小鼠肿瘤模型验证该候选抗体具有显著的抗肿瘤活性。

术语

为了可以更容易地理解本公开，首先定义某些术语。如本申请中所使用的，除非本文另有明确规定，否则以下术语中的每一个应具有下面给出的含义。在整个申请中阐述了其它定义。

如本文所用，术语“本发明的纳米抗体”、“PD-1抗体”、“PD-1纳米抗体”具有相同的含义，均指特异性识别和结合于PD-1(包括人PD-1)的纳米抗体。优选地，本发明的纳米抗体的可变区具有SEQ ID NO:1所示的CDR1、SEQ ID NO:2所示的CDR2、和SEQ ID NO:3所示的CDR3。更优选地，本发明的纳米抗体的框架区具有(a)SEQ ID NO:4所示的FR1、SEQ ID NO:5所示的FR2、SEQ ID NO:6所示的FR3、和SEQ ID NO:7所示的FR4，或(b)SEQ ID NO:10所示的FR1、SEQ ID NO:11所示的FR2、SEQ ID NO:12所示的FR3、和SEQ ID NO:13所示的FR4。

如本文所用，术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白，其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连，而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。存在两种类型的轻链，λ(l)和κ(k)。存在五种主要的重链种类(或同型)，其决定抗体分子的功能活性：IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。每种链包含不同的序列结构域。轻链包括两个结构域或区，可变结构域(VL)和恒定结构域(CL)。重链包括四个结构域，重链可变区(VH)和三个恒定区(CH1、CH2和CH3，统称为CH)。轻链(VL)和重链(VH)的可变区都决定对抗原的结合识别和特异性。轻链的恒定结构域(CL)和重链的恒定区(CH)赋予重要的生物性质如抗体链结合、分泌、经胎盘的移动性、补体结合和与Fc受体(FcR)的结合。Fv片段是免疫球蛋白Fab片段的N-末端部分且由一条轻链和一条重链的可变部分组成。抗体的特异性取决于抗体结合位点和抗原决定区间的结构互补。抗体结合位点由主要来自高度可变区或互补决定区(CDR)的残基组成。偶尔，来自非高度可变或框架区(FR)的残基影响整体结构域结构且进而影响结合位点。互补决定区或CDR指共同限定结合亲和力和天然免疫球蛋白结合位点天然Fv区的特异性的氨基酸序列。免疫球蛋白的轻链和重链各具有三个CDR，分另称为CDR1-L、CDR2-L、CDR3-L和CDR1-H、CDR2-H、CDR3-H。常规抗体抗原结合位点因此包括六个CDR，包含来自每个重链和轻链v区的CDR集合。

如本文所用，术语“纳米抗体VHH”、“纳米抗体nanobody”具有相同的含义，指克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)，它是具有完整功能的最小的抗原结合片段。通常先获得天然缺失轻链和重链恒定区1(CH1)的抗体后，再克隆抗体重链的可变区，构建仅由一个重链可变区组成的纳米抗体(VHH)。

如本文所用，术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同，它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而，可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区，它们大致上呈-折叠构型，由形成连接环的三个CDR相连，在某些情况下可形成部分折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I，647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合，但是它们表现出不同的效应功能，例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。

如本文所用，术语“框架区”(FR)指插入CDR间的氨基酸序列，即指在单一物种中不同的免疫球蛋白间相对保守的免疫球蛋白的轻链和重链可变区的那些部分。免疫球蛋白的轻链和重链各具有四个FR，分别称为FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。相应地，轻链可变结构域可因此称作(FR1-L)-(CDR1-L)-(FR2-L)-(CDR2-L)-(FR3-L)-(CDR3-L)-(FR4-L)且重链可变结构域可因此表示为(FR1-H)-(CDR1-H)-(FR2-H)-(CDR2-H)-(FR3-H)-(CDR3-H)-(FR4-H)。优选地，本发明的FR是人抗体FR或其衍生物，所述人抗体FR的衍生物与天然存在的人抗体FR基本相同，即序列同一性达到85％、90％、95％、96％、97％、98％或99％。

获知CDR的氨基酸序列，本领域的技术人员可轻易确定框架区FR1-L、FR2-L、FR3-L、FR4-L和/或FR1-H、FR2-H、FR3-H、FR4-H。

如本文所用，术语″人框架区″是与天然存在的人抗体的框架区基本相同的(约85％或更多，具体地90％、95％、97％、99％或100％)框架区。

如本文所用，术语“亲和力”理论上通过完整抗体和抗原间的平衡缔合来定义。本发明纳米抗体的亲和力可以通过KD值(解离常数)(或其它测定方式)进行评估或测定，例如生物膜层干涉技术(Bio-layer interferometry BLI)，使用FortebioRed96仪器测量确定。

如本领域技术人员所知，免疫偶联物及融合表达产物包括：药物、毒素、细胞因子(cytokine)、放射性核素、酶和其他诊断或治疗分子与本发明的抗体或其片段结合而形成的偶联物。本发明还包括与所述的抗PD-1纳米抗体或其片段结合的细胞表面标记物或抗原。

如本文所用，术语“重链可变区”与“V_H”可互换使用。

如本文所用，术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链可变区包括三个互补决定区CDR1、CDR2、和CDR3。

在本发明的一个优选的实施方式中，所述抗体的重链包括上述重链可变区和重链恒定区。

在本发明中，术语“本发明抗体”、“本发明蛋白”、或“本发明多肽”可互换使用，都指特异性结合PD-1蛋白的多肽，例如具有重链可变区的蛋白或多肽。它们可含有或不含起始甲硫氨酸。

本发明还提供了具有本发明抗体的其他蛋白质或融合表达产物。具体地，本发明包括具有含可变区的重链的任何蛋白质或蛋白质偶联物及融合表达产物(即免疫偶联物及融合表达产物)，只要该可变区与本发明抗体的重链可变区相同或至少90％同源性，较佳地至少95％同源性。

一般，抗体的抗原结合特性可由位于重链可变区的3个特定的区域来描述，称为可变区域(CDR)，将该段间隔成4个框架区域(FR)，4个FR的氨基酸序列相对比较保守，不直接参与结合反应。这些CDR形成环状结构，通过其间的FR形成的β折叠在空间结构上相互靠近，重链上的CDR和相应轻链上的CDR构成了抗体的抗原结合位点。可以通过比较同类型的抗体的氨基酸序列来确定是哪些氨基酸构成了FR或CDR区域。

本发明抗体的重链的可变区特别令人感兴趣，因为它们中至少部分涉及结合抗原。因此，本发明包括那些具有带CDR的抗体重链可变区的分子，只要其CDR与此处鉴定的CDR具有90％以上(较佳地95％以上，最佳地98％以上)的同源性。

本发明不仅包括完整的抗体，还包括具有免疫活性的抗体的片段或抗体与其他序列形成的融合蛋白。因此，本发明还包括所述抗体的片段、衍生物和类似物。

如本文所用，术语“片段”、“衍生物”和“类似物”是指基本上保持本发明抗体相同的生物学功能或活性的多肽。本发明的多肽片段、衍生物或类似物可以是(i)有一个或多个保守或非保守性氨基酸残基(优选保守性氨基酸残基)被取代的多肽，而这样的取代的氨基酸残基可以是也可以不是由遗传密码编码的，或(ii)在一个或多个氨基酸残基中具有取代基团的多肽，或(iii)成熟多肽与另一个化合物(比如延长多肽半衰期的化合物，例如聚乙二醇)融合所形成的多肽，或(iv)附加的氨基酸序列融合到此多肽序列而形成的多肽(如前导序列或分泌序列或用来纯化此多肽的序列或蛋白原序列，或与6His标签形成的融合蛋白)。根据本文的教导，这些片段、衍生物和类似物属于本领域熟练技术人员公知的范围。

本发明抗体指具有PD-1蛋白结合活性的、包括上述CDR区的多肽。该术语还包括具有与本发明抗体相同功能的、包含上述CDR区的多肽的变异形式。这些变异形式包括(但并不限于)：一个或多个(通常为1-50个，较佳地1-30个，更佳地1-20个，最佳地1-10个)氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一个或数个(通常为20个以内，较佳地为10个以内，更佳地为5个以内)氨基酸。例如，在本领域中，用性能相近或相似的氨基酸进行取代时，通常不会改变蛋白质的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一个或数个氨基酸通常也不会改变蛋白质的功能。该术语还包括本发明抗体的活性片段和活性衍生物。

该多肽的变异形式包括：同源序列、保守性变异体、等位变异体、天然突变体、诱导突变体、在高或低的严紧度条件下能与本发明抗体的编码DNA杂交的DNA所编码的蛋白、以及利用抗本发明抗体的抗血清获得的多肽或蛋白。

本发明还提供了其他多肽，如包含纳米抗体或其片段的融合蛋白。除了几乎全长的多肽外，本发明还包括了本发明纳米抗体的片段。通常，该片段具有本发明抗体的至少约50个连续氨基酸，较佳地至少约50个连续氨基酸，更佳地至少约80个连续氨基酸，最佳地至少约100个连续氨基酸。

在本发明中，“本发明抗体的保守性变异体”指与本发明抗体的氨基酸序列相比，有至多10个，较佳地至多8个，更佳地至多5个，最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。

表1

本发明还提供了编码上述抗体或其片段或其融合蛋白的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。

编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括：只编码成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列；成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。

术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸，也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。

本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50％，较佳地至少70％，更佳地至少80％相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中，“严格条件”是指：(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱，如0.2×SSC,0.1％SDS,60℃；或(2)杂交时加有变性剂,如50％(v/v)甲酰胺，0.1％小牛血清/0.1％Ficoll，42℃等；或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90％以上,更好是95％以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与成熟多肽有相同的生物学功能和活性。

本发明的抗体的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列，尤其是片段长度较短时。通常，通过先合成多个小片段，然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外，还可将重链的编码序列和表达标签(如6His)融合在一起，形成融合蛋白。

一旦获得了有关的序列，就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体，再转入细胞，然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。本发明所涉及的生物分子(核酸、蛋白等)包括以分离的形式存在的生物分子。

目前，已经可以完全通过化学合成来得到编码本发明蛋白(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外，还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。

本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞，以使其能够表达蛋白质。

宿主细胞可以是原核细胞，如细菌细胞；或是低等真核细胞，如酵母细胞；或是高等真核细胞，如哺乳动物细胞。代表性例子有：大肠杆菌，链霉菌属；鼠伤寒沙门氏菌的细菌细胞；真菌细胞如酵母；果蝇S2或Sf9的昆虫细胞；CHO、COS7、293细胞的动物细胞等。

用重组DNA转化宿主细胞可用本领域技术人员熟知的常规技术进行。当宿主为原核生物如大肠杆菌时，能吸收DNA的感受态细胞可在指数生长期后收获，用CaCl₂法处理，所用的步骤在本领域众所周知。另一种方法是使用MgCl₂。如果需要，转化也可用电穿孔的方法进行。当宿主是真核生物，可选用如下的DNA转染方法：磷酸钙共沉淀法，常规机械方法如显微注射、电穿孔,脂质体包装等。

获得的转化子可以用常规方法培养，表达本发明的基因所编码的多肽。根据所用的宿主细胞，培养中所用的培养基可选自各种常规培养基。在适于宿主细胞生长的条件下进行培养。当宿主细胞生长到适当的细胞密度后，用合适的方法(如温度转换或化学诱导)诱导选择的启动子，将细胞再培养一段时间。

在上面的方法中的重组多肽可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要，可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于：常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。

本发明的抗体可以单独使用，也可与可检测标记物(为诊断目的)、治疗剂、PK(蛋白激酶)修饰部分或任何以上这些物质的组合结合或偶联。

用于诊断目的可检测标记物包括但不限于：荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶。

可与本发明抗体结合或偶联的治疗剂包括但不限于：1.放射性核素；2.生物毒；3.细胞因子如IL-2等；4.金纳米颗粒/纳米棒；5.病毒颗粒；6.脂质体；7.纳米磁粒；8.前药激活酶(例如，DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))；10.化疗剂(例如，顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。

药物组合物

本发明还提供了一种组合物。优选地，所述的组合物是药物组合物，它含有上述的抗体或其活性片段或其融合蛋白，以及药学上可接受的载体。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地pH约为6-8，尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药，其中包括(但并不限于)：瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。

本发明的药物组合物可直接用于结合PD-1蛋白分子，因而可用于治疗肿瘤。此外，还可同时使用其他治疗剂。

本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt％,较佳地0.01-90wt％，更佳地0.1-80wt％)的本发明上述的纳米抗体(或其偶联物)以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于)：盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量，例如每天约10微克/千克体重-约50毫克/千克体重。此外，本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。

使用药物组合物时，是将安全有效量的免疫偶联物施用于哺乳动物，其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重，而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重，较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。

标记的纳米抗体

在本发明的一个优选例中，所述纳米抗体带有可检测标记物。更佳地，所述的标记物选自下组：同位素、胶体金标记物、有色标记物或荧光标记物。

胶体金标记可采用本领域技术人员已知的方法进行。在本发明的一个优选的方案中，抗PD-1的纳米抗体用胶体金标记，得到胶体金标记的纳米抗体。

本发明的抗PD-1纳米抗体具有很好的特异性，很高的效价。

检测方法

本发明还涉及检测PD-1蛋白的方法。该方法步骤大致如下：获得细胞和/或组织样本；将样本溶解在介质中；检测在所述溶解的样本中PD-1蛋白的水平。

在本发明的检测方法中，所使用的样本没有特别限制，代表性的例子是存在于细胞保存液中的含细胞的样本。

试剂盒

本发明还提供了一种含有本发明的抗体(或其片段)或检测板的试剂盒，在本发明的一个优选例中，所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。

本发明还提供了用于检测PD-1水平的检测试剂盒，该试剂盒包括识别PD-1蛋白的抗体，用于溶解样本的裂解介质，检测所需的通用试剂和缓冲液，如各种缓冲液、检测标记、检测底物等。该检测试剂盒可以是体外诊断装置。

应用

如上所述，本发明的纳米抗体有广泛生物应用价值和临床应用价值，其应用涉及到与PD-1相关的疾病的诊断和治疗、基础医学研究、生物学研究等多个领域。一个优选的应用是用于针对PD-1的临床诊断和靶向治疗，如肿瘤治疗。

本发明的主要优点包括：

(a)本发明纳米抗体特异性针对人的具有正确空间结构的PD-1蛋白。

(b)本发明纳米抗体具有良好的阻断PD-1/PD-L1活性。

(c)本发明纳米抗体具有显著的抗肿瘤活性。

(d)本发明纳米抗体的生产简便。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Sambrook等人，分子克隆：实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。

实施例1：人PD-1蛋白的表达纯化

人PD-1蛋白的表达纯化的方法如下：

(1)将人PD-1的核苷酸序列合成在pCDNA3.1(-)载体上，然后将其胞外段序列亚克隆至pFUSE-IgG1载体上；(2)用Omega质粒大提试剂盒提取构建的pFUSE-IgG1-hPD-1(ECD)质粒；(3)培养HEK293F细胞至OD为2.0×10⁶个/mL；(4)将质粒与转染试剂PEI 1:3混合均匀后静置20min，然后加入到HEK293F细胞中，37℃，6％CO₂摇床培养箱中培养5-6天；(5)收集细胞上清，与Protein A珠子在室温下结合1h；(6)用磷酸盐缓冲液pH 7.0洗涤珠子后，再用0.1M pH3.0 Glycine洗脱蛋白；(7)将洗脱的蛋白超滤至PBS中，测定产量后取样进行SDS-PAGE检测。

检测结果如图1所示，该蛋白hPD-1(ECD)-Fc纯度达到90％以上，剩余蛋白保存于-80℃冰箱备用。

实施例2：PD-1纳米抗体文库的构建及筛选

文库构建方法如下：

(1)将1mg hPD-1(ECD)-Fc抗原与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆双峰驼，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；(2)7次免疫结束后，提取100mL骆驼外周血淋巴细胞并提取总RNA；(3)合成cDNA并利用套式PCR扩增VHH；(4)利用限制性内切酶Pst I及Not I酶切20μg pMECS噬菌体展示载体(Biovector供应)及10μg VHH并连接两个片段；(5)将连接产物转化至电转感受态细胞TG1中，构建PD-1纳米抗体文库并测定库容。

结果如图2所示，库容大小为2.2×10⁹CFU。

随机挑取24颗克隆进行菌落PCR检测，结果显示所建文库的插入率为95.8％。

抗体筛选鉴定方法如下：

(1)将溶解在100mM NaHCO₃、pH 8.2中的10μg hPD-1(ECD)-Fc抗原(10μg Fc inNaHCO₃作为对照)偶联在NUNC酶标板上，4℃放置过夜；(2)第二天加入100μL0.1％BSA，室温封闭2h；(3)2h后，加入100μL噬菌体(2×10¹¹CFU免疫骆驼纳米抗体噬菌展示基因库)，室温作用1h；(4)用0.05％PBS+Tween-20洗5遍，以洗掉非特异的噬菌体；(5)用100mM三乙醇胺将与PD-1特异性结合的噬菌体解离下，并感染处于对数期生长的大肠杆菌TG1细胞，37℃培养1h，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛选，相同筛选过程重复6轮使阳性的克隆被富集。(6)从富集后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选200个单个菌落并接种于含有100μg/mL的氨苄青霉素的TB培养基(1L TB培养基中含有2.3g KH₂PO₄，12.52g K₂HPO₄，12g蛋白胨，24g酵母提取物，4mL甘油中，生长至对数期后，加终浓度1mM的IPTG，28℃培养过夜。(7)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温下放置1h。(8)用PBST洗去未结合的抗体，加入鼠抗HA抗体(COVENCE)，在室温下放置1h。(9)用PBST洗去未结合的抗体，加入山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，在室温下放置1h。(10)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，于ELISA仪上，在405nm波长，读取吸收值。(11)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时(Ratio+/-＞3)，判为阳性克隆孔。(12)将阳性克隆孔的菌转摇在含有100μg/mL Amp的LB液体中以便提取质粒并进行测序。

阳性克隆的富集结果如图3所示，结果显示，经过六轮噬菌体展示筛选，PD-1纳米抗体噬菌体达到21.3倍富集。

将测序结果不同的抗体菌株保存，并用于后续功能型抗体筛选。

实施例3：PD-1过表达细胞株的构建和鉴定

构建和鉴定方法如下：

(1)复苏CHOZn细胞，并于CO₂培养箱培养过夜(5％CO₂，37℃)。(2)将包装质粒和目的质粒按照合适的比例与转染试剂混匀后加入到CHOZn细胞中。(3)分别在转染后的48小时和72小时收集病毒上清。(4)用浓缩试剂与病毒上清按照一定的比例混合，每半小时混匀一次，4℃保存过夜。(5)4000rpm离心半小时，去上清，将沉淀用目标培养基重悬后加入到CHOZn细胞中。(6)48小时后加入合适浓度的puromycin进行筛选。(7)根据细胞的生长情况每隔一天或者两天更换含puromycin的新鲜培养基，直至很少有细胞继续死亡。(8)分别取构建前后的CHOZn细胞，用hPD-L1-biotin进行染色合适的时间后，再用SA-PE染色一定的时间，最后用BD Calibur流式细胞仪道进行检测。

结果如图4所示，构建前的CHOZn细胞不与低浓度的hPD-L1-biotin结合；构建后的CHOZn/PD-1细胞能够与PD-L1-biotin结合，说明PD-1过表达的CHOZn细胞构建成功，可以用来后续PD-1纳米抗体的筛选。

实施例4：阻断型PD-1纳米抗体细胞水平初筛

初筛方法如下:

(1)将测序正确的不同克隆株接种于1ml含有合适浓度的氨苄青霉素的TB培养基中，37℃恒温摇床培养至对数生长期时加入IPTG诱导剂，28℃诱导16h；(2)16h之后，利用渗透压冲击法破碎菌体，获得纳米抗体粗提液；(3)每个样品取1×10⁶个CHOZn/PD-1细胞重悬于0.5％BSA-PBS buffer中，分别加入上述PD-1纳米抗体粗提液200μl，同时设置阴性对照(GFP Nb)，所有样本加入合适浓度的hPD-L1-Biotin，4℃孵育20min；(5)1×PBS洗涤2次，加SA-PE，4℃避光孵育20min，1×PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD Caliber)检测。

结果如图5所示，初步筛选到一株具有良好阻断效果的PD-1纳米抗体。

实施例5：PD-1纳米抗体在真核细胞HEK293中的表达纯化及流式细胞术检测纳米抗体的阻断功能

在真核细胞HEK293F中表达PD-1Nb-Fc融合蛋白的方法如下：

(1)将测序结果正确的PD-1Nb序列克隆至pFUSE-IgG4载体(购自Invivogen)，用Omega质粒大提试剂盒提取质粒；(2)培养HEK293F细胞至OD为2.0×10⁶个/mL；(3)将质粒与转染试剂PEI按照1:3混合均匀后静置20min，然后加入到HEK293F细胞中，37℃，6％CO₂摇床培养箱中培养5-6天；(4)收集细胞上清，与Protein A珠子在室温下结合1h；(5)用磷酸盐缓冲液pH 7.0洗涤珠子后，再用0.1M pH 3.0Glycine洗脱蛋白；(6)将洗脱的蛋白超滤至PBS中，测定产量后取样进行SDS-PAGE检测

结果显示，PD-1Nb-Fc融合蛋白在真核细胞HEK293F中成功表达，将剩余蛋白保存于-80℃冰箱备用。

流式细胞术鉴定纳米抗体阻断功能的方法如下：

(1)每个样品取5×10⁵个PD-1稳转细胞CHOZn/PD-1于0.5％BSA-PBS buffer中，加入梯度稀释的PD-1Nb，及对照抗体Keytruda(抗体稀释梯度为40ug/ml，20ug/ml，10ug/m，5ug/ml，2.5ug/ml，1.25ug/ml，0.625ug/ml，0.3125ug/ml，0.1563ug/ml，0.07813ug/ml，0.0391ug/ml)，每个样品加入100uL，所有样本中同时加入50ug/ml hPD-L1-Biotin，4℃孵育20min；(2)PBS洗涤2次细胞，加入SA-PE，4℃孵育20min，PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD Calibur)检测，使用graphpad prism 6软件进行数据处理。

结果如图6所示，PD-1Nb的IC₅₀为1.305ug/mL，而对照抗体Keytruda的IC₅₀为1.339g/mL。PD-1纳米抗体的阻断活性与对照抗体相近。

实施例6：PD-1纳米抗体细胞水平结合活性分析

分析方法如下：

(1)每个样品取5×10⁵个CHOZn/PD-1稳转细胞于0.5％BSA-PBS buffer中，加入梯度稀释的PD-1Nb，及对照抗体Keytruda(抗体稀释梯度为160ug/ml，80ug/ml，40ug/ml，20ug/ml，10ug/m，5ug/ml，2.5ug/ml，1.25ug/ml，0.625ug/ml，0.3125ug/ml，0.1563ug/ml，0.0781ug/ml)，每个样品加入100uL，4℃孵育20min；(2)PBS洗涤2次细胞，加入anti HumanIgG-FITC，4℃孵育20min，PBS洗涤2次细胞后用流式细胞仪(BD Calibur)检测，使用graphpad prism 6软件进行数据处理。

结果如图7所示，PD-1Nb的EC₅₀为1.064ug/mL，而对照抗体Keytruda的EC₅₀为1.113ug/mL。

实施例7：PD-1纳米抗体的人源化改造

首先，以SEQ ID NO:8所示的PD-1纳米抗体序列为模板在结构数据库中同源结构的搜索，取其中E value＝0.0并且序列等同性≥70％的结构；其次，对这些结构进行结构比对，并依据晶体结构分辨率大小和构建的进化树，最终选取包括3dwt在内的蛋白，进行基于SEQ ID NO:8所示的PD-1纳米抗体序列的多模板同源模建，再依据打分函数的高低排序，选取molpdf最低的结构，继续下面的工作；然后对模建的最优结构，利用ProtSA服务器计算残基的溶剂可接触性，即残基的折叠态相对于去折叠态的溶剂可接触面积的比值为判据，取大于40％的残基为暴露于溶剂外的残基；最后，对模建的最优结构和DP-47进行序列比对，替换相应的暴露于溶剂的残基。

最终确定获得一种人源化PD-1纳米抗体，由SEQ ID NO:14所示的氨基酸序列编码。人源化前后抗体序列对应如下表1：

表1

实施例8：人源化PD-1纳米抗体(HuNb-Fc)细胞水平阻断活性分析

将实施例7制备的人源化纳米抗体与人Fc蛋白融合，将HuNb-Fc氨基酸序列(SEQID NO:16)按照人密码子优化后的碱基序列(SEQ ID NO:17)合成至pCDNA3.1(-)载体上，然后按照实施例1中的方法表达纯化出HuNb-Fc抗体。将纯化的抗体用于活性检测实验。

具体方法参考实施例5。

结果如图8所示，HuNb-Fc细胞水平的IC₅₀为1.169ug/ml，与对照抗体Ketytruda的阻断活性相近。

实施例9：人源化PD-1纳米抗体(HuNb-Fc)PD-1/PD-L1报告基因分析

分析方法如下

(1)取Accutase酶消化GS-C2/PD-L1细胞3-5min，用F12K完全培养基中和accutase酶，800rpm，5min离心，弃上清，再用2mL F12K完全培养基重悬，计数，取相应体积到细胞加样槽，终浓度为5×10⁵个/mL，充分混匀，将混匀好的细胞溶液用排枪转移到对应的384孔板，37℃，5％CO₂培养箱孵育过夜。(2)第二天，抗体样品稀释。吸弃GS-C2/PD-L1细胞培养基，将稀释混匀好的抗体样品用排枪转移到对应的384孔板。(3)计算实验所需的GS-J2/PD-1细胞数目。将GS-J2/PD-1细胞离心，弃上清，1％Assay buffer重悬，将混匀好的细胞溶液转移到对应的384孔板，37℃，5％CO₂培养箱孵育6h。(4)读板：先取适量体积ONE-Glo^TMLuciferase Assay System的溶液至加样槽，30ul/孔，室温避光孵育5-10min，BioTeK机器调至生物发光模式检测。

结果如图9所示，HuNb-Fc与Keytruda具有相似的生物学活性。

实施例10：人源化多价PD1纳米抗体的构建及活性分析

为了进一步提高人源化抗体的阻断活性，尝试构建多价体后进行活性分析，其结构如下所示：

A：HuNb-L1-HuNb-Fc(氨基酸序列见SEQ ID NO:18，碱基序列见SEQ ID NO:21)，

B：HuNb-L2-HuNb-Fc(氨基酸序列见SEQ ID NO:19，碱基序列见SEQ ID NO:22)，

C：HuNb-L3-HuNb-Fc(氨基酸序列见SEQ ID NO:20，碱基序列见SEQ ID NO:23)，

D：HuNb-L1-HuNb-L1-HuNb-Fc(氨基酸序列见SEQ ID NO:24，碱基序列见SEQ IDNO:27)，

E：HuNb-L2-HuNb-L2-HuNb-Fc(氨基酸序列见SEQ ID NO:25，碱基序列见SEQ IDNO:28)，

F：HuNb-L3-HuNb-L3-HuNb-Fc(氨基酸序列见SEQ ID NO:26，碱基序列见SEQ IDNO:29)，

其中，HuNb指实施例7制备的人源化PD1纳米抗体，L1指连接子GS，L2指连接子(4GS)₂，L3指连接子(4GS)₄。

将以上形式多价抗体的碱基序列合成至pCDNA3.1(-)载体上，然后利用实施例1中的方法将各种抗体表达纯化，然后利用实施例9的检测方法进行阻断活性分析。

结果如图10所示：以上多价抗体的活性较二价抗体HuNb-Fc(SEQ ID NO:16)均具有显著提升，其中C结构的4价抗体及E结构的6价抗体的阻断活性较佳，后续将选择C结构的抗体进行进一步验证。

实施例11：人源化PD-1纳米抗体体内药效研究

对hPD-1转基因小鼠接种MC38细胞，成瘤后分为三组，每组8只进行给药(阴性对照组：PBS；阳性对照组：Keytruda；实验组：实施例10制备的抗体C。给药频率：每三天1次，连续给药7次。给药剂量：10mg/kg。

实验结果如图11所示：抗体C有显著的肿瘤抑制效果，其肿瘤抑制率TGI为91％，且有一只小鼠肿瘤完全消退，其肿瘤抑制效果显著优于Keytruda(TGI为60％。图12显示了小鼠处死后剥瘤称重的结果，可以看出抗体C组的小鼠瘤重显著低于Keytruda组和阴性对照组。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

序列表

<110> 上海洛启生物医药技术有限公司

<120> 阻断型PD-1纳米抗体及其编码序列和用途

<130> P2020-1599

<150> CN201910833395.6

<151> 2019-09-04

<160> 29

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 10

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Met Gly

1 5 10

<210> 2

<211> 7

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr

1 5

<210> 3

<211> 24

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

Ala Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val

1 5 10 15

Pro Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr

20

<210> 4

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 5

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val Ala Ala

1 5 10 15

<210> 6

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Met Tyr Thr Cys

35

<210> 7

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 8

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Ala Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Glu Arg Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Met Tyr Thr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro

100 105 110

Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Gln Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 9

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

caggttcagc tgcaggaatc tggtggtggt tctgttcagg cgggtggttc tctgcgtctg 60

tcttgcgcgg cgtctggtta cacctactct tcttactaca tgggttggtt ccgtcaggcg 120

ccgggtaaag aacgtgaagg tgttgcggcg atcgaccgtg acggtcgtac ctcttacgcg 180

gactctgtta aaggtcgttt caccatctct cgtgacaacg cgaaaaacac cctgtacctg 240

cagatgaact ctctgaaacc ggaagacacc gcgatgtaca cctgcgcggc ggttctggtt 300

ctgtctggtt actactctga ctacggtctg gttccgccgc cgttcgaata caactactgg 360

ggtcagggta cccaggttac cgtttcttct 390

<210> 10

<211> 25

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser

20 25

<210> 11

<211> 15

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala

1 5 10 15

<210> 12

<211> 38

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn

1 5 10 15

Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp

20 25 30

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys

35

<210> 13

<211> 11

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser

1 5 10

<210> 14

<211> 130

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro

100 105 110

Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser

130

<210> 15

<211> 390

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

caggtgcagc tgcaggagtc cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggctc cctgaggctg 60

tcctgcgccg cctccggcta cacctactcc tcctactaca tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggcaagg gcctggaggg cgtggccgcc atcgacaggg acggcaggac ctcctacgcc 180

gactccgtga agggcaggtt caccatctcc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaact ccctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgtgctggtg 300

ctgtccggct actactccga ctacggcctg gtgccccccc ccttcgagta caactactgg 360

ggccagggca ccctggtgac cgtgtcctcc 390

<210> 16

<211> 359

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro

100 105 110

Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro

130 135 140

Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys

145 150 155 160

Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val

165 170 175

Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp

180 185 190

Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe

195 200 205

Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp

210 215 220

Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu

225 230 235 240

Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg

245 250 255

Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys

260 265 270

Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp

275 280 285

Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys

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Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser

305 310 315 320

Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser

325 330 335

Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser

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Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

355

<210> 17

<211> 1077

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 17

gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60

agctgcgccg ccagcggcta cacctacagc agctactaca tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggcaagg gcctggaggg cgtggccgcc atcgacaggg acggcaggac cagctacgcc 180

gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgtgctggtg 300

ctgagcggct actacagcga ctacggcctg gtgccccccc ccttcgagta caactactgg 360

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gaggaccccg aggtgcagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag 600

accaagccca gggaggagca gttcaacagc acctacaggg tggtgagcgt gctgaccgtg 660

ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtgagcaa caagggcctg 720

cccagcagca tcgagaagac catcagcaag gccaagggcc agcccaggga gccccaggtg 780

tacaccctgc cccccagcca ggaggagatg accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg 840

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aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc 960

aggctgaccg tggacaagag caggtggcag gagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg 1020

cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag aagagcctga gcctgagcct gggcaag 1077

<210> 18

<211> 491

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 18

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr

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Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val

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Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro

100 105 110

Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

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Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr

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Tyr Ser Ser Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala

180 185 190

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

195 200 205

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Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr

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Gly Leu Val Pro Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro

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Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

275 280 285

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

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Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn

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Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

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Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

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<211> 498

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 19

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

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Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

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Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro

100 105 110

Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln

130 135 140

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

145 150 155 160

Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Met Gly Trp Phe

165 170 175

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Arg

180 185 190

Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

195 200 205

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

210 215 220

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Leu Val Leu

225 230 235 240

Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro Pro Pro Phe Glu Tyr

245 250 255

Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys

260 265 270

Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly

275 280 285

Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile

290 295 300

Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu

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Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His

325 330 335

Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg

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Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu

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Gly Lys

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<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 20

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

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20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro

100 105 110

Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

165 170 175

Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly

180 185 190

Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser

195 200 205

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

210 215 220

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser

245 250 255

Asp Tyr Gly Leu Val Pro Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln

260 265 270

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

275 280 285

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

290 295 300

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

305 310 315 320

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

325 330 335

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

340 345 350

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

355 360 365

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

370 375 380

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

385 390 395 400

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

405 410 415

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

420 425 430

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

435 440 445

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

450 455 460

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

465 470 475 480

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

485 490 495

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

500 505

<210> 21

<211> 1473

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 21

gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60

agctgcgccg ccagcggcta cacctacagc agctactaca tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggcaagg gcctggaggg cgtggccgcc atcgacaggg acggcaggac cagctacgcc 180

gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgtgctggtg 300

ctgagcggct actacagcga ctacggcctg gtgccccccc ccttcgagta caactactgg 360

ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc ggcagcgagg tgcagctgca ggagagcggc 420

ggcggcctgg tgcagcccgg cggcagcctg aggctgagct gcgccgccag cggctacacc 480

tacagcagct actacatggg ctggttcagg caggcccccg gcaagggcct ggagggcgtg 540

gccgccatcg acagggacgg caggaccagc tacgccgaca gcgtgaaggg caggttcacc 600

atcagcaggg acaacgccaa gaacaccctg tacctgcaga tgaacagcct gagggccgag 660

gacaccgccg tgtactactg cgccgccgtg ctggtgctga gcggctacta cagcgactac 720

ggcctggtgc cccccccctt cgagtacaac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 780

agcagcgaga gcaagtacgg ccccccctgc cccccctgcc ccgcccccga gttcctgggc 840

ggccccagcg tgttcctgtt cccccccaag cccaaggaca ccctgatgat cagcaggacc 900

cccgaggtga cctgcgtggt ggtggacgtg agccaggagg accccgaggt gcagttcaac 960

tggtacgtgg acggcgtgga ggtgcacaac gccaagacca agcccaggga ggagcagttc 1020

aacagcacct acagggtggt gagcgtgctg accgtgctgc accaggactg gctgaacggc 1080

aaggagtaca agtgcaaggt gagcaacaag ggcctgccca gcagcatcga gaagaccatc 1140

agcaaggcca agggccagcc cagggagccc caggtgtaca ccctgccccc cagccaggag 1200

gagatgacca agaaccaggt gagcctgacc tgcctggtga agggcttcta ccccagcgac 1260

atcgccgtgg agtgggagag caacggccag cccgagaaca actacaagac cacccccccc 1320

gtgctggaca gcgacggcag cttcttcctg tacagcaggc tgaccgtgga caagagcagg 1380

tggcaggagg gcaacgtgtt cagctgcagc gtgatgcacg aggccctgca caaccactac 1440

acccagaaga gcctgagcct gagcctgggc aag 1473

<210> 22

<211> 1494

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 22

gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60

agctgcgccg ccagcggcta cacctacagc agctactaca tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggcaagg gcctggaggg cgtggccgcc atcgacaggg acggcaggac cagctacgcc 180

gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgtgctggtg 300

ctgagcggct actacagcga ctacggcctg gtgccccccc ccttcgagta caactactgg 360

ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcagcgag 420

gtgcagctgc aggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaggctgagc 480

tgcgccgcca gcggctacac ctacagcagc tactacatgg gctggttcag gcaggccccc 540

ggcaagggcc tggagggcgt ggccgccatc gacagggacg gcaggaccag ctacgccgac 600

agcgtgaagg gcaggttcac catcagcagg gacaacgcca agaacaccct gtacctgcag 660

atgaacagcc tgagggccga ggacaccgcc gtgtactact gcgccgccgt gctggtgctg 720

agcggctact acagcgacta cggcctggtg ccccccccct tcgagtacaa ctactggggc 780

cagggcaccc tggtgaccgt gagcagcgag agcaagtacg gccccccctg ccccccctgc 840

cccgcccccg agttcctggg cggccccagc gtgttcctgt tcccccccaa gcccaaggac 900

accctgatga tcagcaggac ccccgaggtg acctgcgtgg tggtggacgt gagccaggag 960

gaccccgagg tgcagttcaa ctggtacgtg gacggcgtgg aggtgcacaa cgccaagacc 1020

aagcccaggg aggagcagtt caacagcacc tacagggtgg tgagcgtgct gaccgtgctg 1080

caccaggact ggctgaacgg caaggagtac aagtgcaagg tgagcaacaa gggcctgccc 1140

agcagcatcg agaagaccat cagcaaggcc aagggccagc ccagggagcc ccaggtgtac 1200

accctgcccc ccagccagga ggagatgacc aagaaccagg tgagcctgac ctgcctggtg 1260

aagggcttct accccagcga catcgccgtg gagtgggaga gcaacggcca gcccgagaac 1320

aactacaaga ccaccccccc cgtgctggac agcgacggca gcttcttcct gtacagcagg 1380

ctgaccgtgg acaagagcag gtggcaggag ggcaacgtgt tcagctgcag cgtgatgcac 1440

gaggccctgc acaaccacta cacccagaag agcctgagcc tgagcctggg caag 1494

<210> 23

<211> 1527

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 23

gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60

agctgcgccg ccagcggcta cacctacagc agctactaca tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggcaagg gcctggaggg cgtggccgcc atcgacaggg acggcaggac cagctacgcc 180

gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgtgctggtg 300

ctgagcggct actacagcga ctacggcctg gtgccccccc ccttcgagta caactactgg 360

ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 420

ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc 480

ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg agctgcgccg ccagcggcta cacctacagc 540

agctactaca tgggctggtt caggcaggcc cccggcaagg gcctggaggg cgtggccgcc 600

atcgacaggg acggcaggac cagctacgcc gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc 660

agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc 720

gccgtgtact actgcgccgc cgtgctggtg ctgagcggct actacagcga ctacggcctg 780

gtgccccccc ccttcgagta caactactgg ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc 840

gagagcaagt acggcccccc ctgccccccc tgccccgccc ccgagttcct gggcggcccc 900

agcgtgttcc tgttcccccc caagcccaag gacaccctga tgatcagcag gacccccgag 960

gtgacctgcg tggtggtgga cgtgagccag gaggaccccg aggtgcagtt caactggtac 1020

gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag accaagccca gggaggagca gttcaacagc 1080

acctacaggg tggtgagcgt gctgaccgtg ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag 1140

tacaagtgca aggtgagcaa caagggcctg cccagcagca tcgagaagac catcagcaag 1200

gccaagggcc agcccaggga gccccaggtg tacaccctgc cccccagcca ggaggagatg 1260

accaagaacc aggtgagcct gacctgcctg gtgaagggct tctaccccag cgacatcgcc 1320

gtggagtggg agagcaacgg ccagcccgag aacaactaca agaccacccc ccccgtgctg 1380

gacagcgacg gcagcttctt cctgtacagc aggctgaccg tggacaagag caggtggcag 1440

gagggcaacg tgttcagctg cagcgtgatg cacgaggccc tgcacaacca ctacacccag 1500

aagagcctga gcctgagcct gggcaag 1527

<210> 24

<211> 623

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 24

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro

100 105 110

Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val

130 135 140

Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr

145 150 155 160

Tyr Ser Ser Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly

165 170 175

Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala

180 185 190

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

195 200 205

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

210 215 220

Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr

225 230 235 240

Gly Leu Val Pro Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr

245 250 255

Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly

260 265 270

Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala

275 280 285

Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala

290 295 300

Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg

305 310 315 320

Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp

325 330 335

Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu

340 345 350

Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr

355 360 365

Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp

370 375 380

Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro

385 390 395 400

Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val

405 410 415

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

420 425 430

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu

435 440 445

Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

450 455 460

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

465 470 475 480

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

485 490 495

Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile

500 505 510

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

515 520 525

Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

530 535 540

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

545 550 555 560

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

565 570 575

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

580 585 590

Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

595 600 605

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

610 615 620

<210> 25

<211> 637

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 25

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro

100 105 110

Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln

130 135 140

Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser

145 150 155 160

Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Met Gly Trp Phe

165 170 175

Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Arg

180 185 190

Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile

195 200 205

Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu

210 215 220

Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Leu Val Leu

225 230 235 240

Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro Pro Pro Phe Glu Tyr

245 250 255

Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly

260 265 270

Gly Ser Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly

275 280 285

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

290 295 300

Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly

305 310 315 320

Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser

325 330 335

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

340 345 350

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

355 360 365

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser

370 375 380

Asp Tyr Gly Leu Val Pro Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln

385 390 395 400

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys

405 410 415

Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu

420 425 430

Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu

435 440 445

Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln

450 455 460

Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys

465 470 475 480

Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu

485 490 495

Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys

500 505 510

Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys

515 520 525

Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser

530 535 540

Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys

545 550 555 560

Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln

565 570 575

Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly

580 585 590

Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln

595 600 605

Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn

610 615 620

His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Leu Gly Lys

625 630 635

<210> 26

<211> 659

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 26

Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly

1 5 10 15

Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr

20 25 30

Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val

35 40 45

Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys

50 55 60

Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu

65 70 75 80

Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala

85 90 95

Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro

100 105 110

Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val

115 120 125

Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly

130 135 140

Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Gly Gly

145 150 155 160

Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly

165 170 175

Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Met Gly Trp Phe Arg Gln Ala Pro Gly

180 185 190

Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp Arg Asp Gly Arg Thr Ser

195 200 205

Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala

210 215 220

Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr

225 230 235 240

Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Leu Val Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser

245 250 255

Asp Tyr Gly Leu Val Pro Pro Pro Phe Glu Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln

260 265 270

Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly

275 280 285

Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Val Gln Leu

290 295 300

Gln Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu

305 310 315 320

Ser Cys Ala Ala Ser Gly Tyr Thr Tyr Ser Ser Tyr Tyr Met Gly Trp

325 330 335

Phe Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Gly Val Ala Ala Ile Asp

340 345 350

Arg Asp Gly Arg Thr Ser Tyr Ala Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr

355 360 365

Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser

370 375 380

Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Ala Val Leu Val

385 390 395 400

Leu Ser Gly Tyr Tyr Ser Asp Tyr Gly Leu Val Pro Pro Pro Phe Glu

405 410 415

Tyr Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Glu Ser

420 425 430

Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Phe Leu Gly

435 440 445

Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

450 455 460

Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser Gln

465 470 475 480

Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

485 490 495

His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr Tyr

500 505 510

Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

515 520 525

Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser Ile

530 535 540

Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

545 550 555 560

Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser

565 570 575

Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

580 585 590

Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

595 600 605

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr Val

610 615 620

Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

625 630 635 640

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

645 650 655

Leu Gly Lys

<210> 27

<211> 1869

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 27

gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60

agctgcgccg ccagcggcta cacctacagc agctactaca tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggcaagg gcctggaggg cgtggccgcc atcgacaggg acggcaggac cagctacgcc 180

gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgtgctggtg 300

ctgagcggct actacagcga ctacggcctg gtgccccccc ccttcgagta caactactgg 360

ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc ggcagcgagg tgcagctgca ggagagcggc 420

ggcggcctgg tgcagcccgg cggcagcctg aggctgagct gcgccgccag cggctacacc 480

tacagcagct actacatggg ctggttcagg caggcccccg gcaagggcct ggagggcgtg 540

gccgccatcg acagggacgg caggaccagc tacgccgaca gcgtgaaggg caggttcacc 600

atcagcaggg acaacgccaa gaacaccctg tacctgcaga tgaacagcct gagggccgag 660

gacaccgccg tgtactactg cgccgccgtg ctggtgctga gcggctacta cagcgactac 720

ggcctggtgc cccccccctt cgagtacaac tactggggcc agggcaccct ggtgaccgtg 780

agcagcggca gcgaggtgca gctgcaggag agcggcggcg gcctggtgca gcccggcggc 840

agcctgaggc tgagctgcgc cgccagcggc tacacctaca gcagctacta catgggctgg 900

ttcaggcagg cccccggcaa gggcctggag ggcgtggccg ccatcgacag ggacggcagg 960

accagctacg ccgacagcgt gaagggcagg ttcaccatca gcagggacaa cgccaagaac 1020

accctgtacc tgcagatgaa cagcctgagg gccgaggaca ccgccgtgta ctactgcgcc 1080

gccgtgctgg tgctgagcgg ctactacagc gactacggcc tggtgccccc ccccttcgag 1140

tacaactact ggggccaggg caccctggtg accgtgagca gcgagagcaa gtacggcccc 1200

ccctgccccc cctgccccgc ccccgagttc ctgggcggcc ccagcgtgtt cctgttcccc 1260

cccaagccca aggacaccct gatgatcagc aggacccccg aggtgacctg cgtggtggtg 1320

gacgtgagcc aggaggaccc cgaggtgcag ttcaactggt acgtggacgg cgtggaggtg 1380

cacaacgcca agaccaagcc cagggaggag cagttcaaca gcacctacag ggtggtgagc 1440

gtgctgaccg tgctgcacca ggactggctg aacggcaagg agtacaagtg caaggtgagc 1500

aacaagggcc tgcccagcag catcgagaag accatcagca aggccaaggg ccagcccagg 1560

gagccccagg tgtacaccct gccccccagc caggaggaga tgaccaagaa ccaggtgagc 1620

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ggccagcccg agaacaacta caagaccacc ccccccgtgc tggacagcga cggcagcttc 1740

ttcctgtaca gcaggctgac cgtggacaag agcaggtggc aggagggcaa cgtgttcagc 1800

tgcagcgtga tgcacgaggc cctgcacaac cactacaccc agaagagcct gagcctgagc 1860

ctgggcaag 1869

<210> 28

<211> 1911

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 28

gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60

agctgcgccg ccagcggcta cacctacagc agctactaca tgggctggtt caggcaggcc 120

cccggcaagg gcctggaggg cgtggccgcc atcgacaggg acggcaggac cagctacgcc 180

gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 240

cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgtgctggtg 300

ctgagcggct actacagcga ctacggcctg gtgccccccc ccttcgagta caactactgg 360

ggccagggca ccctggtgac cgtgagcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcagcgag 420

gtgcagctgc aggagagcgg cggcggcctg gtgcagcccg gcggcagcct gaggctgagc 480

tgcgccgcca gcggctacac ctacagcagc tactacatgg gctggttcag gcaggccccc 540

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ggctactaca gcgactacgg cctggtgccc ccccccttcg agtacaacta ctggggccag 1200

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<211> 1977

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

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gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 60

agctgcgccg ccagcggcta cacctacagc agctactaca tgggctggtt caggcaggcc 120

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ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc ggcggcggcg gcagcggcgg cggcggcagc 900

gaggtgcagc tgcaggagag cggcggcggc ctggtgcagc ccggcggcag cctgaggctg 960

agctgcgccg ccagcggcta cacctacagc agctactaca tgggctggtt caggcaggcc 1020

cccggcaagg gcctggaggg cgtggccgcc atcgacaggg acggcaggac cagctacgcc 1080

gacagcgtga agggcaggtt caccatcagc agggacaacg ccaagaacac cctgtacctg 1140

cagatgaaca gcctgagggc cgaggacacc gccgtgtact actgcgccgc cgtgctggtg 1200

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gaggaccccg aggtgcagtt caactggtac gtggacggcg tggaggtgca caacgccaag 1500

accaagccca gggaggagca gttcaacagc acctacaggg tggtgagcgt gctgaccgtg 1560

ctgcaccagg actggctgaa cggcaaggag tacaagtgca aggtgagcaa caagggcctg 1620

cccagcagca tcgagaagac catcagcaag gccaagggcc agcccaggga gccccaggtg 1680

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