新型冠状病毒抗体及其应用

文档序号：93511 发布日期：2021-10-12 浏览：17次 >En<

阅读说明：本技术 新型冠状病毒抗体及其应用 (Novel coronavirus antibody and application thereof ) 是由张政张林琦刘磊张绮鞠斌史宣玲于 2020-03-20 设计创作，主要内容包括：本发明的目的是提供新型冠状病毒抗体及其应用。本发明提供了一种IgG抗体,由重链和轻链组成。重链如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：9、SEQ ID NO：13、SEQ ID NO：17、SEQ ID NO：21、SEQ ID NO：25、SEQ ID NO：29、SEQ ID NO：33、SEQ ID NO：37、SEQ ID NO：41或SEQ ID NO：45所示。轻链如SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：7、SEQ ID NO：11、SEQ ID NO：15、SEQ ID NO：19、SEQ ID NO：23、SEQ ID NO：27、SEQ ID NO：31、SEQ ID NO：35、SEQ ID NO：39、SEQ ID NO：43或SEQ ID NO：47所示。本发明对于新型冠状病毒肺炎的防控具有重大的应用价值,将产生深远的社会意义。(The invention aims to provide a novel coronavirus antibody and application thereof. The invention provides an IgG antibody, which consists of a heavy chain and a light chain. The heavy chain is shown as SEQ ID NO: 1. SEQ ID NO: 5. SEQ ID NO: 9. SEQ ID NO: 13. SEQ ID NO: 17. SEQ ID NO: 21. SEQ ID NO: 25. SEQ ID NO: 29. SEQ ID NO: 33. SEQ ID NO: 37. SEQ ID NO: 41 or SEQ ID NO: shown at 45. The light chain is shown as SEQ ID NO: 3. SEQ ID NO: 7. SEQ ID NO: 11. SEQ ID NO: 15. SEQ ID NO: 19. SEQ ID NO: 23. SEQ ID NO: 27. SEQ ID NO: 31. SEQ ID NO: 35. SEQ ID NO: 39. SEQ ID NO: 43 or SEQ ID NO: shown at 47. The invention has great application value for preventing and controlling the novel coronavirus pneumonia, and can generate profound social significance.)

新型冠状病毒抗体及其应用

技术领域

本发明属于生物

技术领域

，具体涉及新型冠状病毒抗体及其应用。

背景技术

中国将SARS-CoV-2引起的疾病命名为新型冠状病毒肺炎，世界卫生组织将 SARS-CoV-2引发的疾病命名为2019冠状病毒病，英文缩写COVID-19(Corona Virus Disease2019)。

冠状病毒由于其不可预测性，可通过飞沫传播、接触呼吸道分泌物等途径传播，带来严重后果，已成为影响人类健康的重大威胁之一。

冠状病毒是一类有包膜的RNA病毒。病毒的基因组为无节段的单股正链RNA，是目前已知最大的RNA病毒，编码DNA长度约为26-32kb。冠状病毒主要编码结构蛋白S、 M、E、N和非结构蛋白NSP1-16。S蛋白形成同源三聚体，构成病毒颗粒表面的刺突，主要负责与宿主受体的结合。M蛋白可与核衣壳结合，在包膜的形成及装配过程中发挥作用。E蛋白主要负责病毒的组装和释放。N蛋白为核衣壳蛋白，与病毒RNA基因组结合。部分冠状病毒还编码HE糖蛋白，参与病毒与受体的结合过程。

发明内容

本发明的目的是提供新型冠状病毒抗体及其应用。

本发明提供了抗体，包括重链和轻链，其特征在于：

重链的CDR选自36个CDRs中的至少一个；36个CDRs的序列分别如下：SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62、SEQ ID NO：63、SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68、SEQ ID NO： 69、SEQ IDNO：73、SEQ ID NO：74、SEQ ID NO：75、SEQ ID NO：79、SEQ ID NO： 80、SEQ ID NO：81、SEQID NO：85、SEQ ID NO：86、SEQ ID NO：87、SEQ ID NO： 91、SEQ ID NO：92、SEQ ID NO：93、SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98、SEQ ID NO： 99、SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104、SEQ IDNO：105、SEQ ID NO：109、SEQ ID NO： 110、SEQ ID NO：111、SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116、SEQ ID NO：117、SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122、SEQ ID NO：123、SEQ ID NO：127、SEQID NO：128、SEQ ID NO：129；

轻链的CDR选自36个CDRs中的至少一个；36个CDRs的序列分别如下：SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65、SEQ ID NO：66、SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71、SEQ ID NO： 72、SEQ IDNO：76、SEQ ID NO：77、SEQ ID NO：78、SEQ ID NO：82、SEQ ID NO： 83、SEQ ID NO：84、SEQID NO：88、SEQ ID NO：89、SEQ ID NO：90、SEQ ID NO： 94、SEQ ID NO：95、SEQ ID NO：96、SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101、SEQ ID NO：102、SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107、SEQ IDNO：108、SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113、SEQ ID NO：114、SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119、SEQ ID NO：120、SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125、SEQ ID NO：126、SEQ ID NO：130、SEQ IDNO：131、 SEQ ID NO：132。

具体的，重链的三个CDR为如下(a1)至(a12)中任一所述：

(a1)依次如SEQ ID NO：61、SEQ ID NO：62和SEQ ID NO：63所示；

(a2)依次如SEQ ID NO：67、SEQ ID NO：68和SEQ ID NO：69所示；

(a3)依次如SEQ ID NO：73、SEQ ID NO：74和SEQ ID NO：75所示；

(a4)依次如SEQ ID NO：79、SEQ ID NO：80和SEQ ID NO：81所示；

(a5)依次如SEQ ID NO：85、SEQ ID NO：86和SEQ ID NO：87所示；

(a6)依次如SEQ ID NO：91、SEQ ID NO：92和SEQ ID NO：93所示；

(a7)依次如SEQ ID NO：97、SEQ ID NO：98和SEQ ID NO：99所示；

(a8)依次如SEQ ID NO：103、SEQ ID NO：104和SEQ ID NO：105所示；

(a9)依次如SEQ ID NO：109、SEQ ID NO：110和SEQ ID NO：111所示；

(a10)依次如SEQ ID NO：115、SEQ ID NO：116和SEQ ID NO：117所示；

(a11)依次如SEQ ID NO：121、SEQ ID NO：122和SEQ ID NO：123所示；

(a12)依次如SEQ ID NO：127、SEQ ID NO：128和SEQ ID NO：129所示。

具体的，轻链的三个CDR为如下(b1)至(b12)中任一所述：

(b1)依次如SEQ ID NO：64、SEQ ID NO：65和SEQ ID NO：66所示；

(b2)依次如SEQ ID NO：70、SEQ ID NO：71和SEQ ID NO：72所示；

(b3)依次如SEQ ID NO：76、SEQ ID NO：77和SEQ ID NO：78所示；

(b4)依次如SEQ ID NO：82、SEQ ID NO：83和SEQ ID NO：84所示；

(b5)依次如SEQ ID NO：88、SEQ ID NO：89和SEQ ID NO：90所示；

(b6)依次如SEQ ID NO：94、SEQ ID NO：95和SEQ ID NO：96所示；

(b7)依次如SEQ ID NO：100、SEQ ID NO：101和SEQ ID NO：102所示；

(b8)依次如SEQ ID NO：106、SEQ ID NO：107和SEQ ID NO：108所示；

(b9)依次如SEQ ID NO：112、SEQ ID NO：113和SEQ ID NO：114所示；

(b10)依次如SEQ ID NO：118、SEQ ID NO：119和SEQ ID NO：120所示；

(b11)依次如SEQ ID NO：124、SEQ ID NO：125和SEQ ID NO：126所示；

(b12)依次如SEQ ID NO：130、SEQ ID NO：131和SEQ ID NO：132所示。

具体的，重链的可变区为如下(c1)至(c12)中任一所述：

(c1)如SEQ ID NO：1中第20至149位氨基酸残基所示；

(c2)如SEQ ID NO：5中第20至143位氨基酸残基所示；

(c3)如SEQ ID NO：9中第20至145位氨基酸残基所示；

(c4)如SEQ ID NO：13中第20至142位氨基酸残基所示；

(c5)如SEQ ID NO：17中第20至146位氨基酸残基所示；

(c6)如SEQ ID NO：21中第20至137位氨基酸残基所示；

(c7)如SEQ ID NO：25中第20至143位氨基酸残基所示；

(c8)如SEQ ID NO：29中第20至138位氨基酸残基所示；

(c9)如SEQ ID NO：33中第20至139位氨基酸残基所示；

(c10)如SEQ ID NO：37中第20至137位氨基酸残基所示；

(c11)如SEQ ID NO：41中第20至140位氨基酸残基所示；

(c12)如SEQ ID NO：45中第20至136位氨基酸残基所示。

具体的，轻链的可变区为如下(d1)至(d12)中任一所述：

(d1)如SEQ ID NO：3中第20至129位氨基酸残基所示；

(d2)如SEQ ID NO：7中第20至130位氨基酸残基所示；

(d3)如SEQ ID NO：11中第20至132位氨基酸残基所示；

(d4)如SEQ ID NO：15中第20至128位氨基酸残基所示；

(d5)如SEQ ID NO：19中第20至129位氨基酸残基所示；

(d6)如SEQ ID NO：23中第20至130位氨基酸残基所示；

(d7)如SEQ ID NO：27中第20至130位氨基酸残基所示；

(d8)如SEQ ID NO：31中第20至126位氨基酸残基所示；

(d9)如SEQ ID NO：35中第20至131位氨基酸残基所示；

(d10)如SEQ ID NO：39中第20至125位氨基酸残基所示；

(d11)如SEQ ID NO：43中第20至127位氨基酸残基所示；

(d12)如SEQ ID NO：47中第20至126位氨基酸残基所示。

具体的，重链为如下(e1)至(e24)中任一所述：

(e1)如SEQ ID NO：1中第20至479位氨基酸残基所示；

(e2)如SEQ ID NO：1所示；

(e3)如SEQ ID NO：5中第20至473位氨基酸残基所示；

(e4)如SEQ ID NO：5所示；

(e5)如SEQ ID NO：9中第20至475位氨基酸残基所示；

(e6)如SEQ ID NO：9所示；

(e7)如SEQ ID NO：13中第20至472位氨基酸残基所示；

(e8)如SEQ ID NO：13所示；

(e9)如SEQ ID NO：17中第20至476位氨基酸残基所示；

(e10)如SEQ ID NO：17所示；

(e11)如SEQ ID NO：21中第20至467位氨基酸残基所示；

(e12)如SEQ ID NO：21所示；

(e13)如SEQ ID NO：25中第20至473位氨基酸残基所示；

(e14)如SEQ ID NO：25所示；

(e15)如SEQ ID NO：29中第20至468位氨基酸残基所示；

(e16)如SEQ ID NO：29所示；

(e17)如SEQ ID NO：33中第20至469位氨基酸残基所示；

(e18)如SEQ ID NO：33所示；

(e19)如SEQ ID NO：37中第20至467位氨基酸残基所示；

(e20)如SEQ ID NO：37所示；

(e21)如SEQ ID NO：41中第20至470位氨基酸残基所示；

(e22)如SEQ ID NO：41所示；

(e23)如SEQ ID NO：45中第20至466位氨基酸残基所示；

(e24)如SEQ ID NO：45所示。

具体的，轻链为如下(f1)至(f24)中任一所述：

(f1)如SEQ ID NO：3中第20至235位氨基酸残基所示；

(f2)如SEQ ID NO：3所示；

(f3)如SEQ ID NO：7中第20至236位氨基酸残基所示；

(f4)如SEQ ID NO：7所示；

(f5)如SEQ ID NO：11中第20至239位氨基酸残基所示；

(f6)如SEQ ID NO：11所示；

(f7)如SEQ ID NO：15中第20至235位氨基酸残基所示；

(f8)如SEQ ID NO：15所示；

(f9)如SEQ ID NO：19中第20至235位氨基酸残基所示；

(f10)如SEQ ID NO：19所示；

(f11)如SEQ ID NO：23中第20至236位氨基酸残基所示；

(f12)如SEQ ID NO：23所示；

(f13)如SEQ ID NO：27中第20至236位氨基酸残基所示；

(f14)如SEQ ID NO：27所示；

(f15)如SEQ ID NO：31中第20至233位氨基酸残基所示；

(f16)如SEQ ID NO：31所示；

(f17)如SEQ ID NO：35中第20至238位氨基酸残基所示；

(f18)如SEQ ID NO：35所示；

(f19)如SEQ ID NO：39中第20至232位氨基酸残基所示；

(f20)如SEQ ID NO：39所示；

(f21)如SEQ ID NO：43中第20至233位氨基酸残基所示；

(f22)如SEQ ID NO：43所示；

(f23)如SEQ ID NO：47中第20至233位氨基酸残基所示；

(f24)如SEQ ID NO：47所示。

具体的，所述抗体为如下12种抗体中的任意一种：

抗体中，重链的三个CDR如(a1)所述并且轻链的三个CDR如(b1)所述；

抗体中，重链的三个CDR如(a2)所述并且轻链的三个CDR如(b2)所述；

抗体中，重链的三个CDR如(a3)所述并且轻链的三个CDR如(b3)所述；

抗体中，重链的三个CDR如(a4)所述并且轻链的三个CDR如(b4)所述；

抗体中，重链的三个CDR如(a5)所述并且轻链的三个CDR如(b5)所述；

抗体中，重链的三个CDR如(a6)所述并且轻链的三个CDR如(b6)所述；

抗体中，重链的三个CDR如(a7)所述并且轻链的三个CDR如(b7)所述；

抗体中，重链的三个CDR如(a8)所述并且轻链的三个CDR如(b8)所述；

抗体中，重链的三个CDR如(a9)所述并且轻链的三个CDR如(b9)所述；

抗体中，重链的三个CDR如(a10)所述并且轻链的三个CDR如(b10)所述；

抗体中，重链的三个CDR如(a11)所述并且轻链的三个CDR如(b11)所述；

抗体中，重链的三个CDR如(a12)所述并且轻链的三个CDR如(b12)所述。

具体的，所述抗体为如下12种抗体中的任意一种：

抗体中，重链的可变区如(c1)所述并且轻链的可变区如(d1)所述；

抗体中，重链的可变区如(c2)所述并且轻链的可变区如(d2)所述；

抗体中，重链的可变区如(c3)所述并且轻链的可变区如(d3)所述；

抗体中，重链的可变区如(c4)所述并且轻链的可变区如(d4)所述；

抗体中，重链的可变区如(c5)所述并且轻链的可变区如(d5)所述；

抗体中，重链的可变区如(c6)所述并且轻链的可变区如(d6)所述；

抗体中，重链的可变区如(c7)所述并且轻链的可变区如(d7)所述；

抗体中，重链的可变区如(c8)所述并且轻链的可变区如(d8)所述；

抗体中，重链的可变区如(c9)所述并且轻链的可变区如(d9)所述；

抗体中，重链的可变区如(c10)所述并且轻链的可变区如(d10)所述；

抗体中，重链的可变区如(c11)所述并且轻链的可变区如(d11)所述；

抗体中，重链的可变区如(c12)所述并且轻链的可变区如(d12)所述。

具体的，所述抗体为如下24种抗体中的任意一种：

抗体中，重链如(e1)所述并且轻链如(f1)所述；

抗体中，重链如(e2)所述并且轻链如(f2)所述；

抗体中，重链如(e3)所述并且轻链如(f3)所述；

抗体中，重链如(e4)所述并且轻链如(f4)所述；

抗体中，重链如(e5)所述并且轻链如(f5)所述；

抗体中，重链如(e6)所述并且轻链如(f6)所述；

抗体中，重链如(e7)所述并且轻链如(f7)所述；

抗体中，重链如(e8)所述并且轻链如(f8)所述；

抗体中，重链如(e9)所述并且轻链如(f9)所述；

抗体中，重链如(e10)所述并且轻链如(f10)所述；

抗体中，重链如(e11)所述并且轻链如(f11)所述；

抗体中，重链如(e12)所述并且轻链如(f12)所述；

抗体中，重链如(e13)所述并且轻链如(f13)所述；

抗体中，重链如(e14)所述并且轻链如(f14)所述；

抗体中，重链如(e15)所述并且轻链如(f15)所述；

抗体中，重链如(e16)所述并且轻链如(f16)所述；

抗体中，重链如(e17)所述并且轻链如(f17)所述；

抗体中，重链如(e18)所述并且轻链如(f18)所述；

抗体中，重链如(e19)所述并且轻链如(f19)所述；

抗体中，重链如(e20)所述并且轻链如(f20)所述；

抗体中，重链如(e21)所述并且轻链如(f21)所述；

抗体中，重链如(e22)所述并且轻链如(f22)所述；

抗体中，重链如(e23)所述并且轻链如(f23)所述；

抗体中，重链如(e24)所述并且轻链如(f24)所述。

以上任一所述抗体具体为中和SARS-CoV-2的抗体。

以上任一所述抗体具体为IgG。

以上任一所述抗体具体为IgG1、IgG2、IgG3或IgG4。

以上任一所述抗体可为人抗体、人源化抗体、多聚物形式或嵌合抗体等所有可能的方式。

本发明还提供了抗体片段，包括以上任一所述的抗体的片段；所述抗体片段为双抗体、Fab、Fab'、Fv、F(ab')2、单链抗体(scFv)、单域抗体(sdAd)、重链抗体(hcAb) 或纳米抗体(Nb或VHH)。

所述重链抗体具体为以上任一所述抗体的所述重链。

本发明还提供了以上任一所述抗体进行修饰后得到的修饰抗体或以上任一所述抗体片段进行修饰后得到的修饰抗体片段；所述修饰包括但不限于：磷酸化修饰、糖基化修饰。

本发明还提供了融合物、缀合物或聚合物，其特征在于：其包括以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段。

本发明还提供了抗体的融合蛋白，其特征在于：其包括以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段。所述融合蛋白，其还可包括信号肽或引导肽。所述融合蛋白，其还可包括靶向肽。所述融合蛋白，其还可包括标签肽。所述融合蛋白，其还可包括荧光蛋白。所述融合蛋白，其还可包括一种或多种增强半衰期的功能蛋白。

本发明还提供了编码以上任一所述抗体或编码以上任一所述抗体片段的核酸分子。所述核酸分子具体可为DNA分子，例如DNA分子或cDNA分子。所述核酸分子是正链核酸分子或有义链。所述核酸分子是与正链核酸分子或有义链配对的负链核酸分子。所述核酸分子具体可如SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：4、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：8、 SEQ ID NO：10、SEQID NO：12、SEQ ID NO：14、SEQ ID NO：16、SEQ ID NO：18、 SEQ ID NO：20、SEQ ID NO：22、SEQ ID NO：24、SEQ ID NO：26、SEQ ID NO：28、 SEQ ID NO：30、SEQ ID NO：32、SEQ ID NO：34、SEQ ID NO：36、SEQ ID NO：38、 SEQ ID NO：40、SEQ ID NO：42、SEQ ID NO：44、SEQ IDNO：46或SEQ ID NO：48 所示。

本发明还提供了具有或表达所述核酸分子的重组载体或重组细胞。示例性的，所述重组载体的出发载体可为PMD18T。示例性的，所述重组细胞的出发细胞可为293F 细胞。

本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞在制备疫苗中的应用；

所述疫苗为如下(g1)或(g2)：

(g1)治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎的疫苗；

(g2)中和SARS-CoV-2的疫苗。

本发明还提供了疫苗，其活性成分为以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞；

所述疫苗为如下(g1)或(g2)：

(g1)治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎的疫苗；

(g2)中和SARS-CoV-2的疫苗。

所述疫苗中，以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞可作为唯一活性成分，也可以作为活性成分之一。所述疫苗中，当以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞作为活性成分之一时，疫苗中还包括其他抗体或其他免疫促进剂。

本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞在制备药物中的应用；

所述药物为如下(h1)或(h2)：

(h1)治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎的药物；

(h2)中和SARS-CoV-2的药物。

本发明还提供了药物或组合物，其包含以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞；

所述药物或组合物的功能为如下(i1)或(i2)：

(i1)治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎；

(i2)中和SARS-CoV-2。

所述药物或组合物中，以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞可作为唯一活性成分，也可以作为活性成分之一。所述药物或组合物中，当以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞作为活性成分之一时，药物或组合物中还包括其他抗体或其他免疫促进剂。

本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞在制备试剂盒中的应用；

所述试剂盒的功能为如下(j1)或(j2)：

(j1)诊断或辅助诊断新型冠状病毒肺炎；

(j2)检测或辅助检测SARS-CoV-2。

本发明还提供了试剂盒，包括以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞；

所述试剂盒的功能为如下(j1)或(j2)：

(j1)诊断或辅助诊断新型冠状病毒肺炎；

(j2)检测或辅助检测SARS-CoV-2。

本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白在中和SARS-CoV-2中的应用。

本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白在通过中和SARS-CoV-2治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎中的应用。

本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞的应用，所述应用为在治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎中的应用。

本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞的应用，所述应用为诊断或辅助诊断新型冠状病毒肺炎。

本发明还提供了以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞的应用，所述应用为检测或辅助检测SARS-CoV-2。

本发明还提供了治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎的方法，包括如下步骤：施用以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞，从而治疗和/或预防新型冠状病毒肺炎。

本发明还提供了中和生物体中的SARS-CoV-2的方法，包括如下步骤：施用以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白或以上任一所述核酸分子或以上任一所述重组载体或以上任一所述重组细胞，从而中和生物体中的SARS-CoV-2。

以上任一所述施用可通过皮下、静脉内、皮内、腹膜内、口服、肌内或颅内进行。

本发明还提供了诊断或辅助诊断新型冠状病毒肺炎的方法，包括利用以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白检测SARS-CoV-2的S蛋白的步骤。

本发明还提供了检测SARS-CoV-2的S蛋白的方法，其特征在于：利用以上任一所述抗体或以上任一所述抗体片段或以上任一所述修饰抗体或以上任一所述修饰抗体片段或以上任一所述融合物或以上任一所述缀合物或以上任一所述聚合物或以上任一所述融合蛋白检测SARS-CoV-2的S蛋白。

SARS-CoV-2的S蛋白具体可如SEQ ID NO：53所示。

本发明对于新型冠状病毒肺炎的防控具有重大的应用价值，将产生深远的社会意义。

附图说明

图1为CoV-S-RBD、SARS-S-RBD和MERS-S-RBD的序列比较。

图2为抗体与CoV-S-RBD的结合活性的结果。

图3为抗体与SARS-S-RBD的结合活性的结果。

图4为抗体与MERS-S-RBD的结合活性的结果。

图5为P2C-1D5抗体、P2B-2F6抗体、P2A-1A10抗体的抗体中和活性的结果。

图6为P2C-1A3抗体、P2C-1F11抗体、P2C-1C10抗体、P2B-2G4抗体的抗体中和活性的结果。

图7为P2C-1C8抗体、P2B-2G11抗体、VRC01抗体的抗体中和活性的结果。

图8为P2A-1A9抗体、P2A-1B3抗体、P2A-1A8抗体的抗体中和活性的结果。

具体实施方式

以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不用于限制本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为自常规生化试剂商店购买得到的。以下实施例中的定量试验，均设置三次重复实验，结果取平均值。

质粒pcDNA3.1(+)：Invitrogen公司，产品目录号V790-20。293T细胞：盖德， CRL-11268。PMD18T载体：Takara，产品目录号D101A。

质粒pNL4-3R-E-luciferase(骨架质粒)：参考文献:He J,Choe S,Walker R,DiMarzio P,Morgan DO,Landau NR.J Virol 69:6705–6711,1995.。

VRC01抗体：现有技术中的HIV抗体。

实施例1、抗体的发现和制备

一、抗体的发现

从SARS-CoV-2恢复期病人的外周血单个核细胞中分离记忆性B细胞，再扩增出记忆性B细胞的抗体基因得到抗体序列。通过大量比对、分析、制备和效果验证，本发明的发明人发现了12个新的具有优异活性的SARS-CoV-2抗体(均为IgG抗体)。依次命名为： P2A-1A8抗体、P2A-1A9抗体、P2A-1A10抗体、P2A-1B3抗体、P2B-2F6抗体、P2B-2G4 抗体、P2B-2G11抗体、P2C-1A3抗体、P2C-1C8抗体、P2C-1C10抗体、P2C-1D5抗体、 P2C-1F11抗体。

P2A-1A8抗体全长重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；SEQ ID NO：1中，第 1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至149位氨基酸残基组成重链可变区，第150至479位氨基酸残基组成重链恒定区。P2A-1A8抗体全长轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：3所示；SEQ ID NO：3中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至129位氨基酸残基组成轻链可变区，第130位至235位氨基酸残基组成轻链恒定区。

P2A-1A9抗体全长重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示；SEQ ID NO：5中，第 1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至143位氨基酸残基组成重链可变区，第144至473位氨基酸残基组成重链恒定区。P2A-1A9抗体全长轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：7所示；SEQ ID NO：7中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至130位氨基酸残基组成轻链可变区，第131位至236位氨基酸残基组成轻链恒定区。

P2A-1A10抗体全长重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示；SEQ ID NO：9中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至145位氨基酸残基组成重链可变区，第146至475位氨基酸残基组成重链恒定区。P2A-1A10抗体全长轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：11所示；SEQ ID NO：11中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至132位氨基酸残基组成轻链可变区，第133位至239位氨基酸残基组成轻链恒定区。

P2A-1B3抗体全长重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：13所示；SEQ ID NO：13中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至142位氨基酸残基组成重链可变区，第143至472位氨基酸残基组成重链恒定区。P2A-1B3抗体全长轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：15所示；SEQ ID NO：15中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至128位氨基酸残基组成轻链可变区，第129位至235位氨基酸残基组成轻链恒定区。

P2B-2F6抗体全长重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：17所示；SEQ ID NO：17中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至146位氨基酸残基组成重链可变区，第147至476位氨基酸残基组成重链恒定区。P2B-2F6抗体全长轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：19所示；SEQ ID NO：19中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至129位氨基酸残基组成轻链可变区，第130位至235位氨基酸残基组成轻链恒定区。

P2B-2G4抗体全长重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：21所示；SEQ ID NO：21中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至137位氨基酸残基组成重链可变区，第138至467位氨基酸残基组成重链恒定区。P2B-2G4抗体全长轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：23所示；SEQ ID NO：23中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至130位氨基酸残基组成轻链可变区，第131位至236位氨基酸残基组成轻链恒定区。

P2B-2G11抗体全长重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：25所示；SEQ ID NO：25中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至143位氨基酸残基组成重链可变区，第144至473位氨基酸残基组成重链恒定区。P2B-2G11抗体全长轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：27所示；SEQ ID NO：27中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至130位氨基酸残基组成轻链可变区，第131位至236位氨基酸残基组成轻链恒定区。

P2C-1A3抗体全长重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：29所示；SEQ ID NO：29中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至138位氨基酸残基组成重链可变区，第139至468位氨基酸残基组成重链恒定区。P2C-1A3抗体全长轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：31所示；SEQ ID NO：31中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至126位氨基酸残基组成轻链可变区，第127位至233位氨基酸残基组成轻链恒定区。

P2C-1C8抗体全长重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：33所示；SEQ ID NO：33中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至139位氨基酸残基组成重链可变区，第140至469位氨基酸残基组成重链恒定区。P2C-1C8抗体全长轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：35所示；SEQ ID NO：35中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至131位氨基酸残基组成轻链可变区，第132位至238位氨基酸残基组成轻链恒定区。

P2C-1C10抗体全长重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：37所示；SEQ ID NO：37中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至137位氨基酸残基组成重链可变区，第138至467位氨基酸残基组成重链恒定区。P2C-1C10抗体全长轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：39所示；SEQ ID NO：39中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至125位氨基酸残基组成轻链可变区，第126位至232位氨基酸残基组成轻链恒定区。

P2C-1D5抗体全长重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：41所示；SEQ ID NO：41中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至140位氨基酸残基组成重链可变区，第141至470位氨基酸残基组成重链恒定区。P2C-1D5抗体全长轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：43所示；SEQ ID NO：43中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至127位氨基酸残基组成轻链可变区，第128位至233位氨基酸残基组成轻链恒定区。

P2C-1F11抗体全长重链的氨基酸序列如SEQ ID NO：45所示；SEQ ID NO：45中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至136位氨基酸残基组成重链可变区，第137至466位氨基酸残基组成重链恒定区。P2C-1F11抗体全长轻链的氨基酸序列如SEQ ID NO：47所示；SEQ ID NO：47中，第1至19位氨基酸残基组成信号肽(引导蛋白分泌到细胞外)，第20至126位氨基酸残基组成轻链可变区，第127位至233位氨基酸残基组成轻链恒定区。

上述12个抗体的可变区见表1。

表1

二、抗体的制备

(一)重组质粒的构建

将重链DNA分子插入PMD18T载体，得到重链表达载体。

将轻链DNA分子插入PMD18T载体，得到轻链表达载体。

重链DNA分子为双链DNA分子，自上游至下游依次由如下三个区段组成：SEQ IDNO： 49所示的DNA分子、重链编码区、SEQ ID NO：50所示的DNA分子。SEQ ID NO：49 中，第1至888位核苷酸组成CMV启动子，第889-945位核苷酸编码信号肽。SEQ ID NO： 50中，第1至3位为终止密码子，第4-201位核苷酸为ployA片段。

轻链DNA分子为双链DNA分子，自上游至下游依次由如下三个区段组成：SEQ IDNO： 51所示的DNA分子、轻链编码区、SEQ ID NO：52所示的DNA分子。SEQ ID NO：51 中，第1至888位核苷酸组成CMV启动子，第889-945位核苷酸编码信号肽。SEQ ID NO： 52中，第1至3位为终止密码子，第4-151位核苷酸为ployA片段。

(二)重组细胞的构建

将重链表达载体和轻链表达载体共转染293F细胞，得到重组细胞。

(三)抗体的制备

1、取步骤二得到的重组细胞，在含2％胎牛血清的DMEM培养基培养72h，然后4℃、4000rpm离心30min，收集上清液。

2、亲和层析

亲和层析的层析柱规格：长度3cm，内径1cm；

亲和层析的柱填料：protein A beads(Thermo，产品目录号10006D)；

操作步骤：①将300mL步骤1得到的上清液上样于亲和层析柱，4℃孵育16小时；②用60ml结合缓冲液洗涤柱子；③用30mL洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集过柱后溶液。

结合缓冲液：取甘氨酸112.6g、氯化钠175.2g，溶于水并用水定容至1L，用氢氧化钠调pH至8.0。

洗脱缓冲液：取甘氨酸7.5g，溶于水并用水定容至500ml，用盐酸调pH至3.0。

3、取步骤2得到的过柱后溶液，用超滤浓缩管浓缩并将体系置换为PBS缓冲液(pH7.2、10mM)，得到蛋白浓度为1mg/ml的抗体溶液。

重链编码区为SEQ ID NO：2所示的DNA分子且轻链编码区为SEQ ID NO：4所示的DNA分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为P2A-1A8抗体溶液。

重链编码区为SEQ ID NO：6所示的DNA分子且轻链编码区为SEQ ID NO：8所示的DNA分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为P2A-1A9抗体溶液。

重链编码区为SEQ ID NO：10所示的DNA分子且轻链编码区为SEQ ID NO：12所示的DNA分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为P2A-1A10抗体溶液。

重链编码区为SEQ ID NO：14所示的DNA分子且轻链编码区为SEQ ID NO：16所示的DNA分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为P2A-1B3抗体溶液。

重链编码区为SEQ ID NO：18所示的DNA分子且轻链编码区为SEQ ID NO：20所示的DNA分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为P2B-2F6抗体溶液。

重链编码区为SEQ ID NO：22所示的DNA分子且轻链编码区为SEQ ID NO：24所示的DNA分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为P2B-2G4抗体溶液。

重链编码区为SEQ ID NO：26所示的DNA分子且轻链编码区为SEQ ID NO：28所示的DNA分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为P2B-2G11抗体溶液。

重链编码区为SEQ ID NO：30所示的DNA分子且轻链编码区为SEQ ID NO：32所示的DNA分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为P2C-1A3抗体溶液。

重链编码区为SEQ ID NO：34所示的DNA分子且轻链编码区为SEQ ID NO：36所示的DNA分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为P2C-1C8抗体溶液。

重链编码区为SEQ ID NO：38所示的DNA分子且轻链编码区为SEQ ID NO：40所示的DNA分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为P2C-1C10抗体溶液。

重链编码区为SEQ ID NO：42所示的DNA分子且轻链编码区为SEQ ID NO：44所示的DNA分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为P2C-1D5抗体溶液。

重链编码区为SEQ ID NO：46所示的DNA分子且轻链编码区为SEQ ID NO：48所示的DNA分子时，进行上述步骤，得到的抗体溶液为P2C-1F11抗体溶液。

实施例2、抗体与病毒S蛋白的RBD区域的结合活性

图1为CoV-S-RBD、SARS-S-RBD和MERS-S-RBD的序列比较，序列差异较大。

一、制备SARS-CoV-2的S蛋白的RBD区域

SARS-CoV-2的S蛋白的RBD区域(简称CoV-S-RBD)，如SEQ ID NO：55中第39 至261位氨基酸残基所示。SARS-CoV-2的S蛋白的RBD区域的预期分子量为25kDa。

1、构建重组质粒

SEQ ID NO：56所示的双链DNA分子插入质粒pFastBac-dual的BamHI和HindIII 酶切位点之间，得到重组质粒pFastBac-dual-CoV-S-RBD。

SEQ ID NO：56所示的双链DNA分子编码SEQ ID NO：55所示的蛋白质。SEQ ID NO：55中，第1至38位氨基酸残基组成信号肽，第262至267位氨基酸残基组成His₆标签。信号肽用于引导蛋白分泌到细胞外，His₆标签用于蛋白纯合，该两个区段都不具有抗体结合功能。

2、制备CoV-S-RBD

(1)将步骤1得到的重组质粒pFastBac-dual-CoV-S-RBD导入DH10Bac感受态细胞，得到杆状病毒穿梭载体，杆状病毒穿梭载体转染sf9昆虫细胞，然后收集细胞培养上清并感染Hi5细胞，收集细胞培养上清。

(2)亲和层析

亲和层析的层析柱规格：长度3cm，内径1cm；

亲和层析的柱填料：镍柱beads(购自Qiagen公司，产品目录号为30230)；

操作步骤：①将300mL步骤(1)得到的细胞培养上清上样于亲和层析柱，4℃孵育3小时；②用100mL含20mM咪唑的上样缓冲液洗涤柱子；③用30mL含500mM咪唑的洗脱缓冲液洗脱目的蛋白，收集过柱后溶液。上样缓冲液即HEPEs buffer。

(3)取步骤(2)得到的过柱后溶液，用30kD浓缩管(购自Merck公司，产品目录号为UFC800396)进行浓缩，得到体积为1ml的浓缩液。

(4)凝胶过滤层析

凝胶过滤层析的层析柱规格：长度24cm，内径2cm；

凝胶过滤层析的柱填料：superdex200 increase 10/300GL(购自GEHealthcare公司，产品目录号为28-9909-44)；

操作步骤：上样0.5ml步骤(3)得到的浓缩液，用流速为0.5ml/min的PBS缓冲液(pH7.2、10mM)洗脱，收集每个洗脱峰对应的过柱后溶液并进行电泳检测，获得具有预期分子量大小的蛋白质的过柱后溶液，即为CoV-S-RBD溶液。

二、制备SARS病毒的S蛋白的RBD区域

SARS病毒的S蛋白的RBD区域(简称SARS-S-RBD)，如SEQ ID NO：57中第39 至260位氨基酸残基所示。SARS病毒的S蛋白的RBD区域的预期分子量为25kDa。

SEQ ID NO：58所示的双链DNA分子编码SEQ ID NO：57所示的蛋白质。SEQ ID NO：57中，第1至38位氨基酸残基组成信号肽，第261至266位氨基酸残基组成His₆标签。信号肽用于引导蛋白分泌到细胞外，His₆标签用于蛋白纯合，该两个区段都不具有抗体结合功能。

用SEQ ID NO：58所示的双链DNA分子代替SEQ ID NO：56所示的双链DNA分子。

操作方法同步骤一，制备得到SARS-S-RBD溶液。

三、制备MERS病毒的S蛋白的RBD区域

MERS病毒的S蛋白的RBD区域(简称MERS-S-RBD)，如SEQ ID NO：59中第39 至246位氨基酸残基所示。MERS病毒的S蛋白的RBD区域的预期分子量为24kDa。

SEQ ID NO：60所示的双链DNA分子编码SEQ ID NO：59所示的蛋白质。SEQ ID NO：59中，第1至38位氨基酸残基组成信号肽，第247至252位氨基酸残基组成His₆标签。信号肽用于引导蛋白分泌到细胞外，His₆标签用于蛋白纯合，该两个区段都不具有抗体结合功能。

用SEQ ID NO：60所示的双链DNA分子代替SEQ ID NO：56所示的双链DNA分子。

操作方法同步骤一，制备得到MERS-S-RBD溶液。

四、抗体与CoV-S-RBD的结合活性

供试抗体分别为：实施例1制备的P2A-1A8抗体、P2A-1A9抗体、P2A-1A10抗体、P2A-1B3抗体、P2B-2F6抗体、P2B-2G4抗体、P2B-2G11抗体、P2C-1A3抗体、P2C-1C8 抗体、P2C-1C10抗体、P2C-1D5抗体、P2C-1F11抗体，VRC01抗体。

供试抗原为：步骤一制备的CoV-S-RBD。

采用ELISA试验检测供试抗体与供试抗原的结合活性。供试抗原作为包被抗原(100μl/孔，其中抗原含量为100ng)。供试抗体用PBS缓冲液调整浓度，然后进行3 倍梯度稀释后作为一抗。HRP标记的抗人IgG抗体(1:5000稀释)作为二抗。采用TMB 显色方法。吸光度计算方法：用450nm吸收光减去背景630nm的吸收光。

结果见图2。实施例1制备的12个抗体均可以与CoV-S-RBD特异性结合。

五、抗体与SARS-S-RBD的结合活性

供试抗体分别为：实施例1制备的P2A-1A8抗体、P2A-1A9抗体、P2A-1A10抗体、P2A-1B3抗体、P2B-2F6抗体、P2B-2G4抗体、P2B-2G11抗体、P2C-1A3抗体、P2C-1C8 抗体、P2C-1C10抗体、P2C-1D5抗体、P2C-1F11抗体，VRC01抗体，S230抗体(现有技术中的SARS病毒抗体)。

供试抗原为：步骤二制备的SARS-S-RBD。

结果见图3。S230抗体与SARS-S-RBD特异性结合。实施例1制备的12个抗体均不与SARS-S-RBD结合。

六、抗体与MERS-S-RBD的结合活性

供试抗体分别为：实施例1制备的P2A-1A8抗体、P2A-1A9抗体、P2A-1A10抗体、P2A-1B3抗体、P2B-2F6抗体、P2B-2G4抗体、P2B-2G11抗体、P2C-1A3抗体、P2C-1C8 抗体、P2C-1C10抗体、P2C-1D5抗体、P2C-1F11抗体，VRC01抗体，MAb-GD33抗体(现有技术中的MERS病毒抗体)。

供试抗原为：步骤三制备的MERS-S-RBD。

结果见图4。MAb-GD33抗体与MERS-S-RBD特异性结合。实施例1制备的12个抗体均不与MERS-S-RBD结合。

实施例3、中和试验

一、SARS-CoV-2假病毒的制备

1、将人工合成的SEQ ID NO：54所示的双链DNA分子插入质粒pcDNA3.1(+)的BamHI和NotI酶切位点之间，得到重组质粒pcDNA3.1/SARS-CoV-2。SEQ ID NO：54 所示的双链DNA分子编码SEQ ID NO：53所示的SARS-CoV-2的S蛋白。

2、将重组质粒pcDNA3.1/SARS-CoV-2和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染293T细胞，得到重组细胞。

质粒pNL4-3R-E-luciferase中含有HIV-1病毒基因组的全部基因(与野生HIV-1病毒基因组的差异仅在于envelope基因发生了移码)。重组质粒pcDNA3.1/SARS-CoV-2 和质粒pNL4-3R-E-luciferase共转染宿主细胞，可以表达SARS-CoV-2假病毒。 SARS-CoV-2假病毒只有病毒颗粒表面的膜蛋白是SARS-CoV-2的S蛋白，其他均为 HIV-1病毒的成分，只能在被感染的细胞中复制基因组并表达荧光素酶报告基因，不能再产生有感染性的病毒颗粒。

3、将步骤2得到的重组细胞，在含10％胎牛血清的DMEM培养基培养60h。

4、完成步骤3后，取培养上清，即为SARS-CoV-2假病毒的病毒液(简称SARS-CoV-2病毒液)。

5、利用p24定量检测的ELISA试剂盒检测SARS-CoV-2病毒液中的病毒滴度。

二、抗体的中和活性检测

供试抗体溶液分别为：实施例1制备的P2A-1A8抗体溶液、P2A-1A9抗体溶液、 P2A-1A10抗体溶液、P2A-1B3抗体溶液、P2B-2F6抗体溶液、P2B-2G4抗体溶液、P2B-2G11 抗体溶液、P2C-1A3抗体溶液、P2C-1C8抗体溶液、P2C-1C10抗体溶液、P2C-1D5抗体溶液、P2C-1F11抗体溶液，VRC01抗体溶液。

1、取供试抗体溶液，用PBS缓冲液(pH7.2、10mM)进行倍比稀释，得到抗体稀释液。

2、取96孔细胞培养板，每孔加入100微升抗体稀释液和50微升SARS-CoV-2病毒液(50微升SARS-CoV-2病毒液中的病毒浓度为1×10⁴TCID₅₀/ml)，使得混合体系中的抗体浓度为xμg/ml(以蛋白浓度计)，37℃静置孵育1小时。用等体积PBS缓冲液(pH7.2、10mM)代替抗体稀释液，作为病毒对照。用等体积含10％胎牛血清的DMEM 培养基代替SARS-CoV-2病毒液，作为细胞对照。

3、完成步骤2后，取所述细胞培养板，每孔接种100微升Huh7细胞悬液(用于制备细胞悬液的溶剂为含10％胎牛血清的DMEM培养基，细胞悬液中的Huh7细胞浓度为2×10⁵个细胞/ml)，37℃静置孵育64小时。

4、完成步骤3后，取所述细胞培养板，吸弃上清，每孔加入150微升裂解液(微格拉斯生物技术，货号T003，按说明书操作)，37℃静置孵育5分钟。

5、完成步骤4后，取所述细胞培养板，检测荧光素酶活性。

每个处理设置多个复孔。

中和活性(％)＝[1-(试验组的荧光强度-细胞对照的荧光强度)/(病毒对照的荧光强度-细胞对照的荧光强度)]×100％。

利用Prism 5软件计算中和活性为50％时的抗体浓度，即抗体的IC₅₀值。

中和活性的结果见表2，图5、图6、图7和图8。

表2

注：IC₅₀值＜50μg/ml才能判断为特异性中和抗体。

SEQUENCE LISTING

<110> 深圳市第三人民医院

清华大学

<120> 新型冠状病毒抗体及其应用

<130> CGGNQAYX206020

<160> 132

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 479

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 1

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Asp Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ala Phe

35 40 45

Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Gly Ser Thr Trp Asn Ser Gly Thr Ile Ala Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Lys

85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Leu

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Leu Gly Gly Tyr Ser Asp Tyr Asp Tyr Pro Arg

115 120 125

Pro Gly Asp His Tyr Tyr Gly Leu Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr

130 135 140

Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu

145 150 155 160

Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys

165 170 175

Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser

180 185 190

Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser

195 200 205

Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser

210 215 220

Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn

225 230 235 240

Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His

245 250 255

Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val

260 265 270

Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr

275 280 285

Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu

290 295 300

Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys

305 310 315 320

Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser

325 330 335

Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys

340 345 350

Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile

355 360 365

Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro

370 375 380

Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu

385 390 395 400

Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn

405 410 415

Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser

420 425 430

Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg

435 440 445

Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu

450 455 460

His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 2

<211> 1380

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 2

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggagac ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgcgcag cctctggatt cgcctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt agtacttgga atagtgggac catagcctat 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagaa gtccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag aactgaggac acggccttat attactgtgc aaagttgggg 300

ggctacagtg actacgatta cccgaggccg ggagaccact attacggttt ggacgtctgg 360

ggccaaggga ccacggtcac cgtctcctca gcgtcgacca agggcccatc ggtcttcccc 420

ctggcaccct cctccaagag cacctctggg ggcacagcgg ccctgggctg cctggtcaag 480

gactacttcc ccgaacccgt gacggtgtcg tggaactcag gcgccctgac cagcggcgtg 540

cacaccttcc cggctgtcct acagtcctca ggactctact ccctcagcag cgtggtgacc 600

gtgccctcca gcagcttggg cacccagacc tacatctgca acgtgaatca caagcccagc 660

aacaccaagg tggacaagaa agttgagccc aaatcttgtg acaaaactca cacatgccca 720

ccgtgcccag cacctgaact cctgggggga ccgtcagtct tcctcttccc cccaaaaccc 780

aaggacaccc tcatgatctc ccggacccct gaggtcacat gcgtggtggt ggacgtgagc 840

cacgaagacc ctgaggtcaa gttcaactgg tacgtggacg gcgtggaggt gcataatgcc 900

aagacaaagc cgcgggagga gcagtacaac agcacgtacc gtgtggtcag cgtcctcacc 960

gtcctgcacc aggactggct gaatggcaag gagtacaagt gcaaggtctc caacaaagcc 1020

ctcccagccc ccatcgagaa aaccatctcc aaagccaaag ggcagccccg agaaccacag 1080

gtgtacaccc tgcccccatc ccgggatgag ctgaccaaga accaggtcag cctgacctgc 1140

ctggtcaaag gcttctatcc cagcgacatc gccgtggagt gggagagcaa tgggcagccg 1200

gagaacaact acaagaccac gcctcccgtg ctggactccg acggctcctt cttcctctac 1260

agcaagctca ccgtggacaa gagcaggtgg cagcagggga acgtcttctc atgctccgtg 1320

atgcatgagg ctctgcacaa ccactacacg cagaagagcc tctccctgtc tccgggtaaa 1380

<210> 3

<211> 235

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 3

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ser Trp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Ala Ser Val Ser Gly Ser

20 25 30

Pro Gly Gln Ser Ile Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val

35 40 45

Gly Ser Tyr Asn Leu Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Val

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Asp Val Asn Lys Arg Pro Ser Gly Ile Ser

65 70 75 80

Asn Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Arg Ser Tyr

100 105 110

Thr Asp Ser Asn Thr Tyr Val Phe Gly Thr Gly Thr Lys Val Thr Val

115 120 125

Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser

130 135 140

Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser

145 150 155 160

Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser

165 170 175

Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn

180 185 190

Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp

195 200 205

Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr

210 215 220

Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

225 230 235

<210> 4

<211> 648

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 4

cagtctgccc tgactcagcc tgcctccgtg tctgggtctc ctggacagtc gatcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggg agttataacc ttgtctcctg gtaccaacag 120

cacccaggca aagtccccaa actcttgatt tatgatgtca ataagcggcc ctcagggatt 180

tccaatcgct tctctggctc caagtctggc aacacggcct ccctgaccat ctctgggctc 240

caggctgagg acgaggctga ttattactgc agatcatata cagacagcaa cacttatgtc 300

ttcggaactg ggaccaaggt caccgtccta ggtcagccca aggctgcccc ctcggtcact 360

ctgttcccac cctcgagtga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420

agtgacttct acccgggagc cgtgacagtg gcctggaagg cagatagcag ccccgtcaag 480

gcgggagtgg agaccaccac accctccaaa caaagcaaca acaagtacgc ggccagcagc 540

tacctgagcc tgacgcctga gcagtggaag tcccacagaa gctacagctg ccaggtcacg 600

catgaaggga gcaccgtgga gaagacagtg gcccctacag aatgttca 648

<210> 5

<211> 473

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 5

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Arg Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe

35 40 45

Asp Asp Tyr Ala Met His Trp Val Arg Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ser Gly Ile Ser Trp Asn Gly Gly Ile Ile Gly Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr

85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Leu

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Lys Val Ala Gly Arg Gly Asp Tyr Asp Tyr Tyr Tyr

115 120 125

Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Ala

130 135 140

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

145 150 155 160

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

165 170 175

Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly

180 185 190

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

195 200 205

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

210 215 220

Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys

225 230 235 240

Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

245 250 255

Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys

260 265 270

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

275 280 285

Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr

290 295 300

Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu

305 310 315 320

Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

325 330 335

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

340 345 350

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

355 360 365

Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu

370 375 380

Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro

385 390 395 400

Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn

405 410 415

Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu

420 425 430

Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val

435 440 445

Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln

450 455 460

Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

<210> 6

<211> 1362

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 6

gaagtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggcaggtc cctgagactc 60

tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagtt 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atggtggtat cataggctac 180

gcggactctg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca acgccaagac ttccctgtat 240

ctgcaaatga acagtctgag agctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagtcgcg 300

ggaagggggg attacgacta ttactatggt atggacgtct ggggccaagg gaccacggtc 360

accgtctcct cagcgtcgac caagggccca tcggtcttcc ccctggcacc ctcctccaag 420

agcacctctg ggggcacagc ggccctgggc tgcctggtca aggactactt ccccgaaccc 480

gtgacggtgt cgtggaactc aggcgccctg accagcggcg tgcacacctt cccggctgtc 540

ctacagtcct caggactcta ctccctcagc agcgtggtga ccgtgccctc cagcagcttg 600

ggcacccaga cctacatctg caacgtgaat cacaagccca gcaacaccaa ggtggacaag 660

aaagttgagc ccaaatcttg tgacaaaact cacacatgcc caccgtgccc agcacctgaa 720

ctcctggggg gaccgtcagt cttcctcttc cccccaaaac ccaaggacac cctcatgatc 780

tcccggaccc ctgaggtcac atgcgtggtg gtggacgtga gccacgaaga ccctgaggtc 840

aagttcaact ggtacgtgga cggcgtggag gtgcataatg ccaagacaaa gccgcgggag 900

gagcagtaca acagcacgta ccgtgtggtc agcgtcctca ccgtcctgca ccaggactgg 960

ctgaatggca aggagtacaa gtgcaaggtc tccaacaaag ccctcccagc ccccatcgag 1020

aaaaccatct ccaaagccaa agggcagccc cgagaaccac aggtgtacac cctgccccca 1080

tcccgggatg agctgaccaa gaaccaggtc agcctgacct gcctggtcaa aggcttctat 1140

cccagcgaca tcgccgtgga gtgggagagc aatgggcagc cggagaacaa ctacaagacc 1200

acgcctcccg tgctggactc cgacggctcc ttcttcctct acagcaagct caccgtggac 1260

aagagcaggt ggcagcaggg gaacgtcttc tcatgctccg tgatgcatga ggctctgcac 1320

aaccactaca cgcagaagag cctctccctg tctccgggta aa 1362

<210> 7

<211> 236

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 7

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ser Trp Ala Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Val Ser Gly Ala

20 25 30

Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile

35 40 45

Gly Ala Gly Tyr Asp Val His Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Gly Asn Asn Asn Arg Pro Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile

85 90 95

Thr Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gln Ser Tyr

100 105 110

Asp Ser Ser Leu Ser Gly Ser Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

115 120 125

Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile

145 150 155 160

Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser

165 170 175

Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser

180 185 190

Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln

195 200 205

Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser

210 215 220

Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

225 230 235

<210> 8

<211> 651

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 8

cagtctgtgc tgacgcagcc gccctcagtg tctggggccc cagggcagag ggtcaccatc 60

tcctgcactg ggagcagctc caacatcggg gcaggttatg atgtacactg gtaccagcaa 120

cttccaggaa cagcccccaa actcctcatc tatggtaaca acaatcgccc ctcaggggtc 180

cctgaccgat tctctggctc caagtctggc acctcagcct ccctggccat cactgggctc 240

caggctgagg atgaggctga ttattactgc cagtcctatg acagcagcct gagtggttcg 300

gtattcggcg gagggaccaa gctgaccgtc ctaggtcagc ccaaggctgc cccctcggtc 360

actctgttcc caccctcgag tgaggagctt caagccaaca aggccacact ggtgtgtctc 420

ataagtgact tctacccggg agccgtgaca gtggcctgga aggcagatag cagccccgtc 480

aaggcgggag tggagaccac cacaccctcc aaacaaagca acaacaagta cgcggccagc 540

agctacctga gcctgacgcc tgagcagtgg aagtcccaca gaagctacag ctgccaggtc 600

acgcatgaag ggagcaccgt ggagaagaca gtggccccta cagaatgttc a 651

<210> 9

<211> 475

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 9

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys

20 25 30

Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe

35 40 45

Thr Gly Tyr Tyr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Met Gly Arg Ile Asn Pro Asn Ser Gly Gly Thr Asn Tyr Ala

65 70 75 80

Gln Lys Phe Gln Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser

85 90 95

Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Val Pro Tyr Cys Ser Ser Thr Ser Cys His Arg

115 120 125

Asp Trp Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly Thr Leu Val Thr Val Ser

130 135 140

Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser

145 150 155 160

Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp

165 170 175

Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr

180 185 190

Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr

195 200 205

Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln

210 215 220

Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp

225 230 235 240

Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro

245 250 255

Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro

260 265 270

Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr

275 280 285

Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn

290 295 300

Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg

305 310 315 320

Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val

325 330 335

Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser

340 345 350

Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys

355 360 365

Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp

370 375 380

Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe

385 390 395 400

Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu

405 410 415

Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe

420 425 430

Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly

435 440 445

Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr

450 455 460

Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470 475

<210> 10

<211> 1368

<212> DNA

<213> Artificial sequence

<400> 10

caggtgcagc tggtgcagtc tggggctgag gtgaagaagc ctggggcctc agtgaaggtc 60

tcctgcaagg cttctggata caccttcacc ggctactata tgcactgggt gcgacaggcc 120

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tccaagagca cctctggggg cacagcggcc ctgggctgcc tggtcaagga ctacttcccc 480

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agcttgggca cccagaccta catctgcaac gtgaatcaca agcccagcaa caccaaggtg 660

gacaagaaag ttgagcccaa atcttgtgac aaaactcaca catgcccacc gtgcccagca 720

cctgaactcc tggggggacc gtcagtcttc ctcttccccc caaaacccaa ggacaccctc 780

atgatctccc ggacccctga ggtcacatgc gtggtggtgg acgtgagcca cgaagaccct 840

gaggtcaagt tcaactggta cgtggacggc gtggaggtgc ataatgccaa gacaaagccg 900

cgggaggagc agtacaacag cacgtaccgt gtggtcagcg tcctcaccgt cctgcaccag 960

gactggctga atggcaagga gtacaagtgc aaggtctcca acaaagccct cccagccccc 1020

atcgagaaaa ccatctccaa agccaaaggg cagccccgag aaccacaggt gtacaccctg 1080

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ttctatccca gcgacatcgc cgtggagtgg gagagcaatg ggcagccgga gaacaactac 1200

aagaccacgc ctcccgtgct ggactccgac ggctccttct tcctctacag caagctcacc 1260

gtggacaaga gcaggtggca gcaggggaac gtcttctcat gctccgtgat gcatgaggct 1320

ctgcacaacc actacacgca gaagagcctc tccctgtctc cgggtaaa 1368

<210> 11

<211> 239

<212> PRT

<213> Artificial sequence

<400> 11

Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ser Trp Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val

20 25 30

Thr Pro Gly Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu

35 40 45

Leu Asp Ser Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys

50 55 60

Pro Gly Gln Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala

65 70 75 80

Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe

85 90 95

Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr

100 105 110

Cys Met Gln Arg Ile Glu Phe Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys

115 120 125

Val Glu Ile Lys Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro

130 135 140

Pro Ser Asp Glu Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu

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Leu Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp

165 170 175

Asn Ala Leu Gln Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp

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Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys

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Ala Asp Tyr Glu Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln

210 215 220

Gly Leu Ser Ser Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

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<213> Artificial sequence

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gatattgtga tgacccagac tccactctcc ctgcccgtca cccctggaga gccggcctcc 60

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<213> Artificial sequence

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Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Val His Ser Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln

20 25 30

Pro Gly Gly Ser Leu Arg Leu Ser Cys Val Ala Ser Gly Phe Ser Phe

35 40 45

Asn Arg Tyr Ser Met Asn Trp Leu Arg Gln Thr Pro Arg Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Leu Ser Tyr Ile Ser Ala Ser Gly Asn Thr Ile Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Arg Gly Arg Phe Thr Thr Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Asp Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Phe Cys Ala Arg Pro Ala Met Val Arg Glu Gly Thr Tyr Asn Trp

115 120 125

Phe Asp Pro Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser

130 135 140

Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr

145 150 155 160

Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro

165 170 175

Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val

180 185 190

His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser

195 200 205

Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile

210 215 220

Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val

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Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro Ala

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Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro

260 265 270

Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val

275 280 285

Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val

290 295 300

Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln

305 310 315 320

Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln

325 330 335

Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Ala

340 345 350

Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro

355 360 365

Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr

370 375 380

Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser

385 390 395 400

Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr

405 410 415

Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr

420 425 430

Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe

435 440 445

Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys

450 455 460

Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys

465 470

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<212> DNA

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gaggtgcagc tggtggagtc tgggggaggc ttggtacagc ctggggggtc cctcagactc 60

tcctgtgtcg cctctggatt ctccttcaat cgatatagta tgaattggct ccgccagact 120

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ctgcaaatga acagcctgcg agacgacgac acggctgtct atttctgtgc gcgacccgct 300

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Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ser Trp Ala Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu

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Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val

35 40 45

Ser Asn Asp Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro

50 55 60

Arg Leu Leu Ile Tyr Tyr Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp

65 70 75 80

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

85 90 95

Arg Leu Glu Pro Gly Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly

100 105 110

Asp Ser Pro Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys

115 120 125

Arg Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu

130 135 140

Gln Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe

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Tyr Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln

165 170 175

Ser Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser

180 185 190

Thr Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu

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Lys His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser

210 215 220

Pro Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys

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gaaattgtgt tgacgcagtc tccaggcacc ctgtctttgt ctccagggga aagagccacc 60

ctctcctgca gggccagtca gagtgttagc aacgactact tagcctggta ccagcagaaa 120

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Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

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Val His Ser Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys

20 25 30

Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Tyr Ser Ile

35 40 45

Ser Ser Gly Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly

50 55 60

Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr His Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn

65 70 75 80

Pro Ser Leu Lys Thr Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn

85 90 95

Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Ala Val Val Gly Ile Val Val Val Pro Ala Ala

115 120 125

Gly Arg Arg Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val

130 135 140

Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser

145 150 155 160

Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys

165 170 175

Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu

180 185 190

Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu

195 200 205

Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr

210 215 220

Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val

225 230 235 240

Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro

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Pro Cys Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe

260 265 270

Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val

275 280 285

Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe

290 295 300

Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro

305 310 315 320

Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr

325 330 335

Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val

340 345 350

Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala

355 360 365

Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg

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Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly

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Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro

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Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser

420 425 430

Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln

435 440 445

Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His

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<211> 1371

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caggtgcagc tgcaggagtc gggcccagga ctggtgaagc cttcggagac cctgtccctc 60

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cctgaggtca agttcaactg gtacgtggac ggcgtggagg tgcataatgc caagacaaag 900

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Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

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Ser Trp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Ser

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Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val

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Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala

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Pro Lys Leu Met Ile Tyr Glu Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro

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Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Val

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Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ser Ser Tyr

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Ala Gly Ser Asn Asn Leu Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val

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Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser

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Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser

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Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser

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cagtctgccc tgactcagcc tccctccgcg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgacgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120

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ctgttcccac cctcgagtga ggagcttcaa gccaacaagg ccacactggt gtgtctcata 420

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35 40 45

Ser Ser Tyr Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu

50 55 60

Glu Trp Val Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala

65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn

85 90 95

Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val

100 105 110

Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Ala Met Val Trp Leu Asp Tyr Trp Gly

115 120 125

Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser

130 135 140

Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala

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Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val

165 170 175

Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala

180 185 190

Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu Ser Ser Val Val Thr Val

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Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr Ile Cys Asn Val Asn His

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Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys

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Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met

260 265 270

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275 280 285

Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val

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Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly

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Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val

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Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Asp Glu Leu Thr Lys Asn Gln Val Ser

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Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu

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Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro

405 410 415

Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val

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Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met

435 440 445

His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser

450 455 460

Pro Gly Lys

465

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gcagactccg tgaagggccg attcaccatc tccagagaca attccaagaa cacgctgtat 240

ctgcaaatga acagcctgag agccgaggac acggctgtgt attactgtgc gagaggggca 300

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gacggcgtgg aggtgcataa tgccaagaca aagccgcggg aggagcagta caacagcacg 900

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aagtgcaagg tctccaacaa agccctccca gcccccatcg agaaaaccat ctccaaagcc 1020

aaagggcagc cccgagaacc acaggtgtac accctgcccc catcccggga tgagctgacc 1080

aagaaccagg tcagcctgac ctgcctggtc aaaggcttct atcccagcga catcgccgtg 1140

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Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

Ser Trp Ala Gln Ser Ala Leu Thr Gln Pro Arg Ser Val Ser Gly Ser

20 25 30

Pro Gly Gln Ser Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Thr Ser Ser Asp Val

35 40 45

Gly Gly Tyr Asn Tyr Val Ser Trp Tyr Gln Gln His Pro Gly Lys Ala

50 55 60

Pro Lys Leu Met Ile Tyr Asp Val Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro

65 70 75 80

Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Asn Thr Ala Ser Leu Thr Ile

85 90 95

Ser Gly Leu Gln Ala Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Cys Ser Tyr

100 105 110

Ala Gly Ser Tyr Thr Phe Val Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr

115 120 125

Val Leu Gly Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro

130 135 140

Ser Ser Glu Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile

145 150 155 160

Ser Asp Phe Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser

165 170 175

Ser Pro Val Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser

180 185 190

Asn Asn Lys Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln

195 200 205

Trp Lys Ser His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser

210 215 220

Thr Val Glu Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser

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<212> DNA

<213> Artificial sequence

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cagtctgccc tgactcagcc tcgctcagtg tccgggtctc ctggacagtc agtcaccatc 60

tcctgcactg gaaccagcag tgatgttggt ggttataact atgtctcctg gtaccaacag 120

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<212> PRT

<213> Artificial sequence

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Met Gly Trp Ser Cys Ile Ile Leu Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly

1 5 10 15

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50 55 60

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65 70 75 80

Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Thr

85 90 95

Ser Leu Tyr Leu Gln Met Asn Ser Leu Lys Pro Glu Asp Thr Ala Leu

100 105 110

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130 135 140

Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys Ser

145 150 155 160

Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr Phe

165 170 175

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180 185 190

Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser Leu

195 200 205

Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr Tyr

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Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys Pro

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260 265 270

Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val

275 280 285

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Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His

325 330 335

Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys

340 345 350

Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln

355 360 365

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tcctgtgcag cctctggatt cacctttgat gattatgcca tgcactgggt ccggcaagct 120

ccagggaagg gcctggagtg ggtctcaggt attagttgga atggtggtat cataggctat 180

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ctgcaaatga acagtctgaa acctgaggac acggccttgt attactgtgc aaaagtcgcg 300

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