抗cd23蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用
阅读说明：本技术 抗cd23蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用 (anti-CD 23 protein monoclonal antibody, cell line, preparation method and application thereof ) 是由 黄信超 杨清海 高惠然 李恢波 吴茂 王小亚 于 2020-12-09 设计创作，主要内容包括：本发明涉及生物检测领域,提供了一种抗CD23蛋白单克隆抗体,其重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。用于免疫小鼠的抗原为重组蛋白,所述重组蛋白由SEQ ID No.1所示的核苷酸序列编码,经由大肠杆菌重组表达。发明人还提供了一株分泌抗CD23蛋白的杂交瘤细胞系,所述细胞系为小鼠杂交瘤细胞系9D11B6E6,保藏号为：CGMCC NO.19689。抗CD23蛋白单克隆抗体,具有高特异性、敏感性,可以特异性识别表达CD23蛋白的细胞,适用于免疫学检测,特别是免疫组化检测。(The invention relates to the field of biological detection, and provides an anti-CD 23 protein monoclonal antibody, wherein the amino acid sequences of the heavy chain and light chain variable regions are respectively the amino acid sequences shown in SEQ ID NO.2 and SEQ ID NO. 3. The antigen for immunizing mice is recombinant protein, the recombinant protein is coded by a nucleotide sequence shown in SEQ ID No.1, and is expressed through escherichia coli recombination. The inventor also provides a hybridoma cell line for secreting anti-CD 23 protein, wherein the cell line is a mouse hybridoma cell line 9D11B6E6 with the preservation number of: CGMCC NO. 19689. The anti-CD 23 protein monoclonal antibody has high specificity and sensitivity, can specifically recognize cells expressing CD23 protein, and is suitable for immunological detection, especially immunohistochemical detection.)
技术领域
本发明涉及生物检测领域，特别涉及抗CD23蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用。
背景技术
CD23也称FcεRII，是人和脊椎动物的IgE低亲和力受体，即IgE的II型受体；它是一种广泛分布于B细胞、嗜酸粒细胞(EOS)、激活的单核/巨噬细胞、血小板、滤泡树突状细胞、朗格汉斯细胞(Langhans Cells)、表皮角细胞、胸腺上皮细胞、部分T细胞、自然杀伤细胞等细胞膜表面的跨膜糖蛋白。分子量为45kDa。，属于典型II型穿膜糖蛋白，由321个氨基酸组成，包括由23个氨基酸残基组成的胞内N-末端、21个氨基酸残基组成的穿膜区及277个氨基酸残基组成的的C-末端膜外区；其羧基末端位于细胞外，氨基末端位于细胞内，属于C型动物凝集素超家族。
人CD23基因位于19号染色体上，是单拷贝基因，有两种类型，由于它们的启动基因不同造成所编码的CD23分子氨基末端的6个氨基酸不同，形成了两种CD23：CD23a和CD23b。CD23a主要在B淋巴细胞和嗜酸性细胞中表达，而CD23b在激活的单核/巨噬细胞、B细胞、嗜酸性粒细胞、血小板、滤泡树突状细胞、朗格汉斯细胞、表皮角细胞、胸腺上皮细胞、部分T细胞、自然杀伤细胞及某些白血病细胞上都有表达。骨髓腔基质来源的巨噬细胞高表达CD23b。细胞膜表面CD23可由自身或被蛋白水解酶裂解为多种大小不等的可溶性片段，称为可溶性CD23(sCD23)，这些片段大部分仍可与IgE结合，且表现出与IgE无关的多种功能。
CD23是多功能受体分子/细胞因子，它参与调节IgE的合成、促进B细胞激活、增殖和分化，并通过与膜CD21的结合介导B-T细胞相互作用、增强B细胞向T细胞提呈抗原，促进T细胞成熟。可溶性CD23(sCD23)还可协同IL-1促进胸腺细胞、骨髓前体细胞、生发中心B细胞增殖和分化，抑制单核细胞游走，诱导单核细胞释放TNF-α、IL-1和IL-6。CD23表达于外周血细胞的某些亚群、B淋巴细胞和EB病毒转染的B淋巴瘤细胞系，在慢性淋巴细胞白血病和部分中心母细胞淋巴瘤中也有0表达；可能通过促进B细胞活化、分化、成熟、防止生发中心B细胞凋亡，使B细胞出现高反应性、合成和分泌自身抗体、引起自身免疫。可溶性CD23(sCD23)与支气管哮喘关系密切，在细胞间粘附、抗原的呈递、T和B细胞的活化、IgE合成、哮喘相关基因的转录等过程中可能发挥重要作用。
CD23与Bc、Tc的增殖与分化有密切关系，同时与许多疾病有关，如:鼻咽癌、慢性B淋巴细胞白血病，这些细胞表面可表达CD23分子。国际上已研制出一些抗人CD23单抗，但抗体种类有限，研制CD23单抗不仅可弥补国际上抗体种类的不足，还填补了国内空白，解决抗体来源困难问题。
发明内容
发明人提供了一种抗CD23蛋白单克隆抗体，所述单克隆抗体重链和轻链可变区的氨基酸序列分别是SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。
进一步地，所述单克隆抗体重链和轻链可变区氨基酸序列分别是SEQ ID NO.4和SEQ ID NO.5所示的核苷酸序列所编码。
进一步地，所述单克隆抗体特异性识别CD23蛋白。
进一步地，所述单克隆抗体特异性识别中SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。
进一步地，所述单克隆抗体由保藏号为CGMCC NO.19689的杂交瘤细胞系产生。所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系9D11B6E6，分类命名为：小鼠杂交瘤细胞系，该细胞系已于2020年04月24日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
进一步地，所述抗CD23蛋白为小鼠IgG1亚型单克隆抗体。
进一步地，所述抗CD23蛋白单克隆抗体以重组蛋白为免疫原进行制备所述重组蛋白包含具有抗原性的CD23片段以及组氨酸蛋白标签，所述CD23片段为人CD23蛋白的第48位至第321位氨基酸片段。
发明人还提供了一株分泌抗CD23蛋白的杂交瘤细胞系，所述细胞株为小鼠杂交瘤细胞系9D11B6E6，所述细胞系保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期为2020年4月24日，保藏号为：CGMCC NO.19689。
发明人还提供上述任一所述的抗CD23蛋白单克隆抗体，在CD23蛋白免疫检测中的用途。
进一步地，所述免疫检测包括免疫组织化学法，免疫印迹法和酶联免疫法。
区别于现有技术，上述技术方案选择适宜可溶表达又具有良好免疫原性的CD23第48位至第321位氨基酸区域用于重组表达。6个His的组氨酸标签可作为融合蛋白的纯化标签。对小鼠进行免疫，经细胞融合、筛选和亚克隆，获得高效分泌抗CD23蛋白单克隆抗体的单克隆细胞系9D11B6E6,以及由该细胞系所分泌的抗CD23蛋白单克隆抗体。本方案得到的抗体具有高特异性、敏感性，可以特异性识别表达CD23蛋白的细胞，适用于免疫学检测，特别是免疫组化检测,可降低误读，提高诊断的准确性。
附图说明
图1：CD23抗原纯化后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图2：纯化后CD23单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
图3：B细胞淋巴瘤免疫组化染色结果图(左为(9D11B6E6)的CD23，右为市售CD23(SP23)兔单抗)。
具体实施方式
实施例1重组CD23蛋白片段的制备
一、基因克隆
从Uniprot数据库(http://www.uniprot.org)中选择编号P06734的CD23蛋白序列作为标准序列。依据其与DNA结合的结构、抗原性、组成氨基酸的亲疏水性以及二级结构，选择具有区别于其他类似蛋白、长度适宜且具有特殊抗原性的区域作为抗原肽。选定CD23氨基酸序列第48位至第321位序列，其对应的核苷酸序列为SEQ ID No.1。将目的蛋白片段连接于质粒载体petβ2M上(petβ2M载体采购自武汉金开瑞生物工程有限公司，内含β2M蛋白序列及His标签)合成以上CD23重组蛋白质粒。转化至大肠杆菌感受态细胞TOP10中，挑取平板上的克隆接种扩培，提取质粒DNA，进行PCR鉴定。将PCR显示目的基因阳性的克隆进行测序分析，序列完全正确的克隆用于进行下一步实验。
β2M为I类主要组织相容性复合物(MHC)的组分，参与抗原肽向免疫系统的呈递，促进抗体的生成。6-His的组氨酸标签可作为融合蛋白的纯化标签。
二、重组蛋白表达纯化
将重组质粒转化至大肠杆菌感受态细胞Rosetta中，挑取平板上的克隆接种扩培，保菌。接菌液至4mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃，270rpm条件下振荡培养过夜。然后转接至200mL含50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃、270rpm条件下振荡培养8H后,收集菌体。将表达重组蛋白的菌体进行超声波破碎处理。将菌液8000g离心10min，去上清培养基，保留菌体用适量的PBS缓冲液重悬洗涤，菌体中加入镍柱平衡缓冲液进行超声破碎。超声破碎至菌液澄清后，离心，分别收集沉淀及上清。将破碎上清、沉淀以及经诱导表达的菌体进行SDS-PAGE电泳，分析重组蛋白的存在位置。
采用镍柱亲和层析法纯化重组蛋白。纯化主要步骤参照常州天地人和生物科技有限公司说明书进行。纯化后的目的蛋白进行透析除盐，并用超滤管进行浓缩。最后通过紫外微量分光光度计测定蛋白浓度，通过SDS-PAGE电泳检测蛋白纯度。图1为CD23抗原纯化后的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。
实施例2 9D11B6E6杂交瘤细胞系的建立
一、免疫
将实施例1中获得的CD23蛋白稀释至1mg/mL，然后与等体积的完全弗氏佐剂(CFA,Sigma公司)混合乳化，对18-20g的Balb/c小鼠(购自福州吴氏实验动物)进行腹部注射免疫，注射剂量为50μg/只。此后每14天加强免疫一次，抗原使用弗氏非完全佐剂(IFA,Sigma公司)乳化，剂量为25μg/只。第2次加强免疫后14天以间接ELISA(波长450nm)检测小鼠血清中抗免疫原的多抗效价，效价最高的小鼠以尾静脉注射冲击免疫，抗原用PBS溶液混匀，剂量为50μg/只。
二、细胞融合
无菌制备免疫达标的小鼠脾细胞悬液，与小鼠骨髓瘤细胞sp2/0(ATCC)以5:1比例混合，1000rpm离心10min，弃上清后，在1分钟内由慢到快加入1mL预热至37℃的PEG(Sigma公司)溶液，加入过程中需轻轻转动离心管，使细胞与PEG充分接触。室温静置90s后，2min内由慢到快加入4mL预热至37℃的无血清DMEM(Hyclone公司)培养基，随后的2min内再加入10mL预热无血清DMEM培养基，最后2min内加完剩余的预热无血清DMEM培养基，定容至50mL，整个加入过程需要缓慢摇动离心管，确保混合均匀，减轻对细胞的伤害。室温静置10min后离心(1000rpm，5min)，弃上清，用10-20mLHAT(Sigma公司)培养基重悬细胞，并用HAT培养基稀释至终浓度为0.5×106cells/mL，所有溶液转移至96孔板中，200μL/孔，并做好标记。将96孔培养板小心转移至37℃，5％CO2培养箱中培养。定期检查细胞的生长状态及潜在的污染，注意尽量少开合培养箱，确保培养环境稳定。融合后第5天，向培养板中补加HAT培养基，50μL/孔。
三、ELISA筛选阳性杂交瘤细胞
当融合细胞直径长至大概为1-2mm时，吸取50-200μL培养液上清进行首次细胞筛选(ELISA、IHC-P及其他方法检测)，同时往培养孔中补加HAT培养基至200μL。ELISA检测该培养液上清，将检测得到阳性结果的培养孔内细胞培养液全部转移至24孔培养板，补加HT培养基，2mL/孔，培养3天。
重复筛选24孔板中各细胞株，剔除不是阳性结果的培养孔细胞，获得阳性结果较好的培养孔细胞。将这些24孔培养板得到的阳性孔细胞采用有限稀释法进行亚克隆筛选，即将有限稀释法得到细胞液加入96孔培养板中转移至CO2培养箱培养11天，待克隆细胞直径为1-2mm时，重复进行细胞筛选。根据检测结果，每个亚克隆细胞株，选取4个生长良好的单克隆阳性培养孔，并转移至24孔板中继续培养。一段时间后再次筛选24孔板中克隆得到的阳性克隆细胞株，即为分泌特定单克隆抗体的杂交瘤细胞株9D11B6E6。将此细胞株转入T-75培养瓶中扩增至对数生长期保种或进行后续实验。
实施例3体外培养法制备单克隆抗体
一、体外培养
获得稳定的杂交瘤细胞系后，主要采用体外培养法获取单抗。
以含10％胎牛血清的DMEM完全培养基培养杂交瘤细胞，然后低速离心后收集培养上清，4℃储存备用。
二、单克隆抗体的纯化
用rProtein A sepharose Fast Flow(GE公司)亲和层析柱纯化抗体：①装柱，将购买的ProteinA填料适量装于重力层析柱中用平衡缓冲液(0.1M Tris溶液，pH7.0)冲洗至平衡；②上样，将经过0.24μm滤膜过滤的腹水加入装好的层析柱中，控制流速1滴/秒；③平衡，上完样液后使用平衡缓冲液冲洗至平衡；④洗脱，加入洗脱缓冲液(0.1M柠檬酸溶液，pH3.0)冲洗柱子并收集洗脱液；⑤再生，洗脱完成后加入平衡缓冲液冲洗柱子至平衡，2倍柱体积的20％乙醇冲洗后置于4℃保存。最后采用SDS-PAGE法鉴定抗体纯度(如图2纯化后CD23单克隆抗体的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。),纯度达95％以上，紫外微量分光光度计法测定抗体浓度，浓度达到3.0mg/mL以上。
实施例4单克隆抗体特性鉴定
一、亚型鉴定
将细胞上清稀释成1μg/mL包被酶标板,每孔加100μL，4℃包被过夜，倾空液体，用含0.05％Tween的PBS(PBS-T)洗板3次，每孔加入200μL封闭液(含2％BSA的PBS-T溶液)，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加入稀释5倍的0.1mL杂交瘤细胞株培养液上清，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。用封闭液1：400稀释HRP标记的羊抗鼠(κ,λ，IgM，IgG1，IgG2a，IgG2b，IgG3，IgA)抗体(Southern Biotech公司)，每孔分别加入0.1mL，37℃孵育1h。倾空液体，用PBS-T清洗3次。每孔加100μLTMB(湖州英创生物科技有限公司)底物(A、B等体积混合溶液)进行显色,室温反应15min，每孔加入50μL 1N HCl溶液终止显色反应，然后酶标仪测定450nm波长下的OD值。结果显示，本发明单克隆抗体为IgG1型鼠源单克隆抗体。
二、亲和常数测定
包被CD23蛋白，包被浓度为100μg/ml,100μl/孔，4℃包被过夜，PBS-T洗3次。每孔加200μl封闭液37℃封闭1h，PBS-T洗3次。实施例4中纯化的单克隆抗体，稀释成以下浓度(单位：ng/mL)：2000、500、125、62.5、31.25、15.625、3.125、0.625，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。HRP标记的羊抗鼠二抗1：5000稀释，每孔100μl，37℃孵育1h，PBS-T洗3次。每孔加入100μl TMB(湖州英创生物科技有限公司)显色液，显色13min，加100μl 1.0N盐溶液终止反应。用酶标仪测定波长450nm的吸光值。画出OD值对应抗体稀释倍数的曲线，找出1/2“平台OD值”对应的抗体浓度A。利用下列公式计算出亲和常数为6.15×109L×mol-1。
实施例6组织芯片染色和鉴定
一、组织蜡块制备过程
对样本组织进行HE切片染色，以确定肿瘤病变部位。对病变位点画圈，预备打孔。制作受体蜡块时，将塑料架置于模具上，将融化的石蜡(熔点在56～58℃)倒入模具，将组织块放入模具中的蜡液中后再加入适量蜡液使组织块完全包埋在蜡液中，冷却至室温后将模具放入-20℃冰箱6min，将蜡块从模具中取出，切片或放入4℃冰箱内保存备用。修片后进行连续切片，厚度定为4μm，将连续切片漂40％酒精中,让其自然展开，再将分开的切片转移到45℃的温水中展片30秒，用经2％APES丙酮液处理过的载玻片裱贴切片，将制成的组织芯片放入60℃烤箱内烤片2小时，取出室温冷却，放入-4℃冰箱保存。
二、IHC染色及分析
常规二甲苯脱蜡3次，每次6分钟，100％、100％、95％、95％、85％梯度乙醇中水化，每次3分钟，最后自来水冲洗。进行抗原修复，然后将切片放入湿盒中，PBS冲洗3×3分钟。滴加3％H2O2孵育10分钟，PBS冲洗3×3分钟。甩去PBS，滴加过氧化物酶阻断剂室温孵育10分钟。甩干切片，滴加适当比例稀释的一抗(首次稀释根据抗体浓度来设计抗体的稀释比例)室温(25℃)孵育1小时，PBS冲洗3×3分钟，滴加二抗室温孵育30分钟，PBS冲洗3×3分钟，甩去PBS，用新鲜配置的DAB显色液显色3-10分钟。苏木素复染20秒，PBS返蓝。按照85％(3分钟)、95％(3分钟)、95％(3分钟)、100％(3分钟)、100％(3分钟)的酒精梯度依次脱水，最后两次二甲苯透明10分钟，中性树胶封片。
免疫组化染色结果分为：阳性和阴性。阳性表达必须在细胞和组织特定的抗原部位才能视为阳性。在组织染色分布清晰及细胞定位准确的情况下，染色结果根据染色强度的差异进行进一步划分，具体如下：
1、样本为弱阳性；标记为“+”；
2、样本为中度阳性；标记为“++”；
3、样本为高度阳性；标记为“+++”；
4、样本为阴性，标记为“-”。
三、样本检测结果：
用抗CD23蛋白单克隆抗体(9D11B6E6)和对照抗体-市售抗CD23(SP23)兔单抗在49例B细胞淋巴瘤上进行同步检测，结果如下表所示。
结果显示:抗CD23蛋白单克隆抗体(9D11B6E6)的染色定位准确，染色清晰且无非特异性染色，背景干净，说明抗CD23蛋白单克隆抗体(9D11B6E6)特异性强。在49例B细胞淋巴瘤中，使用抗CD23蛋白单克隆抗体(9D11B6E6)的阳性细胞数和阳性强度高于使用对照试剂，说明抗CD23蛋白单克隆抗体(9D11B6E6)的敏感性和亲和力高于市售抗体。
而用抗CD23蛋白单克隆抗体(9D11B6E6)和对照抗体-市售兔多抗，在正常组织芯片上进行同步检测，样本阳性和阴性结果一致，说明本抗体在正常组织的特异性同市售抗体相当。
图3为B细胞淋巴瘤免疫组化染色结果图(左为(9D11B6E6)的CD23，右为市售CD23(SP23)兔单抗)。其中，9D11B6E6的CD23的染色的阳性细胞数和阳性强度明显高于市售CD23(SP23)兔单抗的染色强度，说明其敏感度更高。
序列表
<110> 福州迈新生物技术开发有限公司
<120> 抗CD23蛋白单克隆抗体、细胞系及其制备方法和应用
<130> 2020
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 274
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 1
Asp Thr Thr Gln Ser Leu Lys Gln Leu Glu Glu Arg Ala Ala Arg Asn
1 5 10 15
Val Ser Gln Val Ser Lys Asn Leu Glu Ser His His Gly Asp Gln Met
20 25 30
Ala Gln Lys Ser Gln Ser Thr Gln Ile Ser Gln Glu Leu Glu Glu Leu
35 40 45
Arg Ala Glu Gln Gln Arg Leu Lys Ser Gln Asp Leu Glu Leu Ser Trp
50 55 60
Asn Leu Asn Gly Leu Gln Ala Asp Leu Ser Ser Phe Lys Ser Gln Glu
65 70 75 80
Leu Asn Glu Arg Asn Glu Ala Ser Asp Leu Leu Glu Arg Leu Arg Glu
85 90 95
Glu Val Thr Lys Leu Arg Met Glu Leu Gln Val Ser Ser Gly Phe Val
100 105 110
Cys Asn Thr Cys Pro Glu Lys Trp Ile Asn Phe Gln Arg Lys Cys Tyr
115 120 125
Tyr Phe Gly Lys Gly Thr Lys Gln Trp Val His Ala Arg Tyr Ala Cys
130 135 140
Asp Asp Met Glu Gly Gln Leu Val Ser Ile His Ser Pro Glu Glu Gln
145 150 155 160
Asp Phe Leu Thr Lys His Ala Ser His Thr Gly Ser Trp Ile Gly Leu
165 170 175
Arg Asn Leu Asp Leu Lys Gly Glu Phe Ile Trp Val Asp Gly Ser His
180 185 190
Val Asp Tyr Ser Asn Trp Ala Pro Gly Glu Pro Thr Ser Arg Ser Gln
195 200 205
Gly Glu Asp Cys Val Met Met Arg Gly Ser Gly Arg Trp Asn Asp Ala
210 215 220
Phe Cys Asp Arg Lys Leu Gly Ala Trp Val Cys Asp Arg Leu Ala Thr
225 230 235 240
Cys Thr Pro Pro Ala Ser Glu Gly Ser Ala Glu Ser Met Gly Pro Asp
245 250 255
Ser Arg Pro Asp Pro Asp Gly Arg Leu Pro Thr Pro Ser Ala Pro Leu
260 265 270
His Ser
<210> 2
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 2
Met Asn Leu Gly Leu Ser Phe Ile Phe Leu Ala Leu Ile Leu Lys Gly
1 5 10 15
Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln
20 25 30
Pro Gly Gly Ser Leu Lys Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe
35 40 45
Ser Ser Phe Gly Met Ser Trp Val Arg Gln Thr Pro Asp Lys Arg Leu
50 55 60
Glu Leu Val Ala Ser Ile Asn Ser Asn Gly Gly Thr Thr Tyr Tyr Pro
65 70 75 80
Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn
85 90 95
Thr Leu Tyr Leu Gln Met Ser Ser Leu Lys Ser Glu Asp Thr Ala Ile
100 105 110
Tyr Tyr Cys Thr Arg Gly Ser Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr
115 120 125
Val Ser Ala
130
<210> 3
<211> 131
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 3
Met Ser Pro Ala Gln Phe Leu Phe Leu Leu Val Leu Trp Ile Arg Glu
1 5 10 15
Thr Asn Gly Asp Val Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Thr Leu Ser Val
20 25 30
Thr Ile Gly Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu
35 40 45
Leu Asp Ser Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Asn Trp Leu Leu Gln Arg Pro
50 55 60
Gly Gln Ser Pro Lys Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Lys Leu Asp Ser
65 70 75 80
Gly Val Arg Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr
85 90 95
Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Ile Tyr Tyr Cys
100 105 110
Trp Gln Gly Thr His Phe Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu
115 120 125
Glu Ile Lys
130
<210> 4
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 4
atgaacttag ggctcagctt cattttcctt gcccttattt taaaaggtgt ccagtgtgag 60
gtgcagctgg tggagtctgg gggaggctta gtgcagcctg gagggtccct gaaactctcc 120
tgtgcagcct ctggattcac tttcagtagc tttggcatgt cttgggttcg ccagactcca 180
gacaagaggc tggagttggt cgcaagcatt aatagtaatg gtggtaccac ctattatcca 240
gacagtgtga agggccgatt caccatctcc agagacaatg ccaagaacac cctgtacctg 300
caaatgagca gtctgaagtc tgaggacaca gccatatatt actgtacaag aggctcttac 360
tggggccaag ggactctggt cactgtctct gca 393
<210> 5
<211> 393
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial)
<400> 5
atgagtcctg cccagttcct gtttctgtta gtgctctgga ttcgggaaac caacggtgat 60
gttgtgatga cccagactcc actcactttg tcggttacca ttggacaacc agcctccatt 120
tcttgcaagt caagtcagag cctcttagat agtgatggaa agacatattt gaattggttg 180
ttacagaggc caggccagtc tccaaagcgc ctaatctatc tggtgtctaa actggactct 240
ggagtccgtg acaggttcac tggcagtgga tcagggacag atttcacact gaaaatcagc 300
agagtggagg ctgaggattt gggaatttat tattgctggc aaggtacaca ttttccgtac 360
acgttcggag gggggaccaa gctggaaata aaa 393