阅读说明：本技术 神经嵴来源的成体干细胞的应用 (Application of adult stem cells derived from neural crest ) 是由 吴祖泽 李时悦 杨月峰 陈焕杰 孟虹芳 罗钰龙 王�华 陈迪非 孙成峰 于 2020-08-06 设计创作，主要内容包括：本发明提供了一种神经嵴来源的成体干细胞的应用,所述应用为神经嵴来源的成体干细胞在制备抑制和/或治疗肺纤维化和/或改善肺功能的药物制剂中的应用,涉及细胞生物学技术领域。本发明采用牙髓干细胞对肺纤维化的大鼠进行治疗,结果显示牙髓干细胞可以抑制、逆转肺纤维化,改善肺功能且不会产生不良影响和副作用,具有良好的治疗效果。(The invention provides an application of adult stem cells derived from neural crest, which is an application of the adult stem cells derived from neural crest in preparing a pharmaceutical preparation for inhibiting and/or treating pulmonary fibrosis and/or improving pulmonary function, and relates to the technical field of cell biology. The dental pulp stem cells are used for treating rats with pulmonary fibrosis, and the results show that the dental pulp stem cells can inhibit and reverse pulmonary fibrosis, improve the lung function without generating adverse effects and side effects, and have good treatment effect.)

神经嵴来源的成体干细胞的应用

技术领域

本发明涉及细胞生物学技术领域，尤其是涉及一种神经嵴来源的成体干细胞在制备抑制和/或治疗肺纤维化和/或改善肺功能的药物制剂中的应用。

背景技术

在社会高速发展的同时，环境污染物、吸烟、病原体感染等因素也在悄然损伤人类肺脏健康，患有肺部疾病的人群逐年扩大，特发性肺纤维化、放射性肺纤维化、矽肺、老慢支(慢性支气管炎)、肺炎、肺损伤等已逐渐成为人类健康的主要威胁者。以上疾病的患者若因为肺部受到反复损伤刺激，肺泡结构严重破坏，成纤维细胞被持续激活并产生过多胶原纤维沉积于肺间质，最终往往发展为肺纤维化，从而损伤肺脏通气和/或气体弥散功能，导致患者表现为进行性加重的呼吸困难、呼吸衰竭，严重危害人类健康，甚至危及生命。虽然目前肺纤维化的病因和发病机制尚不明确，但主流观点认为，受损的肺泡上皮是引发纤维化的始动环节，而肺间质纤维化病灶的存在则是引起呼吸功能异常的直接因素。因此，肺纤维化的治疗重点在于，修复受损的肺泡上皮、抑制或逆转纤维化进展。然而，目前没有能同时达到这两个目的特效药物，新型抗纤维化药物(吡非尼酮和尼达尼布)可在一定程度上减缓患者用力肺活量的下降，但仍不能抑制或逆转肺纤维化的进展，对肺泡上皮的修复作用也十分有限；肺移植则因肺源供应紧张、适应症严格、术后免疫排斥等问题难以惠及更多患者。更不幸的是，肺纤维化患者的预后很差，大部分特发性肺纤维化患者被确诊后，中位生存时间仅4.5年，5年生存率仅30％～50％。可见，为患者寻求更行之有效的治疗方法刻不容缓。

发明内容

为了解决现有技术中所存在的问题，本发明的目的在于提供神经嵴来源的成体干细胞的应用，所述应用为神经嵴来源的成体干细胞在制备抑制和/或治疗肺纤维化和/或改善肺功能的药物制剂中的应用。

本发明是通过以下技术方案实现的：

本发明的第一目的在于提供神经嵴来源的成体干细胞在制备抑制或治疗肺纤维化和/或改善肺功能的药物制剂中的应用。

在一个实施方案中，所述神经嵴来源的成体干细胞包括背根神经节来源的神经嵴干细胞、皮肤来源的神经嵴干细胞或骨髓的神经嵴干细胞中的任一种。

在一个具体的实施方案中，所述神经嵴来源的成体干细胞来源于牙源干细胞，包括成人正畸牙齿来源牙髓干细胞、脱落乳牙牙髓干细胞、根尖牙***干细胞中的一种或多种。

牙髓干细胞是一种来源于神经嵴的有MSC特性的成体干细胞，于2000年被分离鉴定，有比骨髓干细胞更强的增殖能力和比脐带干细胞更强的抗炎症能力。牙髓干细胞分离自临床废弃的正畸牙，来源广、获得容易。本发明中的“牙髓干细胞”可以来自口腔中的任何牙齿，例如，乳牙、智齿等。

在具体的实施方案中，所述肺纤维化的症状包括成纤维细胞过度增殖、肺泡间隔增厚、胶原纤维沉积增加、TGF-β1表达升高或肺通气功能和气体弥散功能障碍中的一种或多种。

在具体的实施方案中，所述改善肺功能包括肺通气功能的改善或肺气体弥散功能的改善。

在具体的实施方案中，所述肺通气功能的改善包括FEV、PEF、PIF、RI、ERV、FRC指标中一种或多种的改善。

在具体的实施方案中，所述肺气体弥散功能的改善包括动脉血气分析指标SO2、PCO2中一种或多种的改善。

在本发明的实施方案中，所述“改善”指的是所涉及的指标与治疗前相比，或与同批次实验同剂量安慰剂治疗模型组相比，有向正常或好转方向的转变的趋势。

在具体的实施方案中，所述牙髓干细胞移植所需剂量为5×10⁶个细胞/kg。

在具体的实施方案中，所述牙髓干细胞的制备方法为从牙髓中分离培养牙髓间充质干细胞，进行表面标志检测和成骨、成脂肪诱导分化鉴定后得到牙髓间充质干细胞，制备为牙髓干细胞悬液。

在一个实施方案中，在获得牙髓干细胞后，还包括对所获得的干细胞进行细胞计数和细胞活性检测的步骤，保证采用的牙髓干细胞活性和长势良好，适用于临床应用。

本发明的另一目的在于提供一种抑制或治疗肺纤维化和/或改善肺功能的药物制剂，所述药物制剂包含治疗有效量的本发明所述的神经嵴来源的成体干细胞。

所述药物制剂没有特殊的形式限制，可以为固体、液体、凝胶、半流质、气雾等各种形式，优选喷雾剂。

在一个具体的实施方案中，所述药物制剂为通过气管内给药。

在另一些实施方案中，所述药物制剂可以根据剂型需要，包括一种或更多种可药用载体。

所述药物制剂主要针对的对象为哺乳动物，如啮齿类动物、灵长类动物等。

在一些实施方案中，本发明所述的牙髓干细胞可以与治疗有效量的其他用于抑制或治疗肺纤维化的药物同时施用或者依次先后施用。

在一个实施方式中，施用方式为向对象直接施用牙髓干细胞。

在一个实施方式中，施用方式为注射，优选为输注。

有益效果：

间充质干细胞(MSC)经静脉注射后首先归巢于肺中，这为MSC治疗肺部疾病提供了一个基础。MSC可以通过细胞间直接接触，分泌细胞因子、囊泡、外泌体等方式保护、修复损伤，抑制炎症反应；可以改善受损老化细胞中端粒的磨损、补充耗竭的干细胞、调节衰老相关分子、减轻氧化应激，改善细胞凋亡和衰老。

本发明尝试用这种有MSC特性的神经脊来源成体干细胞治疗肺病，以期达到抑制、逆转肺纤维化和改善肺功能的效果。发明人经过实验，发现神经脊来源的干细胞的新用途，即在肺部疾病中抑制、逆转肺纤维化和/或改善肺功能的新应用。

本发明通过实验证明，在动物模型中，牙髓干细胞可以明显抑制肺纤维化细胞中TGF-β1的水平；降低胶原纤维沉着，改善FEV、PEF、PIF、RI、ERV以及FRC等方面的肺功能指标；降低白蛋白含量，改善SO2和PCO₂水平，减轻肺纤维化的肺部病变，改善肺功能。

牙髓干细胞用于抑制、逆转肺纤维化的好处之一在于牙髓干细胞具有低免疫原性，适用的人群范围较广泛。本发明的神经脊来源的干细胞尤其是牙髓干细胞，可用于肺部疾病，包括特发性肺纤维化、放射性肺纤维化、矽肺、老慢支、肺炎、肺损伤等的预防和/或治疗。

附图说明

为了更清楚地说明本发明

具体实施方式

或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。本发明中使用的仪器和试剂、材料均是本领域技术人员公知的，可通过商业机构购买获得。

图1为本发明实施例肺纤维化大鼠经治疗后肺组织TGF-β1的含量测定；

图2为本发明实施例肺纤维化大鼠经治疗后肺组织切片masson染色分析；

图3为本发明实施例肺纤维化大鼠经治疗后肺功能检测结果；其中，FEV200：第200毫秒呼气容积；FEV300：第300毫秒呼气容积；FEV400：第400毫秒呼气容积；PIF：吸气峰值；Rl：气道阻力；ERV：补呼气量；FRC：功能残气量。

具体实施方式

下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

实施例

一、牙髓干细胞的分离鉴定

1.细胞来源

麻醉下无菌拔除人阻生第三磨牙或正畸需要拔除牙齿，牙齿劈冠后取牙髓组织，用PBS反复清洗，剪碎。

2.牙髓干细胞的分离和培养

将牙髓组织置于含3mg/ml I型胶原酶和4mg/ml Dispase溶液中，37℃水浴消化0.5-1小时，过70μm细胞筛收集细胞，1000rpm离心10min，用适量培养基重悬。接种于10cm培养皿中，在α-MEM培养基(含10％胎牛血清)中于37℃、5％CO₂培养，每3-5天换液一次。每天在倒置显微镜下观察细胞生长状况。1-2周后，用0.25％胰蛋白酶消化传代。得到牙髓干细胞，即牙源性干细胞。

3.牙髓干细胞免疫表型检测以及成脂成骨诱导分化鉴定

对牙髓干细胞进行免疫表型检测：以FITC或PE标记的CD73、CD90、CD105、CD11b、CD19、CD34、CD45、HLA-DR抗体及相应的同型对照抗体标记细胞，流式细胞仪检测。对牙髓干细胞进行成脂成骨诱导分化：成骨诱导3周后用茜素红染色进行鉴定；成脂诱导2周后用油红O(Oil Red O)染色进行鉴定。

4.结果

获得的牙髓干细胞成长梭形、铁壁、螺旋生长；高表达CD73、CD90及CD105，阳性细胞比例大于等于95.0％，不表达造血及免疫细胞表面标志CD11b、CD19、CD34、CD45，不表达移植免疫排斥相关的表面标志HLA-DR，不表达的标志阳性细胞比例小于等于2.0％；经成脂诱导后，油红O染色细胞内可见明显的脂肪滴形成；成骨诱导后，茜素红染色阳性。表明分离获得的细胞是牙髓干细胞。

二、大鼠纤肺维化模型构建

采用4％戊巴比妥钠(1.0mL/kg)腹腔注射将6-8周SD大鼠麻醉后，仰卧固定，无菌操作下颈中切口暴露气管，用注射器针头穿刺两软骨环间。假手术组给予等体积生理盐水，其余各组分别一次性快速推注博莱霉素1.0ml/kg(5mg/kg)注入气管。立即拔出针头，竖立鼠板，保持大鼠直立***，左右来回旋转1～2min，使药液尽可能到达两侧肺部，并均匀分布。

博莱霉素(BLM)是一种动物肺纤维化模型的诱导剂，可以伤害肺部、造成肺纤维化，经气管内给药博莱霉素，建立大鼠肺纤维化模型。

三、给药方法：

大鼠纤肺维化模型构建手术后一周，分组给药，每组7只：

假手术组：一次性注射生理盐水(0.4ml)。

模型组为模型对照组(模型)：一次性注射生理盐水(0.4ml)

阳性治疗组(吡非尼酮)：给予每天口服给药吡非尼酮1ml/100g，给药两周。

细胞治疗组(ADMSC、DPSC和UCMSC细胞治疗组)，ADMSC是指脂肪间充质干细胞、DPSC是指牙髓干细胞、UCMSC是指脐带间充质干细胞。ADMSC、DPSC和UCMSC细胞治疗组分别一次性注射各自细胞2×10⁶细胞/只(0.4ml)。

给药后，每天关注小鼠行为及体重变化，记录小鼠饮食、睡眠等行为变化，每天定时称量各组小鼠体重，并进行记录和统计。

给药两周后，所有实验大鼠均存活，生存率各组均为100％。对所有大鼠通过ELISA测定肺组织TGF-β1的含量、肺组织切片masson染色分析，测定肺功能、ELISA测肺泡冲洗液ALB含量、分析动脉血血气。

四、结果分析：

1.通过ELISA测定大鼠肺组织TGF-β1的含量

TGF-β1检测方法步骤为：

(1)在471ul试剂稀释液中，加入25ul标本。

(2)加10ul 1N HCl,盖紧，上下混匀。2－8℃放置60±2分钟。

(3)加10ul 1N NaOH,盖紧，上下混匀。(总体积500ul即20倍稀释)。

(4)从已平衡至室温的密封袋中取出试验所需板条。

(5)留空白孔(若使用双波长读板，空白孔可以不设)。

(6)分别将激活后的标本或不同浓度标准品(0pg/ml孔加试剂稀释液)加入相应孔中(100ul/孔)，用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育90分钟。

(7)提前30分钟制备生物素化抗体工作液。

(8)洗板5次。

(9)除空白孔外，加入生物素化抗体工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱孵育60分钟。

(10)提前30分钟制备酶结合物工作液。室温避光放置。

(11)洗板5次。

(12)除空白孔外，加入酶结合物工作液(100ul/孔)。用封板胶纸封住反应孔，37℃孵箱，避光孵育30分钟。

(13)洗板5次。

(14)加入显色底物(包括空白孔)100ul/孔，37℃孵箱，避光孵育10～15分钟。

(15)加入终止液(包括空白孔)100ul/孔，混匀后即刻测量OD450值(10分钟内)。

通过ELISA测定结果如图1所示，结果表明，与假手术组相比，模型对照组TGF-β1水平升高。与模型对照组相比，吡非尼酮、DPSC和ADMSC组显示出了降低TGF-β1的效果，其中阳性治疗吡非尼酮组和DPSC组降低的稍微多一些。TGF-β1是一种促纤维化因子，是参与肺纤维化进展的始动因素之一，可作为评估肺纤维化严重程度的指标，因此认为DPSC可以缓解肺纤维化严重程度。

2.大鼠肺部组织的Masson染色结果

在第21天(给药后14天)处死大鼠，取一侧肺组织，经Masson染色(Masson染色试剂盒)，染色结果如图2所示。

各组肺部组织的Masson染色显示：

假手术组中，未见明显病理性改变。

模型对照组中，肺泡间隔明显增厚，出现大量蓝色胶原纤维沉积。

四个治疗组中，吡非尼酮组肺泡间隔增厚有所改善，胶原纤维过度沉积改善不明显，三个细胞治疗组肺泡间隔增厚和胶原纤维过度沉积均有所改善，其中DPSC组的胶原纤维过度沉积改善最明显。表明DPSC可以降低肺部纤维化程度。

3.测定肺功能结果

通过肺功能检测仪测定大鼠肺功能指标，结果如图3显示，与假手术组相比，模型对照组出现一定程度的肺功能损害，FEV(用力呼气的最大呼气量)、PEF(深呼气后用力呼气的最大呼气流速)、PIF(峰值流量)下降和RI(气道阻力)、ERV(补呼吸量)、FRC(功能残气量)升高，各个治疗组与模型对照组相比，DPSC的改善程度最好，以上各指标均呈现出不同程度的改善，其次是UCMSC，最后是ADMSC和阳性药吡非尼酮。表明DPSC可以改善肺功能。

4.大鼠肺泡灌洗液ALB(白蛋白)检测

肺泡灌洗液步骤：将采集过血的大鼠固定好，将蝴蝶针一段***大鼠器官，另一端连接注射器，以生理盐水5mL冲洗肺泡，吸取3mL灌洗液，离心，上清液留存，酶免法测定ALB含量。

肺泡灌洗液ALB检测结果如表1所显示，与假手术组相比，模型组灌洗液中白蛋白ALB含量升高，各治疗组均出现不同程度的改善，其中DPSC的改善最显著，比阳性药比菲尼酮组的改善程度更优。表明DPSC可以改善炎症和肺部毛细血管损伤情况。

表1对肺泡灌洗液ALB的影响

^*p＜0.05，^**p＜0.01与模型组比较

5.动脉血血气分析结果

对各组大鼠在第21天(治疗后14天)，对腹主动脉抽取0.3ml血液，采用血气分析仪进行分析。动脉血血气分析结果如表2所显示，与假手术组相比，模型组SO2(血红蛋白被氧饱和的百分比)降低，各治疗组都有改善，其中DPSC改善最明显；与假手术组相比，模型组PCO2(血浆中溶解的二氧化碳单独产生的分压)升高，阳性药治疗比菲尼酮组没有改善，其它三个细胞治疗组均有改善，其中DPSC的改善最为显著。表明DPSC可以提高肺的呼吸功能。

表2对大鼠动脉血中sO2(％)，PCO2的影响

^*p＜0.05，^**p＜0.01与模型组比较

以上结果表明，本发明采用牙髓干细胞能够改善肺功能和抑制、逆转肺纤维化，不会产生不良影响和副作用，实现治疗目的。牙髓干细胞在修复肺部损伤、改善肺功能、抑制肺纤维化方面有重要的应用前景。

最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。