通过反应性挤出的连续的、无溶剂的且非酶促的肽合成
阅读说明：本技术 通过反应性挤出的连续的、无溶剂的且非酶促的肽合成 (Continuous, solvent-free and non-enzymatic peptide synthesis by reactive extrusion ) 是由 伊夫·耶博伊 本杰明·盖拉德 尼古拉斯·勒莫伊格尼 弗雷德里克·拉马蒂 让·马丁内斯 托马 于 2019-02-12 设计创作，主要内容包括：本公开涉及一种用于合成式(I)：Ra-POLYPEP-Rc(I)的化合物的连续的、无溶剂的且非酶促的方法,其中,POLYPEP是多氨基酸化合物,Ra和Rc如本公开中所指定,该方法包括以下步骤：a)在没有任何溶剂的情况下,向挤出反应器中加入(1)式(II)：Ra-PEPNt-Rg(II)的化合物,其中,PEPNt是单氨基酸化合物或多氨基酸化合物,Ra和Rg如本公开中所指定,和(2)式(III)：H-PEPCt-Rc(III)的化合物,其中,PEPCt是单氨基酸化合物或多氨基酸化合物,Rc如本公开中所定义,使得式(II)的化合物和式(III)的化合物一起反应以生成式(I)的化合物,和b)从挤出反应器中收集式(I)的化合物。(The present disclosure relates to a process for synthesizing a compound of formula (I): a continuous, solvent-free, and non-enzymatic method of a compound of Ra-polyprope-Rc (i), wherein the polyprope is a polyamino acid compound, Ra and Rc are as specified in the disclosure, comprising the steps of: a) adding to the extrusion reactor, in the absence of any solvent, (1) formula (II): a compound of Ra-PEPNt-Rg (ii), wherein PEPNt is a mono-or polyamino acid compound, Ra and Rg are as specified in the disclosure, and (2) formula (III): a compound of H-PEPCt-Rc (III), wherein PEPCt is a mono-or polyamino acid compound, Rc is as defined in the disclosure, such that the compound of formula (II) and the compound of formula (III) are reacted together to produce the compound of formula (I), and b) collecting the compound of formula (I) from the extrusion reactor.)
技术领域
本发明涉及肽合成的领域。
背景技术
通常，肽在包括食品行业、诊断行业、化妆品行业和治疗行业的各种行业领域中具有高的有用性。治疗性肽表现出广泛的有利特征，使其成为最有前途的活性药物成分之一(K.Fosgerau,T.Hoffmann,Drug Discov.Today 2015,20,122；J.L.Lau,M.K.Dunn,Biorg.Med.Chem.2017,DOI:10.1016/j.bmc.2017.06.052.)。实际上，它们在很低的剂量下具有生物活性，具有高选择性、良好的耐受性和可生物降解为无毒氨基酸。然而，肽的工业生产在溶液中进行，或通过固相肽合成(SPPS)进行，并且受到合成和纯化步骤中所需的大量有毒有机溶剂的困扰(Bray,Nature Rev.Drug Discov.2003,2,587；A.M.Thayer,Chem.Eng.News 2011,89,21；Mergler等人,Chimia 2013,67,874；Werbitzky等人,RSCDrug Discovery Ser.2015,42,290；Patel,Chem.Eng.News 2017,95,27)。尽管存在高度关注的环境问题，但仍经常使用极性非质子溶剂，例如DMF、DCM、THF和1,4-二噁烷(根据法规(EC)第1272/2008号，DMF被列为具有生殖毒性，而DCM、THF和1,4-二噁烷被列为是有毒的和/或致癌的(类别2))。在REACH实施的压力下，制药行业需要这些溶剂的替代品(Patel,Chem.Eng.News 2017,95,27；D.J.C.Constable,P.J.Dunn,J.D.Hayler,G.R.Humphrey,J.J.L.Leazer,R.J.Linderman,K.Lorenz,J.Manley,B.A.Pearlman,A.Wells,A.Zaks,T.Y.Zhang,Green Chem.2007,9,411)。常规的不连续的间歇生产模式以及与肽的通常低溶解度有关的限制也阻碍了工业肽生产的发展。在实践中，只要通过施加机械力将反应物研磨并混合在一起，就不强制使用溶剂来进行肽合成(James等人,Chem.Soc.Rev.2012,41,413；Métro等人,在Ball Milling Towards Green Synthesis:Applications,Projects,Challenges(编辑：A.Stolle,B.Ranu)中,The Royal Society of Chemistry,2015,第114页)。实际上，Lamaty的小组在2009年描述了通过在球磨机中将氨基甲酸乙酯保护的α-氨基酸N-羧基酸酐(UNCA)、α-氨基酯盐和NaHCO3一起研磨，无溶剂合成各种二肽(包括甜味剂阿斯巴甜)(Declerck等人,Angew.Chem.Int.Ed.2009,48,9318)。基于这种新范例，该领域的其他发展允许生产各种肽，例如五肽亮氨酸-脑啡肽(Hernández等人,J.Org.Chem.2010,75,7107；等人,Chem.Commun.2012,48,12100；Duangkamol等人,RSC Adv.2015,5,52624；Porte等人,Eur.J.Org.Chem.2016,3505；Landeros等人,Eur.J.Org.Chem.2017,687；Gonnet等人,ACS Sustainable Chem.Eng.2017,5,2936；Hernández等人,GreenChem.2017,19,2620；Maurin等人,Beilstein J.Org.Chem.2017,13,2087；Pétry等人,Beilstein J.Org.Chem.2017,13,2169)。尽管在最佳情况下能够生产超过4g的二肽，但这些方法仅限于不连续的间歇生产和实验室规模的生产，从而阻止了这些方法在肽行业中的广泛传播。最近，描述了通过利用反应性挤出α-L-氨基酸酯盐酸盐的酶催化聚合来合成高寡肽(homo-oligo-peptides)的可能性(Ardila-Fierro等人,Green Chem.2018,DOI:10.1039/C7GC03205F)。然而，由于聚合是基于单个α-L-氨基酸酯单体，因此这种方法不允许精细控制肽的α-L-氨基酸序列的多样性的任何可能性。另外，该研究未证明肽偶联的立体选择性。此外，该酶的利用先前被证明对于偶联α-D-氨基酸残基是无效的(Hernández,J.G.等人,Green Chem.2017,19,2620-2625)。因此，在本领域中仍需要改进的肽合成方法，包括与允许与已知的无溶剂方法相比生产更高量的肽的无溶剂肽合成有关的方法。
发明内容
本发明涉及用于合成式(I)的化合物的连续的、无溶剂的且非酶促的方法：
Ra-POLYPEP-Rc (I)
其中：
POLYPEP是多氨基酸化合物，
Ra表示N-保护基团；
Rc表示-O-Rd，其中，Rd表示氢原子、(C1-C24烷基)基团、用一个或多个苯基基团取代的甲基基团、未经取代的(C6-C10)芳基基团、O-保护基团或-NReRf基团，其中，Re和Rf基团彼此独立地表示氢原子、(C1-C24)烷基基团、用一个或多个苯基基团取代的甲基基团、未经取代的(C6-C10芳基)基团或N-保护基团，
所述方法包括以下步骤：
a)在没有任何溶剂的情况下，向挤出反应器中加入
(1)式(II)的化合物
Ra-PEPNt-Rg (II)
其中：
PEPNt是单氨基酸化合物或多氨基酸化合物，
Ra是如对于式(I)的化合物中所定义的，且
Rg是离去基团，
和
(2)式(III)的化合物
H-PEPCt-Rc (III)
其中：
PEPCt是单氨基酸化合物或多氨基酸化合物，且
Rc是如对于式(I)的化合物中所定义的，
使得式(II)的化合物和式(III)的化合物一起反应以生成式(I)的化合物，和
b)从挤出反应器中收集式(I)的化合物。
在所公开的方法的一些
具体实施方式
中，化合物(II)Ra-PEPNt-Rg由式(II’)的化合物构成：
其中，基团Ra、Rb1、Rb2、Rb3和Rg中的每一者的含义在本公开中进一步指定。
在所公开的方法的一些具体实施方式中，化合物(III)H-PEPCt-Rc由式(III’)的化合物构成：
其中，基团Rn1、Rn2、Rn3和Rc中的每一者的含义在本公开中进一步指定。
在一些实施方式中，每个Rb1基团彼此独立地表示氢原子，未经取代的(C1-C6)烷基基团或被选自以下的基团取代的(C1-C6)烷基基团：未经取代的芳基基团或被-OH基团取代的芳基基团、-OH、-COOH、-CONH2、-SH、-S-(C1-C6烷基)、-NH2、-NH-C(NH)(NH2)、-咪唑基和吲哚基，
在一些实施方式中，每个Rb3基团彼此独立地表示氢原子，未经取代的(C1-C6)烷基基团或被选自以下的基团取代的(C1-C6)烷基基团：未经取代的芳基基团或被-OH基团取代的芳基基团、-OH、-COOH、-CONH2、-SH、-S-(C1-C6烷基)、-NH2、-NH-C(NH)(NH2)、-咪唑基和吲哚基，
在一些实施方式中，每个成对的Rb1和Rb2、或每个成对的Rb3和Rb2(一个成对的Rb1和Rb2或一个成对的Rb2和Rb3独立于每个其他的成对的Rb1和Rb2或每个其他的成对的Rb2和Rb3)与它们各自连接的碳原子和氮原子一起形成包含至少一个氮原子的杂环。
在一些实施方式中，每个Rn1彼此独立地表示氢原子，未经取代的(C1-C6)烷基基团或被选自以下的基团取代的(C1-C6)烷基基团：未经取代的芳基基团或被-OH基团取代的芳基基团、-OH、-COOH、-CONH2、-SH、-S-(C1-C6烷基)、-NH2、-NH-C(NH)(NH2)、-咪唑基和吲哚基，
在一些实施方式中，每个Rn3彼此独立地表示氢原子，未经取代的(C1-C6)烷基基团或被选自以下的基团取代的(C1-C6)烷基基团：未经取代的芳基基团或被-OH基团取代的芳基基团、-OH、-COOH、-CONH2、-SH、-S-(C1-C6烷基)、-NH2、-NH-C(NH)(NH2)、-咪唑基和吲哚基，
在一些实施方式中，每个成对的Rn1和Rn2、或每个成对的Rn3和Rn2(一个成对的Rn1和Rn2或一个成对的Rn3和Rn2独立于每个其他的成对的Rn1和Rn2或每个其他的成对的Rn3和Rn2)与它们各自连接的碳原子和氮原子一起形成包含至少一个氮原子的杂环。
在该方法的一些实施方式中，步骤a)包括添加碱，例如选自由矿物碱或有机碱组成的组的碱。
在该方法的一些实施方式中，挤出反应器选自单螺杆挤出反应器和双螺杆挤出反应器。
在该方法的一些实施方式中，步骤a)通过将反应物保持在恒定的选定温度下进行，例如在30℃至100℃的温度下，包括在35℃至70℃的温度下。
具体实施方式
发明人构思了一种用于肽合成的方法，该方法允许以连续的、无溶剂的且非酶促的方式合成肽，从而允许以符合工业要求的量生产所期望的肽。
此外，发明人构思的方法允许以高产率和高纯度生产所期望的肽，并且该方法(i)鉴于液体添加剂和未反应的产品的低含量，完全符合对低环境影响的要求，(ii)考虑到所达到的高产品收得率，完全符合经济利益。
本发明涉及一种用于合成式(I)的化合物的连续的、无溶剂的且非酶促的方法：
Ra-POLYPEP-Rc (I)
其中：
POLYPEP是多氨基酸化合物，
Ra表示N-保护基团；
Rc表示-O-Rd，其中，Rd表示氢原子、(C1-C24烷基)基团、用一个或多个苯基基团取代的甲基基团、未经取代的(C6-C10)芳基基团、O-保护基团或-NReRf基团，其中，Re和Rf基团彼此独立地表示氢原子、(C1-C24)烷基基团、用一个或多个苯基基团取代的甲基基团、未经取代的(C6-C10芳基)基团或N-保护基团，
所述方法包括以下步骤：
a)在没有任何溶剂的情况下，向挤出反应器中加入
(1)式(II)的化合物
Ra-PEPNt-Rg (II)
其中：
PEPNt是单氨基酸化合物或多氨基酸化合物，
Ra是如对于式(I)的化合物中所定义的，且
Rg是离去基团，
和
(2)式(III)的化合物
H-PEPCt-Rc (III)
其中：
PEPCt是单氨基酸化合物或多氨基酸化合物，且
Rc是如对于式(I)的化合物中所定义的，
使得式(II)的化合物和式(III)的化合物一起反应以生成式(I)的化合物，和
b)从挤出反应器中收集式(I)的化合物。
术语“式(X)的化合物”和“化合物(X)”(例如“式(I)的化合物”和“化合物(I)”)可在本文中互换使用。
术语“氨基酸”和“氨酰基”可在本文中互换使用。在这些术语的常规使用中，“氨基酸”涵盖不与另一残基连接的残基，而“氨酰基”涵盖被视为与另一化学基团(例如另一氨酰基残基)连接的化学基团的氨基酸残基。
如本文所用，在其中PEPNt是单氨基酸化合物的实施方式中，基团Ra连接至所述氨基酸的中心氨基基团的氮原子，基团Rg连接至所述氨基酸的中心羰基基团的碳原子。
如本文所用，在其中PEPNt是多氨基酸化合物的实施方式中，基团Ra连接至位于所述多氨基酸化合物的N末端的氨基酸的中心氨基基团的氮原子，基团Rg连接至位于所述多氨基酸化合物的C末端的氨基酸的中心酰基基团的碳原子。
如本文所用，给定的氨基酸化合物的“中心”氨基基团由如果所述给定的氨基酸化合物结合至另一氨基酸化合物，则将涉入到肽键中的氨基基团构成。
如本文所用，给定的氨基酸化合物的“中心”羰基基团或酰基基团由如果所述给定的氨基酸化合物结合至另一氨基酸化合物，则将涉入到肽键中的羰基基团或酰基基团构成。
如本文所用，在其中PEPCt是单氨基酸化合物的实施方式中，表示为“H”的氢原子连接至所述氨基酸的中心氨基基团的氮原子，基团Rc连接至所述氨基酸的羰基基团的碳原子。
如本文所用，在其中PEPCt是多氨基酸化合物的实施方式中，表示为“H”的氢原子连接至位于所述多氨基酸化合物的N末端的氨基酸的中心氨基基团的氮原子，基团Rc连接至位于所述多氨基酸化合物的C末端的氨基酸的中心羰基基团的碳原子。
如本文所用，POLYPEP是多氨基酸化合物，其中，基团Ra连接至位于所述多氨基酸化合物的N末端的氨基酸的氨基基团的氮原子，基团Rg连接至位于所述多氨基酸化合物的C末端的氨基酸的酰基基团的碳原子。
如本文所用，“氨基酸”在其最一般的定义上由包含功能性伯氨基基团或仲氨基基团和功能性羧基基团的化合物组成。说明性地，除了包含功能性仲氨基基团的脯氨酸之外，所有天然氨基酸均包含功能性伯氨基基团。
根据定义，当方法的步骤a)包括使包含数量为“m”个的氨基酸的式(II)的化合物与包含数量为“n”个的氨基酸的式(III)的化合物反应时，得到的式(I)的化合物包含数量为“m”+“n”个的氨基酸。
如将在本公开的其他地方详细描述的，无论化合物(II)和化合物(III)中的每一者的大小如何，由于进行相同的独特反应步骤，所以对式(II)的化合物或式(III)的化合物中包含的氨基酸的数量没有严格限制。
在该方法的一些实施方式中，PEPNt和PEPCt各自排他地包含通过常规的aa1-C(＝O)-NH-aa2-酰胺肽键连接的氨酰基残基，其中，aa1和aa2各自代表氨酰基残基。
在一些其他实施方式中，PEPNt和PEPCt中的一者或PEPNt和PEPCt两者包含一个或多个通过非常规的肽键连接的残基，该非常规的肽键例如aa1-C(＝O)-O-aa2，其中，aa1表示氨酰基残基，aa2表示其中功能性氨基基团不存在的非常规氨酰基残基。根据这些实施方式，连接至残基的至少一个常规的酰胺肽键被酯键替代。其中两个残基通过这种非常规的酯键结合的肽在本领域中是众所周知的，并且通常被称为“缩酚酸肽(depsipeptide)”。
通常，化合物(II)和化合物(III)主要包含α氨酰基残基，即其中功能性氨基基团连接至位于其羧基基团的α位的碳原子的氨酰基残基。说明性地，20种天然氨基酸中的每一者均由α氨基酸构成。
在一些实施方式中，化合物(II)或化合物(III)中的一者或化合物(II)和化合物(III)两者包含一个或多个β氨酰基残基。β氨酰基残基，其中功能性氨基基团连接至位于其羧基基团的β位的碳原子。众所周知的β氨基酸是β丙氨酸。
在一些实施方式中，化合物(II)或化合物(III)中的一者或化合物(II)和化合物(III)两者包含一个或多个γ氨酰基残基。γ氨酰基残基，其中功能性氨基基团连接至位于其羧基基团的γ位的碳原子。众所周知的γ氨基酸是γ氨基丁酸。
在其中化合物(II)、化合物(III)或化合物(II)和化合物(III)两者由多氨基酸化合物组成的一些实施方式中，化合物(II)或化合物(III)中的一者或化合物(II)和化合物(III)两者包含伪肽，条件是：
-对于化合物(II)，Ra连接至位于化合物(II)的N末端的氨酰基残基的中心氨基基团的氮原子，基团Rg连接至位于化合物(II)的C末端的氨基酸的中心羰基基团的碳原子；和
-对于化合物(III)，表示为“H”的氢原子连接至位于化合物(III)的N末端基团的氨基酸的中心氨基基团的氮原子，Rc连接至位于化合物(III)的C末端的氨基酸的中心羰基基团的碳原子。
如本文所用，“伪肽”由包含化学链的化合物构成，该化学链最优选地是任选取代的烃链，该化合物不排他地包含氨酰基残基，其中，所述化合物(i)在所述化学链的一个末端包含功能性氨基基团，该末端在本文中可被称为“N末端”，并且(ii)在化学链的另一末端包含功能性羧基基团，该另一末端在本文中可被称为“C末端”。
在一些实施方式中，化合物(II)包含1个至500个氨基酸残基，例如1个至100个氨基酸残基，包括1个至50个氨基酸残基。
在一些实施方式中，化合物(III)包含1个至500个氨基酸残基，例如1个至100个氨基酸残基，包括1个至50个氨基酸残基。
如本文前面已经提到的，化合物(II)和化合物(III)两者可排他地包含通过常规的酰胺肽键彼此连接的氨酰基残基。
在所公开的方法的一些具体实施方式中，化合物(II)Ra-PEPNt-Rg由式(II’)的化合物构成：
其中，基团Ra、Rb1、Rb2、Rb3和Rg中的每一者的含义在本公开中进一步指定。
在所公开的方法的一些具体实施方式中，化合物(III)H-PEPCt-Rc由式(III’)的化合物构成：
其中，基团Rn1、Rn2、Rn3和Rc的含义在本公开中进一步指定。
所公开的方法的这些具体实施方式允许获得式(I’)的化合物，如下文详述。
因此，本发明还涉及用于合成式(I’)的化合物的连续的、无溶剂的且非酶促的方法。
其中：
m是1或更大的整数，
n是1或更大的整数，
Ra表示N-保护基团；
每个Rb1彼此独立地表示氢原子，未经取代的(C1-C6)烷基基团或被选自以下的基团取代的(C1-C6)烷基基团：未经取代的芳基基团或被-OH基团取代的芳基基团、-OH、-COOH、-CONH2、-SH、-S-(C1-C6烷基)、-NH2、-NH-C(NH)(NH2)、-咪唑基和吲哚基，
Rb2选自由氢原子、烷基基团、芳基基团或N-保护基团组成的组，
每个Rb3彼此独立地表示氢原子，未经取代的(C1-C6)烷基基团或被选自以下的基团取代的(C1-C6)烷基基团：未经取代的芳基基团或被-OH基团取代的芳基基团、-OH、-COOH、-CONH2、-SH、-S-(C1-C6烷基)、-NH2、-NH-C(NH)(NH2)、-咪唑基和吲哚基，
或者
每个成对的Rb1和Rb2、或每个成对的Rb3和Rb2(一个成对的Rb1和Rb2或一个成对的Rb2和Rb3独立于每个其他的成对的Rb1和Rb2或每个其他的成对的Rb2和Rb3)与它们各自连接的碳原子和氮原子一起形成包含至少一个氮原子的杂环，
以及
每个Rn1彼此独立地表示氢原子，未经取代的(C1-C6)烷基基团或被选自以下的基团取代的(C1-C6)烷基基团：未经取代的芳基基团或被-OH基团取代的芳基基团、-OH、-COOH、-CONH2、-SH、-S-(C1-C6烷基)、-NH2、-NH-C(NH)(NH2)、-咪唑基和吲哚基，
Rn2选自由氢原子、烷基基团或芳基基团组成的组，并且
每个Rn3彼此独立地表示氢原子，未经取代的(C1-C6)烷基基团或被选自以下的基团取代的(C1-C6)烷基基团：未经取代的芳基基团或被-OH基团取代的芳基基团、-OH、-COOH、-CONH2、-SH、-S-(C1-C6烷基)、-NH2、-NH-C(NH)(NH2)、-咪唑基和吲哚基，
或者
每个成对的Rn1和Rn2、或每个成对的Rn3和Rn2(一个成对的Rn1和Rn2或一个成对的Rn3和Rn2独立于每个其他的成对的Rn1和Rn2或每个其他的成对的Rn3和Rn2)与它们各自连接的碳原子和氮原子一起形成包含至少一个氮原子的杂环，
Rc表示-O-Rd，其中，Rd表示氢原子、未经取代的(C1-C24烷基)基团、用一个或多个苯基基团取代的甲基基团、未经取代的(C6-C10)芳基基团、或O-保护基团或-NReRf基团，其中，Re和Rf基团彼此独立地表示氢原子、(C1-C24)烷基基团、用一个或多个苯基基团取代的甲基基团、未经取代的(C6-C10芳基)基团或N-保护基团，
该方法包括以下步骤：
a)在没有任何溶剂的情况下，向挤出反应器中加入
(1)式(II’)的化合物
其中
m、Ra、Rb1、Rb2和Rb3是如对于式(I’)的化合物中所定义的，且
Rg是离去基团，
和
(2)下式(III’)的化合物
其中
n、Rn1、Rn2、Rn3和Rc是如对于式(I’)的化合物中所定义的，
使得式(II’)的化合物和式(III’)的化合物一起反应以生成式(I’)的化合物，和
b)从挤出反应器中收集式(I’)的化合物。
在一些实施方式中，式(I)的化合物或式(I’)的化合物涵盖其药学上可接受的盐。
在本发明的意义上，术语“(C1-C24)烷基基团”是指具有1个至24个碳原子的任何线性或支化的烷基基团，特别是甲基基团、乙基基团、正丙基基团、异丙基基团、正丁基基团、异丁基基团、仲丁基基团、叔丁基基团、正戊基基团、正己基基团。有利地，其是甲基基团或叔丁基基团。
除非另有说明，“芳基”是指具有6个至14个碳原子、优选具有6个至10个碳原子的芳族单环烃环体系或芳族多环烃环体系。示例性的芳基基团包括苯基或萘基。说明性地，(C6)芳基基团是苯基。
在本发明的意义上，术语“N-保护基团”是指保护NH2基团免于不希望的反应的任何取代基，例如在Greene,“Protective Groups In Organic Synthesis”,(John Wiley&Sons,纽约(1981))和Harrison等人，“Compendium of Synthetic Organic Methods”,第1卷至第8卷(J.Wiley&Sons,1971-1996)中描述的N-保护基团。N-保护基团包括氨基甲酸酯、酰胺、N-烷基化衍生物、氨基乙缩醛衍生物、N-苄基化衍生物、亚胺衍生物、烯胺衍生物和N-杂原子衍生物。特别地，N-保护基团包括甲酰基、乙酰基、苯甲酰基、新戊酰基、苯磺酰基、苄基(Bn)、叔丁氧羰基(Boc)、苄氧羰基(Cbz)、对甲氧基苄氧羰基、对硝基苄氧羰基、三氯乙氧羰基(Troc)、烯丙氧羰基(Alloc)、9-芴基甲氧羰基(Fmoc)、三氟乙酰基、氨基甲酸苄酯(取代的或未经取代的)等。使用Boc或Cbz作为N-保护基团是有利的，因为相对的去除便利性，例如在Boc的情况下用温和的酸(例如乙酸乙酯中的三氟乙酸、或盐酸)去除，或在Cbz的情况下通过催化氢化去除。有利地，N-保护基团是Boc基团。
在本发明的意义上，术语“O-保护基团”是指保护羟基基团或羧基基团(即反应性氧原子)免于不希望的反应的任何取代基，例如在Greene,“Protective Groups InOrganic Synthesis”,(John Wiley&Sons,纽约(1981))和Harrison等人，“Compendium ofSynthetic Organic Methods”,第1卷至第8卷(J.Wiley&Sons,1971-1996)中描述的O-保护基团。O-保护基团包括经取代的或未经取代的甲基或烷基醚(例如甲氧基甲基、苄氧基甲基、2-甲氧基乙氧基甲基、2-(三甲基甲硅烷基)乙氧基甲基、叔丁基、苄基和三苯基甲基)、苄基醚(经取代的或未经取代的)、四氢吡喃基醚、烯丙基醚、经取代的乙基醚(例如2,2,2-三氯乙基醚)、甲硅烷基醚或烷基甲硅烷基醚(例如三甲基甲硅烷基醚、叔丁基二甲基甲硅烷基醚和叔丁基二苯基甲硅烷基醚)、杂环醚；以及通过羟基与羧酸反应制备的酯(例如叔丁基酯、苄基酯或甲基酯)、碳酸酯(尤其是碳酸苄酯或碳酸卤代烷基酯)、乙酸酯、丙酸酯、苯甲酸酯等。有利地，O-保护基团是苄基基团。
随后，可将式(I’)的化合物脱保护，以获得-OH、-NH2、-SH、-NH、-CONH2和-COOH官能团未被保护的肽。
在本发明的意义上，术语“离去基团”是指允许式(II’)的化合物的基团-C(O)-Rg与式(III’)的化合物的基团NH-Rn2反应的任何化学基团。因此，离去基团涵盖本领域技术人员众所周知的并且用于肽合成的已知化学物中两个氨基酸残基之间的偶联反应中的任何离去基团。离去基团可以例如选自由N-取代的氨基甲酸酯、五氟苯基羟基化物和琥珀酰亚胺基N-羟基化物(succinimidyl N-hydroxylate)组成的组。离去基团涵盖选自由以下组成的组的那些离去基团：咪唑酸酯(imidazolate)、苯并咪唑酸酯(benzimidazolate)、苯并***N-羟基化物、氮杂苯并***N-羟基化物、嘧啶羟基化物、三嗪羟基化物、对硝基苯基羟基化物和肟酸酯(oximate)(例如)。离去基团还涵盖选自卤化物(例如氟化物、溴化物和氯化物)的组的那些离去基团。离去基团还涵盖选自羧酸酯和碳酸酯的组的那些离去基团。本领域技术人员可在以下出版物中找到本文中涵盖的离去基团：El-Faham等人，(2011,Chemical reviews,卷111(11)：6557-6602)。
“成对的”基团(Rb1和Rb2、Rb3和Rb2、Rn1和Rn2、或Rn3和Rn2)，在本文中意指成对的两个基团是化合物(I’)、化合物(II’)或化合物(III’)的同一单体单元的一部分，并且其中，成对基团中的第一基团(第一基团Rb1、Rb3、Rn1、Rn3之一)连接至与成对基团的第二基团连接的氮原子相邻的碳原子。
因此，式(I’)的化合物由m个包含基团Rb1、基团Rb2和基团Rb3的单元和n个包含基团Rn1、基团Rn2和基团Rn3的单元形成。包含基团Rb1、基团Rb2和基团Rb3的每个单元在本文中可以被称为氨基酸残基，尽管也可以使用更准确的术语氨酰基基团。包含基团Rn1、基团Rn2和基团Rn3的每个单元在本文中可以被称为氨基酸残基，尽管也可以使用更准确的术语氨酰基基团。
于是，包含数量为“m+n”个氨基酸残基的式(I’)的化合物在本文中可以称为肽。
如将在本说明书的其他地方更详细地描述的，Rb1、Rb2和Rb3的含义的一些组合定义了由天然氨基酸(即天然氨酰基基团)组成的单元。同样，Rn1、Rn2和Rn3的含义的一些组合定义了由天然氨基酸(即天然氨酰基基团)组成的单元。
本文所描述的连续的肽合成方法包括通过反应性挤出的无溶剂且非酶促合成的方法。
如本申请中将描述的，本文的连续的肽合成方法是肽合成的非酶促方法，这意味着所述方法在不存在任何添加的酶的情况下进行。本文的方法是用于无溶剂的肽合成的纯化学方法。
式(I’)的化合物包含m+n个单体单元，该m+n个单体单元形成这些m+n个单元的聚合物链。
如本文所用的，式(I’)的化合物可以称为肽(即式(I’)的肽)，其中，由化合物(II’)带来的数量为m个的单体单元位于肽的“N末端”，并且其中，由化合物(III’)带来的数量为n个的单体单元位于肽的“C末端”，参考通常关于常规的肽(例如天然的肽)使用的命名法。
此外，本文所描述的连续的肽合成方法允许获得包含不同的单体单元的式(I’)的化合物，因为(i)第一给定单体单元的基团Rb1、Rb2和Rb3可不同于(ii)第二给定单体单元的基团Rb1、Rb2和Rb3。类似地，(i)第一给定单体单元的基团Rn1、Rn2和Rn3可不同于(ii)第二给定单体单元的基团Rn1、Rn2和Rn3。仍然类似地，(i)第一给定单体单元的基团Rb1、Rb2和Rb3可不同于(ii)第二给定单体单元的基团Rn1、Rn2和Rn3。
换句话说，根据本文所描述的连续的肽合成方法，式(I)的化合物(包括式(I’)的化合物)不限于m+n个单体单元的均聚物，因此包括m+n个单体单元的杂聚物，其中，本文包含的所述单体单元中的至少两者是彼此不同的。
因此，在其中式(I)的化合物(包括式(I’)的化合物)中包含的单元由天然氨基酸残基组成的一些实施方式中，本文所描述的连续的合成方法允许获得具有确定的氨基酸序列的肽，例如具有治疗有用性的肽。
此外，在涵盖化合物(I’)的化合物(I)的一些具体实施方式中，明确排除了其中包含的所有单体单元是相同的。换句话说，根据化合物(I)或化合物(I’)的这些具体实施方式，所述化合物(I)或化合物(I’)不由均聚物化合物组成，例如不由给定的氨基酸残基的均聚物(例如聚丙氨酸肽)组成。
如直接来自本公开的内容，本文的连续的肽合成方法允许完全控制化合物(I)或化合物(I’)中包含的单元链的序列。换句话说，在其中单体单元由天然氨基酸组成的说明性实施方式中，本文的连续的肽合成方法允许完全控制所得的式(I)或式(I’)的肽的氨基酸序列。
出乎意料地，发明人已经表明，式(I)或(I’)的化合物可以在不存在任何溶剂的情况下通过使(i)式(II)或式(II’)的活化的第一氨基酸或活化的第一肽和(ii)式(III)或式(III’)的反应性第二氨基酸或反应性第二肽在挤出反应器内接触而合成。
出乎意料地，发明人还已经表明，式(I)或(I’)的化合物可以在不存在任何溶剂的情况下通过使(i)式(II)或式(II’)的活化的第一氨基酸或活化的第一肽和(ii)式(III)或式(III’)的反应性第二氨基酸或反应性第二肽和(iii)碱在挤出反应器内接触而合成。
在一些优选的实施方式中，(i)要添加的式(II)或式(II’)的所述第一氨基酸或第一肽和(ii)式(III)或式(III’)的所述第二氨基酸或所述第二肽(一起反应以形成式(I)或式(I’)的化合物)均以固体形式提供，通常是固态，优选是粉末形式。根据该方法的这些优选实施方式，步骤a)还包括添加液体添加剂以降低化合物(II)或化合物(II’)和化合物(III)或化合物(III’)的混合物的粘度，从而改善化合物(II)或化合物(II’)与化合物(III)或化合物(III’)的混合。
在一些其他的优选的实施方式中，化合物(II)(或化合物(II’))或化合物(III)(或化合物(III’))中的一者为液体形式。说明性地，化合物(II)(或化合物(II’))或化合物(III)(或化合物(III’))中的一者由所述化合物的溶液组成。根据这些其他的实施方式，进行连续的合成方法的步骤a)不需要添加液体添加剂，因为通过化合物(II)(或化合物(II’))或化合物(III)(或化合物(III’))的溶液中所含的液体添加剂已经达到了反应混合物的适当粘度。
这两种主要反应物之间的成功且完全的反应更令人惊讶，这是因为在挤出反应器中产生的剪切力仅允许这两种主要反应物均匀混合，而没有明显降低粉末粒径，因此基本上没有增加活性表面，这与在其他类型的反应器(例如球磨装置)中施加的磨削力形成了对比。而且，化合物(II)或化合物(II’)与化合物(III)或化合物(III’)之间的成功且完全的反应更令人惊讶，因为已知的是，与在其他类型的反应器中施加的力相比、尤其是与在球磨装置中施加的力相比，施加于挤出机中的反应混合物的机械力具有完全不同的性质且具有低得多的强度。
在本文的连续的合成方法的一些优选实施方式中，如一些实施例中所示，步骤a)在不存在添加的碱的情况下进行。
在本文的连续的合成方法的一些优选实施方式中，如其他实施例中所示，步骤a)包括添加碱。
在该方法的一些其他优选实施方式(尤其是其中化合物(III)或化合物(III’)为盐的形式的实施方式)中，所述盐可以选自包括以下的组：盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、富马酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐或二苯磺酰胺盐(dibenzenesulfonamidatesalt)。
用本文的连续的方法获得的成功且完全的反应意味着，出乎意料地，使用挤出反应器装置允许同时接触反应完成所需的三种试剂，即(1)式(II)或式(II’)的化合物和(2)式(III)或式(III’)的化合物，或替选地(1)式(II)或式(II’)的化合物和(2)式(III)或式(III’)的化合物和(3)碱。因此，出乎意料地，当同时或几乎同时添加用于形成初始反应混合物的三种所需试剂时，本文的连续的方法允许高产率的肽合成。
尽管反应性挤出已在食品和塑料行业中广泛使用，并且在制药行业中也引起了兴趣，但通过反应性挤出生产高附加值的化学品是罕见的(Jiménez-González等人,Org.Process Res.Dev.2011,15,900；Dhumal等人,Pharm.Res.2010,27,2725；Medina等人,J.Pharm.Sci.2010,99,1693；Daurio等人,Faraday Discuss.2014,170,235；Crawford等人,Chem.Sci.2015,6,1645；Crawford等人,Chem.Commun.2016,52,4215；Karak等人,J.Am.Chem.Soc.2017,139,1856；Crawford等人,Green Chem.2017,19,1507；Crawford等人,Chem.Commun.2017,53,13067；Isoni等人,Org.Process Res.Dev.2017,21,992；Ardila-Fierro等人,Green Chem.2018,DOI:10.1039/C7GC03205F)。文献报道的第一示例描述了有机共晶体的形成。后来，反应性挤压被用于通过缩合反应来合成金属有机骨架(MOF)、低共熔溶剂(DES)、共价有机骨架(COF)以及α,β-不饱和羰基化合物和亚胺。还已经描述了通过反应性挤出用NaBH4来还原醛。最近，描述了通过反应性挤出、通过α-L-氨基酸酯盐酸盐的酶催化聚合来合成高寡肽的可能性(Ardila-Fierro等人,Green Chem.2018,DOI:10.1039/C7GC03205F)。然而，由于聚合是基于单个α-L-氨基酸酯单体，因此这种方法不允许精细控制肽的α-L-氨基酸序列的多样性的任何可能性。另外，该研究未证明肽偶联的立体选择性。此外，该酶的利用先前被证明对于偶联α-D-氨基酸残基是无效的(Hernández,J.G.等人,Green Chem.2017,19,2620-2625)。对于本领域技术人员众所周知的是，酶催化的肽偶联对于偶联α-D-氨基酸残基是无效的，而化学方法对于偶联L氨基酸残基和D氨基酸残基是同样有效的。
根据发明人的认知，本文首次描述了利用挤出反应器的非酶促的肽合成方法。该方法能够精细地控制所寻求合成的肽的α-氨基酸序列的多样性。
本文所描述的连续的且无溶剂的肽合成方法允许反应物完全转化为所期望的肽。
如实施例所示，本文所描述的连续的合成方法克服了工业肽生产的主要障碍。
挤出机由包括一个或两个旋转螺杆的机筒组成，能够通过压缩力和剪切力有效地运输和混合物料。值得注意的是，在连续的合成方法的一些实施方式中，再循环管的存在可以允许控制待挤出的物料的停留时间。有利地，这种类型的设备允许在受控的且连续的流动条件下工作，同时可以将机筒加热直到引发熔化的相，从而促进反应混合物的全部挤出。
和与粘性液体和/或不溶性固体不相容的传统的基于溶液的流动化学相反，挤出机能够有效地混合粘性的和/或含固体的反应混合物。
如实施例所示，本文所描述的连续的合成方法允许生产其中氨基酸单元保持其初始对映体形式的肽。换句话说，如实施例所示，通过使所期望的氨基酸对映体在该方法的步骤a)反应，本文所描述的连续的合成方法允许控制向第二氨基酸或肽链添加给定氨基酸的L-对映体或D-对映体。
本文的连续的合成方法可以在本领域已知的多种挤出反应器装置中进行。
在一些实施方式中，本文的连续的合成方法在单螺杆反应器装置中进行。
在优选的实施方式中，本文的连续的合成方法在双螺杆(double screw)反应器装置中进行，该装置也可以称为双螺杆(twin-screw)反应器装置。
不希望受任何特定理论的约束，发明人相信用双螺杆反应器装置进行本文的连续的合成方法允许反应物(式(II)或式(II’)的化合物、式(III)或式(III’)的化合物和任选的碱)分别更好地紧密混合。
在一些优选的实施方式中，步骤a)通过将反应物保持在恒定的选定温度下进行。如本文所用，“恒定的”温度是指(i)在考虑到挤出机机筒的特定横截面时在反应混合物的整体质量中基本上相同的温度和(ii)在反应混合物的沿挤出机机筒长度的不同位置处基本上相同的温度。如本文所用，恒定的温度涵盖与期望温度设定点值相比+/-10％变化的温度值。
在本文的连续的方法的一些其他优选实施方式中，步骤a)通过在化合物(II)或化合物(II’)与化合物(III)或化合物(III’)之间的反应过程中改变温度来进行。说明性地，在步骤a)的开始添加化合物(II)或化合物(II’)和化合物(III)或化合物(III’)以及任选的碱之后，在被编程以维持初始反应混合物在第一选定温度A的挤出机的进料端，反应混合物的温度可以随着所述反应混合物沿着挤出机装置的机筒的进程而变化，例如反应混合物的温度可以随着所述反应混合物沿着挤出机装置的机筒的进程而升高。说明性地，可以对挤出机机筒的温度进行编程，以应用反应混合物随着其沿着挤出机机筒的进程的温度曲线，即应用反应混合物随着反应完成的进程的温度曲线。应用选定的温度曲线以进行化合物(II)或化合物(II’)与化合物(III)或化合物(III’)以及任选的碱之间的反应，允许更精确地控制反应步骤a)，并可以进一步增加所述反应的产率，而减少或完全避免反应物中的一者或两者的水解。本领域技术人员可以容易地执行在连续的方法的步骤a)中应用温度曲线，说明性地通过使用配备有沿着挤出机机筒设置的多个加热部件的挤出机装置，并且其中，可单独控制这些加热部件中的每一者的温度。
因此，在本文的连续的合成方法的一些实施方式中，可以将温度曲线应用于步骤a)，根据该温度曲线，例如将化合物(II)或化合物(II’)与化合物(III)或化合物(III’)以及任选的碱的反应混合物引入在挤出机机筒的进料端时，将该反应混合物置于起始温度T1℃，然后逐渐升高反应混合物的温度直至反应温度T2℃，例如通过程序化的升温斜率，然后将反应混合物的温度朝着温度T3℃降低，该温度T3℃可表示在方法的步骤b)中从挤出装置收集反应混合物或更准确地包括合成的化合物(I)的物料的温度。
这些优选的实施方式可通过精细控制挤出反应器装置中反应混合物的温度的可能性而获得。
通常，挤出反应器装置配备有铸金属分体式圆筒(cast metal split cylinder)，例如铸钢分体式圆筒，其中嵌入有绝缘电阻丝。示例性的加热器装置是云母带式加热器，其包括夹在云母绝缘体之间的经涂覆的电阻丝，并用钢制外壳支撑。在挤出反应器装置的一些实施方式中，加热器装置也可以由已知的陶瓷加热器组成。不管使用哪种加热器装置，这些加热器装置都与挤出机机筒紧密接触，以便在整个横跨挤出机机筒和顺着挤出机机筒都允许高的能量传递能力和反应混合物的均匀温度的控制。
当进行本文的连续的合成方法时，这种精细的温度控制、特别是在整个反应混合物的质量中对均匀温度控制的这种控制，允许以高度可再现的方式执行所述连续的方法，包括确保连续的合成方法在得到的肽生产产率、由此合成的肽的对映体纯度以及反应物的低水平水解(说明性地式(II)或式(II’)的化合物的减少的或甚至无法检测到的水解)的方面具有可再现性。
用其他类型的反应器、通常用球磨反应器不能对反应混合物进行如此精细和恒定的温度控制。
如实施例中所示，本领域技术人员可以根据所期望的类型的反应条件调整反应温度、任选地调整反应温度曲线。实施例中所包含的实验数据向本领域技术人员给出了对于进行本文的连续的合成方法的最佳温度条件(特别是根据所寻求的反应时间段)的完全的指导。
然而，在优选的实施方式中，所述本领域技术人员将使用允许使反应物的水解最小化(说明性地使式(II)的化合物的水解最小化)的温度条件。
在一些实施方式中，步骤a)在30℃至100℃的温度下进行。
在一些实施方式中，步骤a)在35℃至70℃的温度下进行。
在一些实施方式中，步骤a)在55℃至100℃、例如55℃至90℃的温度下执行。
本文的实施例允许本领域技术人员选择合适的反应条件，其取决于(i)反应混合物的温度和(ii)步骤a)的持续时间。如本文的实施例所示，升高反应混合物的温度允许减少反应时间，即步骤a)的持续时间，以获得所得的式(I)或式(I’)的化合物。
连续的合成方法的步骤a)的其他一般条件可以由本领域技术人员容易地确定，尤其是例如挤出机反应器装置的类型，包括挤出机机筒的长度、螺杆的数量、螺杆型线(screwprofile)以及挤出机螺杆的转速。
在一些实施方式中，该方法的步骤a)的持续时间为30秒至120分钟、有利地为1分钟至20分钟。
如实施例所示，在给定的反应时间段内，增加挤出机螺杆的转速值可以提高反应产率。说明性的螺杆转速值在本文的实施例中公开。
说明性地，螺杆转速值可以为30rpm(每分钟转数)至200rpm，例如50rpm至150rpm，这尤其取决于步骤a)的温度条件。
本领域技术人员可以根据本文的实施例及其一般技术知识容易地确定连续的合成方法的步骤a)的最佳反应条件，例如选择挤出反应器装置，其中考虑到反应混合物沿着挤出机筒的长度的进程速度，机筒长度和螺杆型线适于反应，当执行在挤出机筒出口处收集式(I)的化合物的步骤b)时，有效地获得所期望的肽。
在该方法的一些实施方式中，可以使用配备有机筒的挤出反应器，该机筒的长度或螺杆型线不允许反应混合物具有足够的停留时间以使反应在其结束时完全发生。在这些实施方式中，优选使用包括再循环管的挤出机筒，使得将在反应混合物在挤出机筒内进一步通过期间完成反应。根据这些实施方式，进行反应混合物的再循环，直到式(II)或式(II’)的化合物与式(III)或式(III’)的化合物之间的反应完全，以生成式(I)的化合物。根据这些具体实施方式中的一些，反应混合物可朝向挤出机机筒的进料端再循环，同时将新鲜的反应物(即化合物(II)或化合物(II’)、化合物(III)或化合物(III’)和任选的液体添加剂和/或碱)继续添加到挤出机机筒中。
在优选的实施方式中，使用具有这样的长度和螺杆型线的挤出机筒：该长度和螺杆型线足以在反应混合物单次通过挤出机筒后完成式(II)或式(II’)的化合物与式(III)或式(III’)的化合物之间的反应以生成式(I)或式(I’)的化合物。
在本文所描述的连续的合成方法的一些实施方式中，步骤a)可以在30℃至100℃(例如55℃至100℃)的温度下、在30秒至20分钟的时间段内、使用双螺杆挤出机装置、并通过应用30rpm(每分钟转数)至200rpm的转速(其涵盖50rpm至150rpm的转速)来进行。
在本文所描述的连续的合成方法的一些实施方式中，当化合物(II’)的基团Rb1和Rb2与它们各自连接的碳原子和氮原子一起形成包含至少一个氮原子的杂环时，所述杂环为吡咯烷基。这涵盖连续的合成方法的其中式(II’)的化合物包含脯氨酰基残基的实施方式。在这些实施方式的某些实施方式中(其中所述Rb1和Rb2基团属于与Rg基团直接连接的单元)，涵盖连续的肽合成方法的其中化合物(II’)包含活化的脯氨酰基末端残基(例如活化的脯氨酰基C末端残基)的实施方式。
在本文所描述的连续的合成方法的一些实施方式中，当化合物(II’)的基团Rb3和Rb2与它们各自连接的碳原子和氮原子一起形成包含至少一个氮原子的杂环时，所述杂环为吡咯烷基。这涵盖连续的合成方法的其中式(II’)的化合物包含脯氨酰基残基的实施方式。在这些实施方式的某些实施方式中(其中所述Rb3和Rb2基团属于与Rg基团直接连接的单元)，涵盖连续的肽合成方法的其中化合物(II’)包含活化的脯氨酰基末端残基(例如活化的脯氨酰基C末端残基)的实施方式。
在本文所描述的连续的合成方法的一些实施方式中，当化合物(III’)的基团Rn1和Rn2与它们各自连接的碳原子和氮原子一起形成包含至少一个氮原子的杂环时，所述杂环为吡咯烷基。这涵盖连续的合成方法的其中式(III’)的化合物包含脯氨酰基残基的实施方式。
在本文所描述的连续的合成方法的一些实施方式中，当化合物(III’)的基团Rn3和Rn2与它们各自连接的碳原子和氮原子一起形成包含至少一个氮原子的杂环时，所述杂环为吡咯烷基。这涵盖连续的合成方法的其中式(III’)的化合物包含脯氨酰基残基的实施方式。
在本文所描述的连续的合成方法的一些实施方式中，在化合物(I’)或化合物(II’)包含的单体单元中，因此对于成对的Rb1和Rb3基团，基团Rb1或Rb3中的一者表示氢原子，未经取代的(C1-C6)烷基基团或被选自以下的基团取代的(C1-C6)烷基基团：未经取代的芳基基团或被-OH基团取代的芳基基团、-OH、-COOH、-CONH2、-SH、-S-(C1-C6烷基)、-NH2、-NH-C(NH)(NH2)、-咪唑基和吲哚基，并且基团Rb1和Rb3中的另一基团是氢原子。在这些实施方式的一些实施方式中，Rb2是氢原子。
在本文所描述的连续的合成方法的一些实施方式中，在化合物(I’)或化合物(II’)包含的单体单元中，Rb1或Rb3选自由以下组成的组：氢原子、甲基、-CH2-CH2-CH2-NH-C(＝NH)NH2、-CH2-C(＝O)-NH2、-CH2-COOH、-CH2-SH、-(CH2)2-C(＝O)-NH2、-(CH2)2-COOH、-CH2-咪唑基、-CH(CH3)-CH2-CH3、-CH2-CH(CH3)2、-(CH2)4-NH2、-CH2-CH2-S-CH3、-CH2-苯基、-CH2OH、-CH(OH)-CH3、-CH2-吲哚基、-CH2-苯基-OH和异丙基，并且Rb1和Rb3中的另一基团是氢原子。在这些实施方式的一些实施方式中，Rb2是氢原子。这涵盖其中式(II’)的化合物包含一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸残基的实施方式：甘氨酸残基、丙氨酸残基、精氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、蛋氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、色氨酸残基、酪氨酸残基和缬氨酸残基。
在本文所描述的连续的合成方法的一些实施方式中，在化合物(I’)或化合物(III’)包含的单体单元中，因此对于成对的Rn1和Rn3基团，基团Rn1或Rn3中的一者表示氢原子，未经取代的(C1-C6)烷基基团或被选自以下的基团取代的(C1-C6)烷基基团：未经取代的芳基基团或被-OH基团取代的芳基基团、-OH、-COOH、-CONH2、-SH、-S-(C1-C6烷基)、-NH2、-NH-C(NH)(NH2)、-咪唑基和吲哚基，并且基团Rn1和Rn3中的另一基团是氢原子。在这些实施方式的一些实施方式中，Rn2是氢原子。
在本文的连续的合成方法的一些实施方式中，在化合物(I’)或化合物(III’)包含的单体单元中，Rn1或Rn3选自由以下组成的组：氢原子、甲基、-CH2-CH2-CH2-NH-C(＝NH)NH2、-CH2-C(＝O)-NH2、-CH2-COOH、-CH2-SH、-(CH2)2-C(＝O)-NH2、-(CH2)2-COOH、-CH2-咪唑基、-CH(CH3)-CH2-CH3、-CH2-CH(CH3)2、-(CH2)4-NH2、-CH2-CH2-S-CH3、-CH2-苯基、-CH2OH、-CH(OH)-CH3、-CH2-吲哚基、-CH2-苯基-OH、异丙基，并且Rn2是氢原子。在这些实施方式的一些实施方式中，Rn2是氢原子。这涵盖其中式(III)的化合物包含一种或多种选自由以下组成的组的氨基酸残基的实施方式：甘氨酸残基、丙氨酸残基、精氨酸残基、天冬酰胺残基、天冬氨酸残基、半胱氨酸残基、谷氨酰胺残基、谷氨酸残基、组氨酸残基、异亮氨酸残基、亮氨酸残基、赖氨酸残基、蛋氨酸残基、苯丙氨酸残基、丝氨酸残基、苏氨酸残基、色氨酸残基、酪氨酸残基和缬氨酸残基。
在本文所描述的连续的合成方法的一些优选实施方式中，步骤a)不包括添加碱。
在本文所描述的连续的合成方法的一些其他优选实施方式中，步骤a)包括添加碱。在这些优选的实施方式中，步骤a)中使用的碱可以选自由任何已知的矿物碱组成的组，例如碳酸盐和磷酸盐。在这些优选实施方式的一些其他实施方式中，碱可以是氢氧化物，例如选自包括以下的组的氢氧化物：氢氧化钠、氢氧化锂、氢氧化铯以及氢氧化钡或氢氧化钙。在这些优选实施方式的一些其他实施方式中，碱可以是有机碱，例如选自包括以下的组的碱：三乙胺、N，N-二异丙基乙胺和1,8-二氮杂双环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)、甲醇钠或甲醇钾、四丁基氢氧化铵、吡啶、双(三甲基甲硅烷基)酰胺钠或双(三甲基甲硅烷基)酰胺钾。
因此，在本文的连续的合成方法的一些优选实施方式中，步骤a)包括添加碱。
在该方法的一些其他优选实施方式(尤其是其中化合物(III)或化合物(III’)为盐的形式的实施方式)中，所述盐可以选自包括以下的组：盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、富马酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐或二苯磺酰胺盐。
在这些实施方式中，添加的碱与化合物(III)或化合物(III’)反应，从而生成去质子化的化合物(III)或化合物(III’)，其与化合物(II)或化合物(II’)反应变得具有高度反应性。
在其中连续的合成方法的步骤a)中使用的碱选自碳酸盐的实施方式中，所述碳酸盐优选选自由以下组成的组：碳酸氢钠、碳酸氢钾、碳酸氢铯、碳酸钠、碳酸钾和碳酸铯。
本领域技术人员可以容易地确定在本文的连续的合成方法的步骤a)的这些实施方式中要添加的碱的量，而与所添加的碱的种类无关。本领域技术人员可以容易地确定将允许化合物(III)或化合物(III’)去质子化的碱的量。
说明性地，本领域技术人员可以参考式(III)或式(III’)的化合物的pKa，以确定在步骤a)中使用的将导致式(III)或式(III’)的化合物去质子化的碱的类型。说明性地，在其中包含基团Rc的单元由天然氨基酸甲酯的盐酸盐组成的实施方式中，碱NaHCO3是足够碱性的，以使天然氨基酸甲酯的盐酸盐去质子化，从而使得天然氨基酸甲酯的游离碱能够与式(II)或式(II’)的化合物反应。
在一些实施方式中，可以在步骤a)开始时添加的选定的碱为固态，优选为粉末形式。
在一些其他实施方式中，可以在步骤a)开始时添加的选定的碱为液体形式，例如液体碱溶液。如实施例所示，式(II)或式(II’)的化合物与式(III)或式(III’)的化合物之间的反应是化学计量的。
因此，在本文所描述的连续的合成方法的优选实施方式中，提供基本上等摩尔量的式(II)或式(II’)的化合物和式(III)或式(III’)的化合物中的每一者，以在步骤a)开始时给挤出反应器进料。
如本文所用，“基本上等摩尔量”的两种化合物(例如“基本上等摩尔量”的式(II)或式(II’)的化合物和式(III)或式(III’)的化合物)是指最大量的化合物的摩尔数超过其他化合物的摩尔数的最多15％。
在本文所描述的连续的合成方法的步骤a)的优选实施方式中，与式(III)或式(III’)的化合物相比，以超过10％摩尔提供式(II)或式(II’)的化合物。
在另外的优选实施方式(其中在该方法的步骤a)中加入碱)中，与在式(II)或式(II’)的化合物和式(III)或式(III’)的化合物中最大量的相应摩尔量相比，在步骤a)中也以“基本上等摩尔量”添加碱。
根据这些进一步优选的实施方式，与式(II)或式(II’)的化合物和式(III)或式(III’)的化合物相比，可以以过量的摩尔添加碱。
说明性地，在本文所描述的连续的合成方法的一些实施方式中，反应物可以在步骤a)中以以下相应的摩尔量添加：(i)1摩尔当量的化合物(II)或化合物(II’)，(ii)1.1摩尔当量的化合物(III)或化合物(III’)和1.2摩尔当量的碱(例如碳酸盐、例如碳酸氢钠)。
在式(I)或式(I’)的化合物、或式(II)或式(II’)的化合物的一些实施方式中，Ra彼此独立地选自由以下组成的组：叔丁氧羰基、9-芴基甲氧羰基、苄氧羰基和硝基-藜芦氧基羰基。
在式(I)或式(I’)的化合物、或式(III)或式(III’)的化合物的一些实施方式中，基团Rc表示-O-Rd，其中Rd为苄基。
在式(I)的化合物或式(III)或式(III’)的化合物的一些实施方式中，Re和Rf彼此独立地选自由以下组成的组：氢原子、(C1-C24)烷基、用一个或多个苯基取代的甲基、未经取代的(C6-C10)芳基或N-保护基团(例如叔丁氧羰基、9-芴基甲氧羰基、苄氧羰基和硝基-藜芦氧基羰基)。
在式(I)或式(I’)的化合物、或式(III)或式(III’)的化合物的一些实施方式中，基团Re和Rf中的一者、或基团Re和Rf两者代表苄基。
在式(I)或式(I’)的化合物、或式(II)或式(II’)的化合物的一些实施方式中，Ra是叔丁氧羰基。
离去基团Rg可以选自由以下组成的组：N-取代的氨基甲酸酯、五氟苯基羟基化物、琥珀酰亚胺基N-羟基化物、咪唑酸酯、苯并咪唑酸酯、苯并***N-羟基化物、氮杂苯并***N-羟基化物、嘧啶羟基化物、三嗪羟基化物、对硝基苯基羟基化物、肟酸酯(例如：
在一些实施方式中，活化的基团Rg由羟基琥珀酰亚胺基(在本文中也称为“OSu”)组成。
在一些实施方式中，式(I’)或式(II’)的化合物的Rb1基团和Rb3基团以及式(I’)或式(III’)的化合物的Rn1基团和Rn3基团的基团NH2、NH、COOH、CONH2、OH、SH被一个或多个相同或不同的N-保护基团或O-保护基团或S-保护基团保护。在这些实施方式的一些实施方式中，N-保护基团与基团Ra相同，在这种情况下，当期望时可以同时除去全部N-保护基团。在一些其他实施方式中，N-保护基团中的一者或多者与基团Ra不同或相同，在这种情况下，可以选择性地除去Ra和其他N-保护基团中的一者或多者。
在一些优选的实施方式中，在步骤a)以盐的形式提供式(III)或式(III’)的化合物。式(III)或式(III’)化合物的盐可以选自由以下组成的组：钠盐、钾盐、锂盐、盐酸盐、氢溴酸盐、乙酸盐、三氟乙酸盐、富马酸盐、烷基磺酸盐、芳基磺酸盐和二苯磺酰胺盐。实施例中公开了示例，即甘氨酸钠。
对可以在式(I)或式(I’)的化合物中包含的单体单元的数量(例如氨基酸残基的数量)没有严格的限制。本文的实施例举例说明了进行用于生成由二肽和三肽组成的式(I)或式(I’)的化合物的连续的合成方法。要指出的是，反应产率不随着所生产的式(Ⅰ)或式(Ⅰ’)化合物的长度而可检测到降低。
对于式(I)或式(I’)的化合物以及式(II)或式(II’)的化合物，m是1或更大的整数，其包括1至500的n个值、1至200的n个值、1至100的n个值、1至50的n个值、1至40的n个值、1至30的n个值、1至20的n个值和1至10的n个值。
对于式(I)或式(I’)的化合物以及式(III)或式(III’)的化合物，n是1或更大的整数，其包括1至500的n个值、1至200的n个值、1至100的n个值、1至50的n个值、1至40的n个值、1至30的n个值、1至20的n个值和1至10的n个值。
在一些实施方式中，m是具有选自由以下组成的组的值的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100。
在一些实施方式中，n是具有选自由以下组成的组的值的整数：1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99和100。
实施例举例说明了连续的合成方法的实施方式，其中m为1，n为1或2。
在本文所描述的连续的合成方法的一些实施方式中，尤其是在其中在步骤a)中添加以固体物料的形式的化合物(II)或化合物(II’)、化合物(III)或化合物(III’)和任选的碱的实施方式中，在步骤a)的开始还提供了液体添加剂，以使反应混合物流体化，从而促进挤出反应器内反应混合物的均质化，从而改善式(II)或式(II’)的化合物和式(III)或式(III’)的化合物和任选的碱之间的反应。
在步骤a)的开始添加的液体添加剂不以化学方式干扰化合物(II)或化合物(II’)与化合物(III)或化合物(III’)和任选的碱之间的化学反应，因此其在所述化学反应中表现为中性液体。
当在步骤a)中使用时，液体添加剂可以选自由以下组成的组：丙酮、水、乙醇、1-丙醇、2-丙醇、乙酸乙酯、乙酸异丙酯、甲醇、甲乙酮、1-丁醇、2-丁醇、叔丁醇、环己烷、戊烷、庚烷、己烷、甲苯、甲基环己烷、甲基叔丁基醚、二***、二异丙基醚、异辛烷、乙腈、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、二甲苯、二甲基亚砜、环丁砜、N-甲基吡咯烷酮、乙酸、乙二醇、二氯甲烷、二氯乙烷、氯仿、二甲基甲酰胺、吡啶、乙酸二甲酯、二噁烷、二甲氧基乙烷、甘油或任何其他降低反应混合物粘度的液体。液体添加剂也可以是上述两种或更多种液体的混合物。
在本文所描述的连续的合成方法的步骤a)的开始添加的液体添加剂的量可以由本领域技术人员容易地确定。适当量的液体添加剂应足以使反应混合物(通常是粉末反应混合物)充分流体化，从而形成反应混合物糊状物，当在挤出反应器装置中工作时，该糊状物将易于均质化。在本文的实施例中给出了适当量的液体添加剂的说明性实施方式。
在一些实施方式中，液体添加剂以0.05毫升/克固体至1.0毫升/克固体的量(例如0.08毫升/克至0.3毫升/克，或例如0.1毫升/克至0.2毫升/克)添加，该固体由(1)式(II)或式(II’)的化合物、(2)式(III)或式(III’)的化合物和(3)任选的碱(例如碳酸盐)组成。
应当理解，在步骤a)中使用的液体添加剂不由溶剂组成。
如本文所用，“溶剂”是完全溶解试剂并且不直接有助于化学反应的产品。说明性地，在本文所描述的连续的合成方法中使用的碱不是溶剂，而是反应物化合物，因为该碱产生化合物(III)或化合物(III’)的去质子化以促进其与化合物(II)的反应。
换句话说，所述液体添加剂不完全溶解在步骤a)中使用的试剂，因此不溶解式(II)或式(II’)的化合物、式(III)或式(III’)的化合物和碱(当其存在时)。
可以看出，液体添加剂的主要作用是降低仅包含式(II)或式(II’)的化合物、式(III)或式(III’)的化合物和碱(当其存在时)的反应混合物的粘度。
在本发明的另一方面，式(I)或式(I’)的化合物可以通过使两种化合物反应而获得，其中，两种反应物中的每一者包含多个氨基酸单元。说明性地，根据本发明的该另一方面，两个三肽可以一起反应以形成包含六个氨基酸单元的式(I)或式(I’)的化合物。
在本发明的又一方面，式(I)或式(I’)的化合物可以通过使三种化合物反应而获得，其中，两种反应物(即化合物(II)和化合物(III))中的每一者包含多个氨基酸单元，并且其中，第三反应物是碱。说明性地，根据本发明的该另一方面，两个三肽可以一起反应以形成包含六个氨基酸单元的式(I)或式(I’)的化合物。
在不以任何方式限于以下实施例的情况下进一步描述本发明。
实施例
实施例1：在受控温度下通过反应性挤出连续的且无溶剂的肽合成的一般方法
考虑到反应性挤出在肽合成中的应用，决定研究同向旋转双螺杆挤出机(MC15微混料机，
表1.温度、混合时间和螺杆转速对Boc-Trp-Gly-OMe的生产的影响。
[a]由HPLC测定的。[b]Boc-Trp-Gly-OMe以85％的产率生产，具有>99％的对映体过量值。
在对挤出物进行经典处理后，以85％的产率生产Boc-Trp-Gly-OMe，并完全保留对映体过量值(>99％ee；表1，条目5)。
实施例2：各种对映体纯的二肽和三肽的合成
然后将这些优化的反应条件应用于Boc-Trp-Phe-OMe的合成，Boc-Trp-Phe-OMe可以分离出61％的产率和>99％的非对映体过量值(表2，条目1)。令人高兴的是，Boc-Asp(OBzl)-OSu的反应性甚至更高于Boc-Trp-OSu，因为无需在挤出机中再循环反应混合物即可获得Boc-Asp(OBzl)-Phe-OMe。在挤出机筒中的1.5分钟停留时间足以使Boc-Asp(OBzl)-OSu完全转化，从而导致Boc-Asp(OBzl)-Phe-OMe的产率为92％，de(非对映体过量值)>99％(表2，条目2)。在通过无溶剂气态HCl处理去除Boc之后，将HCl.H-Trp-Gly-OMe和HCl.H-Trp-Phe-OMe与Boc-Asp(OBzl)-OSu在挤出机中反应。相应的Boc-Asp(OBzl)-Trp-Gly-OMe三肽和Boc-Asp(OBzl)-Trp-Phe-OMe三肽的分别以86％和89％的产率生产，纯度极好(分别为96％和94％；表2，条目3和条目4)。
表2.通过反应性挤出合成各种二肽和三肽。
[a]由HPLC测定的>99％的de。[b]反应混合物在没有再循环的情况下被挤出。停留时间为1.5分钟。[c]由HPLC测定的纯度。
实施例3：溶液中的肽合成与通过反应性挤出的肽合成的比较分析
为了比较反应性挤出工艺与球磨机和溶液中的合成的效率，计算了这些工艺中的每一者的时空产率(STY)。时空产率定义为每反应时间、每反应器体积的最终产物的量(以gcm3天-1表示)，因此是评估工艺强度的非常有用的工具。对于所比较的两种二肽，STY比球磨机合成和溶液合成的STY要高得多，特别是与溶液比较时，STY超过3个数量级(表3，条目1和条目3)。同时，与球磨机或溶液中的合成相比，产生的废物的量大大减少。尽管使用反应性挤出时E因子为0.9至1.2，但对于球磨机合成来说，该E因子始终更高，并且溶液中的E因子高出12倍至33倍(表3)。
表3.反应性挤出合成、球磨机合成和溶液合成的时空产率(STY)和E因子。
[a]以g cm3天-1表示的STY。
实施例4：Boc(L)-Trp-Gly-OMe(CAS 57769-48-9)的合成
将Boc-(L)-Trp-OSu(6.27g，15.617mmol，1.0当量)、NaHCO3(1.57g，18.740mmol，1.2当量)、HCl·H-Gly-OMe(2.16g，17.179mmol，1.1当量)和试剂级丙酮(1.5mL，η＝0.15μL/mg，1.3当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm，并且将输出阀转向再循环管。再循环10分钟后，打开阀门并回收褐色糊状物。在P2O5上减压干燥24小时后，将所得到的褐色固体(m＝6.64g，如果产率为100％，则包含m＝4.36g纯肽)溶于EtOAc(200mL)，并用1M HCl水溶液洗涤两次(2 x75mL)，并用1M NaOH水溶液洗涤两次(2 x 75mL)。将有机相在MgSO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到所期望的产物，为淡黄色固体(m＝3.72g，产率85％，STY：48.02g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝15.617 x 0.85 x 375.43＝5.0g
反应时间：10分钟＝6.94 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：5.00/(15 x 6.94 x 10-3)＝48.02g·cm-3·天-1
E-因子计算的细节
Boc-(L)-Trp-OSu：6.27g
HCl·H-Gly-OMe：2.16g
NaHCO3：1.57g
丙酮：1.5mL x 0.784g·mL-1＝1.18g
反应物的总量：6.27+2.16+1.57+1.18＝11.18g
E-因子＝(11.18/5.00)–1＝1.24
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm)8.32(s,1H),7.62(d,J＝7.8Hz,1H),7.35(d,J＝8.0Hz,1H),7.18–7.07(3H),6.40(t,J＝4.9Hz,1H),5.17(br s,1H),4.48(br s,1H),3.98–3.83(2H),3.67(s,3H),3.42–3.17(2H),1.41(s,9H)；13C(101MHz,CDCl3)δ(ppm)172.4,170.3,155.9,136.6,127.9,123.7,122.6,120.0,119.1,111.6,110.7,80.6,55.5,52.7,41.6,28.6；MS(ESI)：m/z＝398.2[M+Na]+
通过HPLC分析测定对映体过量值(Chiralpak IE，庚烷/乙醇：70/30)，流速＝1mL/min，T＝26℃，λ＝220.4nm和230.4nm，tr＝7.40min(D)和tr＝8.34min(L)，>99％ee。
实施例5：Boc-Trp-(L)-Phe-OMe(CAS 72156-62-8)的合成
将Boc-(L)-Trp-OSu(5.43g，13.523mmol，1.0当量)、NaHCO3(1.36g，16.228mmol，1.2当量)、HCl·H-(L)-Phe-OMe(3.21g，14.876mmol，1.1当量)和试剂级丙酮(1.5mL，η＝0.15μL/mg，1.5当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm，并且将输出阀转向再循环管。再循环10分钟后，打开阀门并回收白色糊状物。在P2O5上减压干燥24小时后，将所得到的白色固体(m＝4.96g，如果产率为100％，则包含m＝3.44g纯肽)溶于EtOAc(150mL)，并用1M HCl水溶液洗涤一次(50mL)，并用1M NaOH水溶液洗涤两次(2 x 70mL)。将有机相在MgSO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到所期望的产物，为白色固体(m＝2.11g，产率61％，STY：36.98g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝13.523 x 0.61 x 465.55＝3.85g
反应时间：10分钟＝6.94 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：3.85/(15 x 6.94 x 10-3)＝36.98g·cm-3·天-1
E-因子计算的细节
Boc-(L)-Trp-OSu：5.43g
HCl·H-(L)-Phe-OMe:3.21g
NaHCO3：1.36g
丙酮：1.5mL x 0.784g·mL-1＝1.18g
反应物的总量：5.43+3.21+1.36+1.18＝11.18g
肽的估计总质量：3.85g
E-因子＝(11.18/3.85)–1＝1.90
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm)8.21(s,1H),7.66(d,J＝7.7Hz,1H),7.35(d,J＝7.9Hz,1H),7.20–7.16(5H),7.13(s,1H),6.81(d,J＝6.0Hz,2H),6.24(br d,J＝7.1Hz,1H),5.13–5.04(1H),4.73(br d,J＝6.4Hz,1H),4.43(br s,1H),3.61(s,3H),3.41–3.28(1H),3.14(dd,J＝14.5,7.0Hz,1H),2.94(d,J＝5.8Hz,2H),1.42(s,9H)；13C(101MHz,CDCl3)δ(ppm)171.5,136.5,135.8,129.4,128.7,127.2,123.5,122.5,120.0,119.1,111.4,55.4,53.4,52.4,38.1,28.5,25.8；MS(ESI)：m/z＝488.2[M+Na]+
通过HPLC分析测定非对映体过量值(高分辨率RP-18e 50-4.6mm，H2O/0.1％TFA于CH3CN/0.1％TFA中：0–100％)，流速＝3mL/min，T＝26℃，λ＝214nm，tr＝2.81min(L,L)和tr＝2.90min(D,L)，>99％de。
实施例6：Boc-(L)-Asp(OBzl)-(L)-Phe-OMe(CAS 104413-52-7)的合成
将Boc-(L)-Asp(OBzl)-OSu(5.54g，13.185mmol，1.0当量)、NaHCO3(1.32g，15.822mmol，1.2当量)、HCl·H-(L)-Phe-OMe(3.13g，14.503mmol，1.1当量)和试剂级丙酮(1.5mL，η＝0.15μL/mg，1.5当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm。开始在挤出机中引入试剂后，开始有白色糊状物从挤出机中出来(停留时间：1分30秒)。在P2O5上减压干燥24小时后，将得到的白色固体(m＝5.60g，如果产率为100％，则包含m＝3.93g纯肽)悬浮在EtOAc(100mL)中，并用1M盐酸水溶液洗涤两次(2×30mL)。将有机相在MgSO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到所期望的产物，为白色粉末(m＝3.62g，产率92％，STY：376.51g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝13.185 x 0.92 x 484.55＝5.88g
反应时间：1.5分钟＝1.04 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：5.88/(15 x 1.04 x 10-3)＝376.51g·cm-3·天
E-因子计算的细节
Boc-(L)-Asp(OBzl)-OSu：5.54g
HCl·H-(L)-Phe-OMe：3.13g
NaHCO3：1.33g
丙酮：1.5mL x 0.784g·mL-1＝1.18g
反应物的总量：5.54+3.13+1.33+1.18＝11.18g
肽的估计总质量：5.88g
E-因子＝(11.18/5.88)–1＝0.90
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm)7.34–7.24(8H),7.13(d,J＝6.5Hz,2H),6.93(br d,J＝7.0Hz,1H)5.64(br d,J＝8.0Hz,1H),5.15(d,J＝12.3Hz,1H),5.10(d,J＝12.3Hz,1H),4.81(dd,J＝13.4Hz,5.9Hz,1H),4.53(br s,1H)3.68(s,3H),3.10–3.02(3H),2.70(dd,J＝17.2Hz,6.0Hz,1H),1.42(s,9H)；13C(101MHz,CDCl3)δ(ppm)171.9,171.5,170.5,155.5,135.8,135.5,129.4,128.7,128.5,128.4,127.2,80.6,67.0,53.6,52.4,50.6,37.9,36.1,28.3；MS(ESI)：m/z＝485.2[M+H]+
通过HPLC分析测定非对映体过量值(Chiralpak IC，庚烷/乙醇：90/10)，流速＝1mL/min，T＝26℃，λ＝210.4nm和220.4nm，tr＝14.06min(D,L)和tr＝15.79min(L,L)，>99％de。
实施例7：Boc-(L)-Asp(Bzl)-(L)-Trp-Gly-OMe的合成
将Boc-(L)-Asp(OBzl)-OSu(4.87g，11.572mmol，1.0当量)、NaHCO3(1.12g，13.889mmol，1.2当量)、HCl·H-(L)-Trp-(L)-Phe-OMe(3.97g，12.729mmol，1.1当量)和试剂级丙酮(1.5mL，η＝0.15μL/mg，1.8当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm，并且将输出阀转向再循环管。再循环10分钟后，打开阀门并回收褐色粘性糊状物。在P2O5上减压干燥24小时后，将所得到的褐色固体(m＝1.60g，如果产率为100％，则包含m＝1.17g纯肽)溶于EtOAc(50mL)，并用1MHCl水溶液洗涤两次(2 x 25mL)，并用1M NaOH水溶液洗涤两次(2 x 25mL)。将有机相在MgSO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到所期望的产物，为褐色固体(m＝1.00g，产率86％，STY：55.16g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝11.572 x 0.86 x 580.64＝5.75g
反应时间：10分钟＝6.94 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：5.75/(15 x 6.94 x 10-3)＝55.16g·cm-3·天-1
E-因子计算的细节
Boc-(L)-Trp-OSu：4.87g
HCl·H-Trp-Gly-OMe：3.97g
NaHCO3：1.12g
丙酮：1.5mL x 0.784g·mL-1＝1.18g
反应物的总量：4.87+3.97+1.12+1.18＝11.18g
E-因子＝(11.18/5.75)–1＝0.95
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm)8.31(s,1H),7.66(d,J＝7.5Hz,1H),7.35–7.11(10H),6.59(br s,1H),5.48(d,J＝7.3Hz,1H),5.09–5.04(2H),4.75(dd,J＝13.0,7.0Hz,1H),4.44(br d,J＝6.8Hz,1H),3.85(dd,J＝18.0,5.4Hz,1H),3.81(dd,J＝18.0,5.4Hz,1H),3.64(s,3H),3.38(dd,J＝14.5,4.9Hz,1H),3.18(dd,J＝14.7,7.0Hz,1H),2.97(dd,J＝16.7,4.5Hz,1H),2.77(dd,J＝17.1,5.9Hz,1H),1.35(s,9H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm)171.8,171.6,171.0,170.1,155.8,136.6,135.7,129.0,128.7,128.5,127.9,123.9,122.6,120.1,119.1,111.6,110.4,81.0,67.2,54.2,52.5,51.5,41.5,36.4,32.4,30.1,28.5,27.8；C30H37N4O8[M+H]+计算的HRMS：581.2611；发现的：581.2617
实施例8：Boc-(L)-Asp(Bzl)-(L)-Trp-(L)-Phe-OMe的合成
将Boc-(L)-Asp(OBzl)-OSu(4.36g，10.381mmol，1.0当量)、NaHCO3(1.05g，12.457mmol，1.2当量)、HCl·H-(L)-Trp-(L)-Phe-OMe(4.59g，11.419mmol，1.1当量)和试剂级丙酮(1.5mL，η＝0.15μL/mg，2.0当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm，并且将输出阀转向再循环管。再循环10分钟后，打开阀门并回收褐色粘性糊状物。在P2O5上减压干燥24小时后，将所得到的褐色固体(m＝1.65g，如果产率为100％，则包含m＝1.24g纯肽)溶于EtOAc(50mL)，并用1MHCl水溶液洗涤两次(2 x 25mL)，并用1M NaOH水溶液洗涤两次(2 x 25mL)。将有机相在MgSO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到所期望的产物，为淡黄色固体(m＝1.10g，产率89％，STY：59.52g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝10.381 x 0.89 x 670.76＝6.20g
反应时间：10分钟＝6.94 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：6.20/(15 x 6.94 x 10-3)＝59.52g·cm-3·天-1
E-因子计算的细节
Boc-(L)-Trp-OSu：4.36g
HCl·H-Trp-Phe-OMe：4.59g
NaHCO3：1.05g
丙酮：1.5mL x 0.784g·mL-1＝1.18g
反应物的总量：4.36+4.59+1.05+1.18＝11.18g
E-因子＝(11.18/6.20)–1＝0.80
1H NMR(300MHz,CDCl3)δ(ppm)8.18(s,1H),7.71(d,J＝7.7Hz,1H),7.33–6.84(15H),6.32(d,J＝6.9Hz,1H),5.54(d,J＝7.8Hz,1H),5.04(s,2H),4.70(br s,2H),4.47(br s,1H),3.60(s,3H),3.33(dd,J＝14.4,4.6Hz,1H),3.10(dd,J＝14.6,7.5Hz,1H),3.02–2.85(3H),2.75(dd,J＝17.1,6.0Hz,1H),1.41(s,9H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm)171.7,171.4,170.7,155.5,136.4,135.9,135.5,129.2,128.7,128.6,128.5,128.3,127.1,122.4,119.9,111.3,110.4,80.7,67.0,54.0,53.5,52.3,51.0,37.8,36.3,28.3,27.9；C37H43N4O8[M+H]+计算的HRMS：671.3081；发现的：671.3078
实施例9：Boc-(L)-Trp-Gly-OH的合成
将Boc-(L)-Trp-OSu(6.74g，16.792mmol，1.0当量)，H-Gly-ONa(3.26g，33.585mmol，2.0当量)和蒸馏水(1.5mL，η＝0.15μL/mg，5.0当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm，并且将输出阀转向再循环管。再循环3分钟后，打开阀门并回收白色糊状物。在P2O5上减压干燥24小时后，将得到的白色固体(m＝7.05g，如果产率为100％，则包含m＝4.03g纯肽)溶于蒸馏水(100mL)中，用1M盐酸水溶液酸化直至pH＝3。过滤得到的沉淀物，用去离子水洗涤两次，然后在P2O5上减压干燥，得到所期望的产物，为白色粉末(m＝3.71g，产率92％，STY：177.14g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝16.792 x 0.92 x 361.4＝5.58g
反应时间：3分钟＝2.1 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：5.58/(15 x 2.0 x 10-3)＝177.14g·cm-3·天
E-因子计算的细节
Boc-(L)-Trp-OSu：6.74g
H-Gly-ONa：3.26g
水：1.5mL x 1g·mL-1＝1.5g
反应物的总量：6.74+3.26+1.50＝11.50g
肽的估计总质量：5.58g
E-因子＝(11.50/5.58)–1＝1.06
1H NMR(300MHz,DMSO-d6)δ(ppm)10.79(s,1H),8.22(br s,1H),7.60(d,J＝7.6Hz,1H),7.32(d,J＝7.7Hz,1H),7.14(s,1H),7.06(t,J＝7.6Hz,1H),6.97(t,J＝7.1Hz,1H),6.76(d,J＝8.1Hz,1H),4.23(br s,1H),3.85–3.80(m,2H),3.12(d,J＝11.3Hz,1H),2.93–2.85(m,1H),1.30(s,9H)；13C NMR(101MHz,DMSO-d6)δ(ppm)172.7,171.5,155.2,136.0,127.7,124.2,121.1,118.7,118.4,111.5,110,6,77.9,55.0,28.4,28.1；MS(ESI)：m/z＝362.2[M+H]+
通过HPLC分析测定对映体过量值(Chiralpak ID-H，庚烷/乙醇+0.1％TFA：60/40)，流速＝1mL/min，T＝26℃，λ＝220.4nm和254.4nm，tr＝5.93min(D)和tr＝7.38min(L)，>99％ee。
实施例10：Boc-(L)-Trp-D-Phe-OMe[90983-25-8]的合成
将Boc-(L)-Trp-Osu(5.43g，13.5mmol)、NaHCO3(1.36g，16.2mmol，1.2当量)、HCl·H-(D)-Phe-OMe(3.21g，14.9mmol,1.1当量)和试剂级丙酮(1.5mL，η＝0.15μL/mg，1.5当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm，并且将输出阀转向再循环管。再循环10分钟后，打开阀门并回收白色糊状物。在P2O5上减压干燥24小时后，将得到的白色固体(m＝6.40g，如果产率为100％，则包含m＝4.44g纯肽)溶于EtOAc(50mL)，并用1M HCl水溶液洗涤(2 x 20mL)，并用1M NaOH水溶液(2 x 20mL)和盐水(1 x 20mL)洗涤。将有机相在MgSO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到2.99g的期望产物，为白色固体(产率为67％，E-因子：1.65，STY：40.51g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝4.22g
反应时间：10分钟＝6.94 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：40.51g·cm-3·天-1
E-因子计算的细节
终产物的量：4.22g
丙酮的质量：1.5mL x 0.784＝1.18g
试剂的总质量＝5.43+1.36+3.21+1.18＝11.18g
E-因子＝(11.18-4.22)/4.22＝1.65
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.04(s,1H),7.65(d,J＝7.8Hz,1H),7.36(d,J＝8.1Hz,1H),7.24–7.11(5H),6.96(d,J＝1.8Hz,1H),6.84–6.78(2H),6.23(d,J＝7.9Hz,1H),5.07(br s,1H),4.78(dd,J＝13.1,5.5Hz,1H),4.46(br s,1H),3.61(s,3H),3.28(dd,J＝11.2,5.6Hz,1H),3.16(dd,J＝14.3,7.4Hz,1H),2.95(dd,J＝13.8,5.5Hz,1H),2.79(dd,J＝13.3,4.7Hz,1H),1.40(s,9H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm)171.7,171.6,155.6,136.4,135.7,129.3,128.8,127.3,123.3,122.5,119.9,119.1,111.5,110.7,80.3,55.3,53.2,52.4,37.9,29.9,28.5；LCMS(ESI)：m/z＝488.2[M+Na]+；m.p.＝149–150℃。
实施例11：Boc-(L)-Trp-β-Ala-OMe的合成
将Boc-(L)-Trp-Osu(6.12g，15.25mmol)、NaHCO3(1.54g，18.3mmol，1.2当量)、HCl·H-β-Ala-OMe(2.34g，16.8mmol，1.1当量)和试剂级丙酮(1.5mL，η＝0.15μL/mg，1.3当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm，并且将输出阀转向再循环管。再循环10分钟后，打开阀门并回收白色糊状物。在P2O5上减压干燥24小时后，将得到的白色固体(m＝6.31g，如果产率为100％，则包含m＝4.18g纯肽)溶于EtOAc(50mL)，并用1M HCl水溶液洗涤(2 x 20mL)，并用1M NaOH水溶液(2 x 20mL)和盐水(1 x 20mL)洗涤。将有机相在MgSO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到期望的产物，为黄色固体(m＝3.74g，产率90％，E-因子：1.10，STY：51.04g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝5.32g
反应时间：10分钟＝6.94 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：51.04g·cm-3·天-1
E-因子计算的细节
终产物的量：5.32g
丙酮的质量：1.5mL x 0.784＝1.18g
试剂的总质量＝6.12+1.54+2.34+1.18＝11.18g
E-因子＝(11.18-5.32)/5.32＝1.10
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)8.50(s,1H),7.62(d,J＝7.9Hz,1H),7.33(d,J＝8.1Hz,1H),7.17(m,1H),7.10(m,1H),7.00(s,1H),6.26(br s,1H),5.22(br s,1H),4.38(br s,1H),3.56(s,3H),3.40(m,1H),3.34–3.22(2H),3.14(dd,J＝14.3,7.6Hz,1H),2.37–2.15(2H),1.42(s,9H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm)172.5,171.8,155.4,136.3,127.4,123.1,122.2,119.7,118.8,111.3,110.6,80.1,55.4,51.7,34.7,33.5,29.8,28.6,28.3；HRMS(ESI)：C20H27N3O5Na计算的＝412.1848[M+Na]+；发现的＝412.1859；m.p.＝48–49℃。
实施例12：Boc-Asp(OBzl)-D-Phe-OMe[1516893-20-1]的合成
将Boc-(L)-Asp(OBn)-Osu(5.54g，13.2mmol)、NaHCO3(1.33g，15.8mmol，1.2当量)、HCl·H-D-Phe-OMe(3.13g，14.5mmol，1.1当量)和试剂级丙酮(1.5mL，η＝0.15μL/mg，1.5当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm，并且将输出阀转向再循环管。再循环5分钟后，打开阀门并回收白色糊状物。在P2O5上减压干燥24小时后，将得到的白色固体(m＝5.60g，如果产率为100％，则包含m＝3.93g纯肽)溶于EtOAc(50mL)，并用1M HCl水溶液洗涤(2 x 20mL)，并用1M NaOH水溶液(2 x 20mL)和盐水(1 x 20mL)洗涤。将有机相在MgSO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到期望的产物，为白色固体(m＝3.45g，产率88％，E-因子：1.00，STY：107.58g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝5.60g
反应时间：5分钟＝3.47 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：107.58g·cm-3·天-1
E-因子计算的细节
终产物的量：5.60g
丙酮的质量：1.5mL x 0.784＝1.18g
试剂的总质量＝5.54+1.33+3.13+1.18＝11.18g
E-因子＝(11.18–5.60)/5.60＝1.00
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.38–7.31(5H),7.28–7.19(3H),7.11–7.07(2H),7.01(m,1H),5.64(br d,J＝8.0Hz,1H),5.12(d,J＝12.3Hz,1H),5.08(d,J＝12.3Hz,1H),4.83(m,1H),4.54(br s,1H),3.69(s,3H),3.15–2.92(3H),2.66(dd,J＝17.1,6.0Hz,1H),1.42(s,9H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm)171.5,170.4,155.5,135.8,135.5,129.3,128.6,128.4,128.3,127.1,80.5,66.9,53.4,52.3,50.5,38.0,36.1,28.3；LCMS(ESI)：m/z＝507.1[M+Na]+；m.p.＝72–73℃
实施例13：Boc-Asp(OBzl)-β-Ala-OMe的合成
将Boc-(L)-Asp(OBn)-OSu(6.23g，14.8mmol)、NaHCO3(1.49g，17.8mmol,1.2当量)、HCl·H-β-Ala-OMe(2.28g，16.3mmol，1.1当量)和试剂级丙酮(1.5mL，η＝0.15μL/mg，1.4当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm，并且将输出阀转向再循环管。再循环10分钟后，打开阀门并回收白色糊状物。在P2O5上减压干燥24小时后，将得到的白色固体(m＝7.35g，如果产率为100％，则包含m＝4.95g纯肽)溶于EtOAc(50mL)，并用1M HCl水溶液洗涤(2 x 20mL)，并用1M NaOH水溶液(2 x 20mL)和盐水(1 x 20mL)洗涤。将有机相在MgSO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到期望的产物，为黄色油状物(m＝3.77g，产率76％，E-因子：1.43，STY：44.25g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝4.61g
反应时间：10分钟＝6.94 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：44.25g·cm-3·天-1
E-因子计算的细节
终产物的量：4.61g
丙酮的质量：1.5mL x 0.784＝1.18g
试剂的总质量＝6.23+1.49+2.28+1.18＝11.18g
E-因子＝(11.18-4.61)/4.61＝1.43
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.37–7.29(5H),6.94(br s,1H),5.63(br d,J＝7.2Hz,1H),5.13(d,J＝12.3Hz,1H),5.09(d,J＝12.3Hz,1H),4.47(br s,1H),3.68(s,3H),3.50(dd,J＝6.2,6.1Hz,2H),3.04(dd,J＝17.1,4.3Hz,1H),2.71(dd,J＝17.1,5.9Hz,1H),2.50(t,J＝6.1Hz,2H),1.44(s,9H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm)172.7,171.7,170.8,155.6,135.5,128.7,128.5,128.3,80.6,66.9,51.9,50.8,36.3,35.1,33.8,28.4；HRMS(ESI)：C20H29N2O7计算的＝409.1975[M+H]+；发现的＝409.1978
实施例14：Fmoc-Leu-Phe-OMe1[827018-96-2]的合成
将Fmoc-(L)-Leu-OSu(5.71g，12.7mmol)、NaHCO3(1.28g，15.2mmol，1.2当量)、HCl·H-(L)-Phe-OMe(3.01g，13.95mmol，1.1当量)和试剂级丙酮(1.5mL，η＝0.15μL/mg，1.6当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm，并且将输出阀转向再循环管。再循环5分钟后，打开阀门并回收固体。在P2O5上减压干燥24小时后，将得到的白色固体(m＝2.41g，如果产率为100％，则包含m＝1.72g纯肽)溶于EtOAc(30mL)，并用1M HCl水溶液洗涤(2 x 15mL)，并用1M NaOH水溶液(2 x 15mL)和盐水(1 x 20mL)洗涤。将有机相在MgSO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到期望的产物，为白色固体(m＝1.38g，产率81％，E-因子：1.13，STY：100.93g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝5.26g
反应时间：5分钟＝3.47 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：100.93g·cm-3·天-1
E-因子计算的细节
终产物的量：5.26g
丙酮的质量：1.5mL x 0.784＝1.18g
试剂的总质量＝5.71+1.28+3.01+1.18＝11.18g
E-因子＝(11.18–5.26)/5.26＝1.13
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.77(d,J＝7.5Hz,2H),7.59(d,J＝7.1Hz,2H),7.41(t,J＝7.4Hz,2H),7.32(t,J＝7.2Hz,2H),7.24–7.18(3H),7.09–7.07(2H),6.40(br d,J＝7.0Hz,1H),5.14(d,J＝8.0Hz,1H),4.85(dd,J＝13.5,6.0Hz,1H),4.44–4.35(2H),4.23–4.19(2H),3.72(s,3H),3.18–3.05(2H),1.63–1.62(2H),1.51–1.47(m,1H),0.91(br s,6H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm)171.9,171.8,156.2,143.9,141.4,135.7,129.3,128.6,127.8,127.23,127.19,125.2,125.1,120.1,67.2,53.5,53.3,52.4,47.2,41.5,38.0,24.7,23.0,22.1；LCMS(ESI)：515.2[M+H]+；m.p.＝138–139℃(点火＝137–140℃)。1
实施例15：Fmoc-Leu-Val-OBn2[221174-11-4]的合成
将Fmoc-(L)-Leu-OSu(4.65g，10.3mmol)、NaHCO3(1.04g，12.4mmol，1.2当量)、TsOH·H-(L)-Val-OBn(4.31g，11.4mmol，1.1当量)和试剂级丙酮(1.5mL，η＝0.15μL/mg，2.0当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm，并且将输出阀转向再循环管。再循环10分钟后，打开阀门并回收白色粉末。在P2O5上减压干燥24小时后，将得到的白色固体(m＝2.65g，如果产率为100％，则包含m＝1.52g纯肽)溶于EtOAc(30mL)，并用1M HCl水溶液洗涤(2 x 15mL)，并用1M NaOH水溶液(2 x 15mL)和盐水(1 x 20mL)洗涤。将有机相在MgSO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到期望的产物，为白色固体(m＝1.13g，产率75％，E-因子：1.67，STY：40.08g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝4.18g
反应时间：10分钟＝6.94 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：40.08g·cm-3·天-1
E-因子计算的细节
终产物的量：4.18g
丙酮的质量：1.5mL x 0.784＝1.18g
试剂的总质量＝4.65+1.04+4.31+1.18＝11.18g
E-因子＝(11.18–4.18)/4.18＝1.67
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.76(d,J＝7.5Hz,2H),7.58(d,J＝7.3Hz,2H),7.42–7.24(9H),6.54(br d,J＝7.5Hz,1H),5.33(d,J＝7.8Hz,1H),5.20(d,J＝11.7Hz,1H),5.11(d,J＝11.7Hz,1H),4.59(dd,J＝8.8,4.8Hz,1H),4.46–4.33(2H),4.30–4.17(2H),2.19(m,1H),1.72–1.47(3H),1.00–0.74(12H)；13C NMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm)172.3,171.6,156.3,143.9,143.8,141.4,135.4,128.7,128.6,128.5,127.8,127.2,125.2,120.1,67.2,57.2,53.6,47.2,41.5,31.4,24.7,23.0,22.2,19.1,17.7；LCMS(ESI)：543.2[M+H]+
实施例16：Fmoc-Leu-Gly-OMe3[1316293-41-0]的合成
将Fmoc-(L)-Leu-OSu(6.53g，14.5mmol)、NaHCO3(1.46g，17.4mmol，1.2当量)、HCl·H-Gly-OMe(2.00g，16.0mmol，1.1当量)和试剂级丙酮(1.5mL，η＝0.15μL/mg，1.4当量)引入烧杯中，并用抹刀混合30秒。将该混合物缓慢倒入在40℃下加热的挤出机中，将螺杆转速设置为150rpm，并且将输出阀转向再循环管。再循环5分钟后，打开阀门并回收白色糊状物。在P2O5上减压干燥24小时后，将得到的白色固体(m＝3.76g，如果产率为100％，则包含m＝2.57g纯肽)溶于EtOAc(30mL)，并用1M HCl水溶液洗涤(2 x 15mL)，并用1M NaOH水溶液(2 x 15mL)和盐水(1 x 20mL)洗涤。将有机相在MgSO4上干燥，过滤并减压浓缩，得到期望的产物，为白色固体(m＝2.30g，产率90％，E-因子：1.02，STY：106.07g·cm-3·天-1)。
STY计算的细节
肽的估计总质量：n(限制性反应物)x产率x M(肽)＝5.52g
反应时间：5分钟＝3.47 x 10-3天
反应器体积：15mL
STY：106.07g·cm-3·天-1
E-因子计算的细节
终产物的量：5.52g
丙酮的质量：1.5mL x 0.784＝1.18g
试剂的总质量＝6.53+1.46+2.00+1.18＝11.18g
E-因子＝(11.18–5.52)/5.52＝1.02
1H NMR(400MHz,CDCl3)δ(ppm)7.76(d,J＝7.5Hz,2H),7.58(d,J＝7.3Hz,2H),7.39(t,J＝7.4Hz,2H),7.30(t,J＝7.4Hz,2H),6.58(br s,1H),5.26(d,J＝8.1Hz,1H),4.42(brs,2H),4.25–4.19(2H),4.03(br s,2H),3.73(s,3H),1.68–1.55(3H),0.94–0.86(6H)；13CNMR(101MHz,CDCl3)δ(ppm)172.7,170.2,156.4,143.9,143.8,141.4,127.8,127.2,125.1,120.1,67.1,53.5,52.5,47.3,41.4,41.3,24.8,23.0,22.0；LCMS(ESI)：425.1[M+H]+；m.p.＝113-118℃。
参考文献
1.M.L.Di Gioia,A.Leggio,A.Le Pera,A.Liguori,F.Perri和C.Siciliano,Eur.J.Org.Chem.,2004,2004,4437.
2.S.J.Tantry,R.V.R.Rao和V.V.S.Babu,ARKIVOC(Gainesville,FL,U.S.),2006,21.
3.K.Narita,K.Matsuhara,J.Itoh,Y.Akiyama,S.Dan,T.Yamori,A.Ito,M.Yoshida和T.Katoh,Eur.J.Med.Chem.,2016,121,592.
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