一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法
阅读说明：本技术 一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法 (Heterotrophic-dilution-photoinduction culture method for chlorella pyrenoidosa in desert ) 是由 梁钧 于 2021-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法。本发明将异养方式与自养方式的结合方式,大大提高沙漠蛋白核小球藻的生物量和蛋白质含量,达到高效生产大量高蛋白质含量的沙漠蛋白核小球藻的目的,不仅可在短时间内获得较高浓度的藻细胞生物量,还可诱导蛋白核小球藻内蛋白质、叶绿素等物质的积累,改善蛋白核小球藻品质,提高蛋白核小球藻的综合利用价值。此外,该方法具有操作简便、实用性强、易实现连续生产等特点,非常有利于大规模的推广和应用,以快速高效地获得大量的高含量蛋白质的沙漠蛋白核小球藻藻粉,为高品质沙漠蛋白核小球藻藻粉的生产提供技术支撑,满足工业生产的需求。(The invention relates to a heterotrophic-dilution-photoinduction culture method of chlorella pyrenoidosa in desert. The invention greatly improves the biomass and the protein content of the desert chlorella pyrenoidosa by combining the heterotrophic mode and the autotrophic mode, achieves the aim of efficiently producing a large amount of the desert chlorella pyrenoidosa with high protein content, can obtain the biomass of algae cells with higher concentration in a short time, can induce the accumulation of substances such as protein, chlorophyll and the like in the chlorella pyrenoidosa, improves the quality of the chlorella pyrenoidosa and improves the comprehensive utilization value of the chlorella pyrenoidosa. In addition, the method has the characteristics of simple and convenient operation, strong practicability, easy realization of continuous production and the like, is very favorable for large-scale popularization and application, so that a large amount of high-protein content desert chlorella pyrenoidosa algae powder can be quickly and efficiently obtained, technical support is provided for the production of high-quality desert chlorella pyrenoidosa algae powder, and the requirement of industrial production is met.)
技术领域
本发明涉及微藻养殖
技术领域
，具体为一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法。背景技术
小球藻(chlorella sp.)是一种普生性单细胞绿藻，属于绿藻门，绿藻纲，卵囊藻科，小球藻属。我国常见的小球藻种类有蛋白核小球藻、椭圆小球藻、普通小球藻等。小球藻富含蛋白质、不饱和脂肪酸(亚油酸、亚麻酸、DHA、EPA等)、类胡萝卜素、虾青素和多种维生素，广泛应用于功能食品、饲料、化妆品和医药等领域。
现有的蛋白核小球藻藻粉生产方法主要包括开放式自养培养、密闭式异养培养、混合培养。开放式自养培养，易污染，光照、温度等培养条件易受天气影响，藻细胞浓度低，采收成本较高，密闭式异养培养一般利用葡萄糖作为碳源，采用高耗能的硝态氮如硝酸钠作为氮源，虽能够获得较为理想的藻细胞浓度，但由于培养过程一直处于黑暗条件下，后期收获的藻粉蛋白质和叶绿素等含量都较低，使得藻细胞的品质和多种生物活性功能明显不足，且培养过程中多用盐酸调节pH值，容易对发酵设备造成一定程度的损害。
塔克拉玛干沙漠绿藻作为极端环境微藻，在几十万年的进化中，其生物学特性、生理生化组分等与绿藻存在一定差异。培养条件和培养技术较为缺乏，为了解决，沙漠蛋白核小球藻自养培养生产周期长，生物量低，异养培养藻粉蛋白含量低等问题，本发明提供了一种适合沙漠蛋白核小球藻异养—稀释—光诱导培养方法，实现在短时间内获得较高品质的沙漠蛋白核小球藻。
发明内容
鉴于现有技术中所存在的问题，本发明公开了一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法，包括步骤如下：
步骤一、藻种活化：从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻，在无菌工作台中挑取单个藻株，划线于固体培养基中，置于光照培养箱中培养，培养温度28℃，光照5000lux培养15天，得到活化藻种；
步骤二、一级种子液制备：从活化藻种中挑取3-5环藻种，接种到装有50mL培养基的100mL三角瓶中，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/mL，得到一级种子液；
步骤三、二级种子液制备：将一级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有200mL培养基的500mL三角瓶中，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养48～72小时，得到二级种子液；
步骤四、三级种子液制备：将二级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有500mL培养基的1000mL三角瓶中，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养48～72小时，得到三级种子液；
步骤五、异养培养：将三级种子液作为发酵培养的种子液，按照15％的接种量接种于发酵罐中培养，发酵罐培养温度为28℃，溶氧为25％，pH为7，发酵罐转速50r/min，培养72小时后，每天取料2000mL，补充新鲜培养液2000mL，保持半连续培养体系的稳定；
步骤六、稀释-光诱导培养：在步骤五的培养过程中，每隔24小时，取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重，初始藻细胞浓度为干重状态2.12-4.24g/L，当连续两天检测生物量无显著差异时，停止培养，藻细胞浓度为干重状态150-200g/L；将发酵罐中培养液稀释，转入60L柱状光生物反应器中连续培养，培养条件为28℃，光照10000lux，空气通气量为1L/min，每天取样检测，连续2天检测中，蛋白质含量无显著差异时，培养结束。
作为本发明的一种优选方案，步骤一至步骤四中使用的培养基均为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基。
作为本发明的一种优选方案，步骤五中使用的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/L的Basal培养基为基础培养基，以葡萄糖为碳源。
作为本发明的一种优选方案，步骤五中利用50％醋酸和2mol/L氢氧化钠调节发酵罐中培养液的pH。
作为本发明的一种优选方案，步骤六中稀释发酵罐中培养液所用培养基为Basal培养基。
作为本发明的一种优选方案，步骤六中结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40％-55％。
本发明的有益效果：本发明提供的沙漠蛋白核小球藻异养—稀释—光诱导的培养方法，异养方式与自养方式的结合方式，大大提高沙漠蛋白核小球藻的生物量和蛋白质含量，达到高效生产大量高蛋白质含量的沙漠蛋白核小球藻的目的，不仅可在短时间内获得较高浓度的藻细胞生物量，还可诱导蛋白核小球藻内蛋白质、叶绿素等物质的积累，改善蛋白核小球藻品质，提高蛋白核小球藻的综合利用价值。此外，该方法具有操作简便、实用性强、易实现连续生产等特点，非常有利于大规模的推广和应用，以快速高效地获得大量的高含量蛋白质的沙漠蛋白核小球藻藻粉，为高品质沙漠蛋白核小球藻藻粉的生产提供技术支撑，满足工业生产的需求。
附图说明
图1为本发明所采用的分离纯化的蛋白核小球藻图片；
图2为异养和异养—光诱导沙漠蛋白核小球藻蛋白质含量图；
图3位不同稀释倍数光诱导沙漠蛋白核小球藻的叶绿素含量图；
图4位不同稀释倍数光诱导沙漠蛋白核小球藻蛋白含量含量图。
具体实施方式
实施例1
本发明的一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法，采用的技术方案是，包括步骤如下：
步骤一、藻种活化：从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻，在无菌工作台中挑取单个藻株，划线于固体培养基中，置于光照培养箱中培养，培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基，培养温度28℃，光照5000lux培养15天，得到活化藻种；
步骤二、一级种子液制备：从活化藻种中挑取3环藻种，接种到装有50mL培养基的100mL三角瓶中，培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/mL，得到一级种子液；
步骤三、二级种子液制备：将一级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有200mL培养基的500mL三角瓶中，培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养48小时，得到二级种子液；
步骤四、三级种子液制备：将二级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有500mL培养基的1000mL三角瓶中，培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养48小时，得到三级种子液；
步骤五、异养培养：将三级种子液作为发酵培养的种子液，按照15％的接种量接种于发酵罐中培养，发酵罐中的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/L的Basal培养基为基础培养基，以葡萄糖为碳源，发酵罐培养温度为28℃，溶氧为25％，pH为7，发酵罐转速50r/min，培养72小时后，每天取料2000mL，补充新鲜培养液2000mL，利用50％醋酸和2mol/L氢氧化钠调节发酵罐中培养液的pH，保持半连续培养体系的稳定；
步骤六、稀释-光诱导培养：在步骤五的培养过程中，每隔24小时，取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重，初始藻细胞浓度为干重状态2.12g/L，当连续两天检测生物量无显著差异时，停止培养，藻细胞浓度为干重状态150g/L；将发酵罐中加入Basal培养基对培养液进行稀释，转入60L柱状光生物反应器中连续培养，培养条件为28℃，光照10000lux，空气通气量为1L/min，每天取样检测，连续2天检测中，蛋白质含量无显著差异时，培养结束；结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40％-55％。
实施例2
本发明的一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法，采用的技术方案是，包括步骤如下：
步骤一、藻种活化：从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻，在无菌工作台中挑取单个藻株，划线于固体培养基中，置于光照培养箱中培养，培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基，培养温度28℃，光照5000lux培养15天，得到活化藻种；
步骤二、一级种子液制备：从活化藻种中挑取5环藻种，接种到装有50mL培养基的100mL三角瓶中，培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/mL，得到一级种子液；
步骤三、二级种子液制备：将一级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有200mL培养基的500mL三角瓶中，培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养60小时，得到二级种子液；
步骤四、三级种子液制备：将二级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有500mL培养基的1000mL三角瓶中，培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养60小时，得到三级种子液；
步骤五、异养培养：将三级种子液作为发酵培养的种子液，按照15％的接种量接种于发酵罐中培养，发酵罐中的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/L的Basal培养基为基础培养基，以葡萄糖为碳源，发酵罐培养温度为28℃，溶氧为25％，pH为7，发酵罐转速50r/min，培养72小时后，每天取料2000mL，补充新鲜培养液2000mL，利用50％醋酸和2mol/L氢氧化钠调节发酵罐中培养液的pH，保持半连续培养体系的稳定；
步骤六、稀释-光诱导培养：在步骤五的培养过程中，每隔24小时，取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重，初始藻细胞浓度为干重状态3.21g/L，当连续两天检测生物量无显著差异时，停止培养，藻细胞浓度为干重状态170g/L；将发酵罐中加入Basal培养基对培养液进行稀释，转入60L柱状光生物反应器中连续培养，培养条件为28℃，光照10000lux，空气通气量为1L/min，每天取样检测，连续2天检测中，蛋白质含量无显著差异时，培养结束；结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40％-55％。
实施例3
本发明的一种沙漠蛋白核小球藻异养-稀释-光诱导培养方法，采用的技术方案是，包括步骤如下：
步骤一、藻种活化：从藻种资源库取出平板划线的蛋白核小球藻，在无菌工作台中挑取单个藻株，划线于固体培养基中，置于光照培养箱中培养，培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基，培养温度28℃，光照5000lux培养15天，得到活化藻种；
步骤二、一级种子液制备：从活化藻种中挑取5环藻种，接种到装有50mL培养基的100mL三角瓶中，培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养至对数生长期108个/mL，得到一级种子液；
步骤三、二级种子液制备：将一级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有200mL培养基的500mL三角瓶中，培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养72小时，得到二级种子液；
步骤四、三级种子液制备：将二级种子液以10％(v/v)接种量接种于装有500mL培养基的1000mL三角瓶中，培养基为含10g/L葡萄糖的Basal固体培养基，在温度28℃、光照5000lux，50r/min的振荡培养箱中培养72小时，得到三级种子液；
步骤五、异养培养：将三级种子液作为发酵培养的种子液，按照15％的接种量接种于发酵罐中培养，发酵罐中的培养基和添加培养基均以葡萄糖浓度为20g/L的Basal培养基为基础培养基，以葡萄糖为碳源，发酵罐培养温度为28℃，溶氧为25％，pH为7，发酵罐转速50r/min，培养72小时后，每天取料2000mL，补充新鲜培养液2000mL，利用50％醋酸和2mol/L氢氧化钠调节发酵罐中培养液的pH，保持半连续培养体系的稳定；
步骤六、稀释-光诱导培养：在步骤五的培养过程中，每隔24小时，取样检测发酵液中蛋白核小球藻的细胞干重，初始藻细胞浓度为干重状态4.24g/L，当连续两天检测生物量无显著差异时，停止培养，藻细胞浓度为干重状态200g/L；将发酵罐中加入Basal培养基对培养液进行稀释，转入60L柱状光生物反应器中连续培养，培养条件为28℃，光照10000lux，空气通气量为1L/min，每天取样检测，连续2天检测中，蛋白质含量无显著差异时，培养结束；结束培养后得到的蛋白核小球藻中蛋白质含量为40％-55％。
Basal固体培养基主要成分及终浓度为：
培养基成分
终浓度mg/L
培养基成分
终浓度mg/L
NaNO<sub>3</sub>
1250
FeSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
49.8
KH<sub>2</sub>PO<sub>4</sub>
1250
ZnSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
88.2
MgSO<sub>4</sub>·7H<sub>2</sub>O
1000
MnCl<sub>2</sub>·4H<sub>2</sub>O
14.2
EDTA
500
Na<sub>2</sub>MoO<sub>4</sub>·2H<sub>2</sub>O
11.92
H<sub>3</sub>BO<sub>4</sub>
114.2
CuSO<sub>4</sub>·5H<sub>2</sub>O
15.7
CaCl<sub>2</sub>·H2O
111
Co(NO<sub>3</sub>)<sub>2</sub>·6H<sub>2</sub>O
4.9
本文中未详细说明的部件为现有技术。
上述虽然对本发明的具体实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施例，在本领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下做出各种变化，而不具备创造性劳动的修改或变形仍在本发明的保护范围以内。
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