阅读说明：本技术 L-苹果酸的提取方法 (Method for extracting L-malic acid ) 是由 高莉 曹晓伟 曹琳青 崔凤霞 周俊俊 秦天苍 郭金权 张建国 史立军 陈黎 张抗 于 2020-08-24 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种L-苹果酸的提取方法,属于有机酸生物发酵下游提取技术领域。该L-苹果酸的提取方法,包括以下步骤：1)将L-苹果酸发酵液加草酸酸化,并过滤,滤液为L-苹果酸酸化液；2)将L-苹果酸酸化液通过TY019树脂分离除杂,得到L-苹果酸分离液；3)将步骤2)中的L-苹果酸分离液浓缩,并结晶,得到L-苹果酸湿品；4)将L-苹果酸湿品置于真空干燥箱,真空梯度烘干,得L-苹果酸成品。TY019树脂分离L-苹果酸酸化液,除杂效果好,分离液纯度高。与常规的L-苹果酸提取方法相比,本法所得L-苹果酸产品的收率和纯度都高,操作工艺大大简化,生产成本大幅降低。(The invention relates to an extraction method of L-malic acid, belonging to the technical field of biological fermentation downstream extraction of organic acid. The method for extracting the L-malic acid comprises the following steps: 1) adding oxalic acid into the L-malic acid fermentation liquor for acidification, and filtering to obtain a filtrate, namely an L-malic acid acidification liquor; 2) separating and removing impurities from the L-malic acid acidized solution through TY019 resin to obtain an L-malic acid separated solution; 3) concentrating and crystallizing the L-malic acid separation liquid obtained in the step 2) to obtain an L-malic acid wet product; 4) and (3) placing the wet L-malic acid product in a vacuum drying oven, and drying in a vacuum gradient manner to obtain a finished L-malic acid product. The TY019 resin is used for separating the L-malic acid acidized solution, the impurity removal effect is good, and the purity of the separated solution is high. Compared with the conventional L-malic acid extraction method, the method has the advantages of high yield and purity of the obtained L-malic acid product, greatly simplified operation process and greatly reduced production cost.)

L-苹果酸的提取方法

技术领域

本发明属于有机酸生物发酵下游提取技术领域，具体涉及一种L-苹果酸的提取方法。

背景技术

L-苹果酸作为性能优异的食品添加剂和功能性食品被广泛应用于食品、保健品、医疗和化妆品等领域。L-苹果酸一般作为酸味剂、pH调节剂、抗氧化增效剂，被广泛用于酒类、饮料、糖果、果酱及果冻、人造奶油、酱油、食醋、腌菜等多种食品中。L-苹果酸具有抗疲劳和保护肝、肾、心脏的作用，亦可用于保健品中、医药行业，如用于药物制剂、片剂、糖浆、氨基酸溶液、驱虫剂中，可治疗肝病、贫血、免疫力低下、***、高血压、肝衰竭等多种疾病，并能减轻抗癌药物对正常细胞的毒害作用。在日用化工及化妆品行业，L-苹果酸可以用于牙膏、洗发香波、高档特种洗涤剂、护肤品中等。在工业行业，L-苹果酸可以作为树脂固化剂、工业清洗剂、合成材料增塑剂。

L-苹果酸是生物体代谢过程中产生的重要有机酸，是三羧酸循环及其支路乙醛酸循环代谢过程中的重要中间产物，也是CO2固定反应的中间产物，其为生物体细胞内存在的一种活性物质，易于吸收，可以迅速通过细胞膜，进入线粒体内直接参与能量代谢，可以直接作为能量物质被机体利用。有研究显示，补充L-苹果酸可显著提高ATP生成。这也是一些西方发达国家青睐L-苹果酸的原因，如美国已经明确规定在婴幼儿食品、饮料、药品中不能使用DL-苹果酸而必须使用L-苹果酸。就食品对维持生命的作用来看，他实质上是参与一个新陈代谢和能量转化过程，蛋白质、脂类、糖类等最后都要经过三羧酸循环，这是转化过程的最后一步，也是最为重要的一步，他关系到人体生理机能是否正常。而L-苹果酸的保健功效就在于防止人体由于L-苹果酸的缺乏导致三羧酸循环不正常，导致代谢失调。正是由于L-苹果酸在物质代谢途径中所处的特殊位置，可直接参与人体代谢，被人体直接吸收，可实现短时间内向肌体提供能量，消除疲劳，所以它具有抗疲劳、迅速恢复体力的作用，可应用于功能性食品中。

L-苹果酸的生产方法有直接提取法、化学合成法、固定化酶或细胞转化法、一步发酵法和二步发酵法。近年来，随着大家对环保、绿色、纯天然的逐渐重视，发酵法日益盛行。现有技术中，申请公布号为CN103642853A的发明专利公开了一种L-苹果酸的提取新工艺，包括以下步骤：(1)苹果酸发酵液用磷酸进行酸化，调节pH为1.5，酸化后静置6h，经微滤膜和超滤膜过滤除去杂质得到L-苹果酸母液；将步骤(1)得到的L-苹果酸母液用碳酸钙中和至pH为4.1-4.4，过滤得到苹果酸钙；加1-3倍体积水将L-苹果酸钙调成浆状，加入磷酸，调节pH至1.5左右，酸解得到酸解液；过滤，对滤液进行脱色处理，得到L-苹果酸洗脱液；(3)将步骤(2)获得的L-苹果酸洗脱液，经离子交换树脂后，再经冷却式蒸发器低温浓缩至有白色晶体出现后，将料液迅速转入结晶器中，缓慢降温结晶；所述离子交换树脂为强酸型阳离子交换树脂、强碱性阴离子交换树脂，粒径为0.3-1.2mm；所述蒸发器的蒸发温度控制在50-60℃，蒸发量0.5-1.5m/h；降温结晶过程温度下降速度0.2-1℃/min，最终结晶温度0-20℃，恒温结晶0.5-1h；(4)产品分离洗涤干燥。其工艺过程可以简写为：L-苹果酸发酵液→一次酸化→中和→二次酸化→离子交换→蒸发浓缩→结晶→分离湿品→干燥，该提取方法较为复杂，所得L-苹果酸的收率和纯度不高，而成本较高，二次酸化和离子交换步骤水量消耗大，严重浪费水资源，同时中和及二次酸化步骤还会造成环境污染。

发明内容

本发明的目的是提供一种L-苹果酸的提取方法，以解决传统的提取方法工艺复杂、提取纯度低、收率低的问题。该提取方法不仅分离提纯效果好，而且工艺流程简单，便于操作，所得L-苹果酸的收率和纯度都较高。

为了实现以上目的，本发明采取的技术方案为：

L-苹果酸的提取方法，包括以下步骤：

1)酸化：将L-苹果酸发酵液加草酸酸化，并过滤，滤液为L-苹果酸酸化液；

2)除杂：将步骤1)中的L-苹果酸酸化液过分离树脂柱，得到L-苹果酸分离液；

3)浓缩结晶：将步骤2)中的L-苹果酸分离液浓缩，并结晶，得到L-苹果酸湿品；

4)梯度烘干：将L-苹果酸湿品真空梯度烘干，得到L-苹果酸成品。

进一步地，步骤1)中L-苹果酸发酵液加草酸酸化至pH＝1.5-3.0。

进一步地，步骤1)中将过滤得到的滤饼加水洗涤至pH＝5，以确保无L-苹果酸损失。

进一步地，步骤2)中的分离树脂柱为TY019分离树脂柱，TY019树脂是以EA、BA和TYH-SFLP-Buty1为原料合成的三元共聚物。

进一步地，步骤2)中过分离树脂柱时，分段收集分离液，第一段收集分离树脂柱空隙内的水，回收重复利用；第二段收集的是杂质溶液，弃去；第三段收集的是低纯度L-苹果酸溶液，储存待下次分离；第四段收集的是高纯度的L-苹果酸溶液，即为所述L-苹果酸分离液。

进一步地，步骤2)中浓缩是将L-苹果酸分离液浓缩至比重为1.2～1.5。

进一步地，步骤2)中浓缩是将L-苹果酸分离液在40℃～80℃的温度下减压浓缩。

进一步地，步骤3)中结晶是在30℃～60℃的温度下搅拌结晶，加入晶种，养晶1h，先以3℃/h的速度降温至20℃，然后再以5℃/h的速度梯度降温至0℃～10℃，真空抽滤或离心分离固液。

进一步地，步骤4)中所述梯度烘干是先对L-苹果酸湿品常温冷抽，至水分含量2％以下，然后再以8℃/h的速度梯度升温，最高至55℃，烘3-5h，过筛即得成品。

本发明的有益效果：

本发明的L-苹果酸的提取方法，用针对L-苹果酸酸化液特别研制的TY019树脂来分离除杂，该树脂是以EA、BA和TYH-SFLP-Buty1为原料合成的三元共聚物，并在树脂合成时引入了阴、阳离子单体进行接枝共聚，形成立体三维网状结构，可通过共聚物中离子基团的溶剂化作用与水分子结合,在表面形成致密的水化层,具有很好的吸附蛋白质的特性，同时树脂内的非离子型单体具有很好的吸盐效果，所以能很好的去除L-苹果酸酸化液中的蛋白质和盐类杂质，所以TY019树脂对发酵L-苹果酸酸化液的杂质去除率高，分离效果好，所得L-苹果酸分离液纯度高、收率高。

本发明的L-苹果酸的提取方法，用草酸酸化发酵液，较之常用的硫酸或磷酸酸化效果更好，酸化过滤后酸化液中的杂质更少，同时也可避免使用硫酸可能造成的碳化现象。

本发明的L-苹果酸的提取方法，与常规的L-苹果酸提取方法相比，本法所得L-苹果酸产品的收率和纯度都高，操作工艺大大简化，生产成本大幅降低。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例作进一步说明。

本发明的L-苹果酸发酵液，以米曲霉为生产菌株，以葡萄糖、碳酸钙为原料，在20-50℃下，培养基发酵40-160h，得到L-苹果酸发酵液20L。

实施例1

本实施例的L-苹果酸的提取方法，包括以下步骤：

1)酸化：L-苹果酸发酵液加草酸酸化，直至pH为2.0，真空过滤去除钙盐、菌丝体及发酵残渣，过滤得到的滤饼加去离子水洗涤至pH为5.0，以确保无苹果酸损失，得到L-苹果酸酸化液。

2)除杂：在35℃条件下，将L-苹果酸酸化液进TY019分离树脂柱，柱子流速为50mL/min，进料量为150g，分段收集分离液，第一段收集为色谱树脂空隙内的水，收集起来重复利用；第二段收集的是杂质溶液，弃去；第三段收集的是低纯度L-苹果酸溶液，先储存待下次分离；第四段收集的是高纯度的L-苹果酸溶液，即为L-苹果酸分离液。TY019树脂是以EA、BA和TYH-SFLP-Buty1为原料合成的三元共聚物。

3)浓缩结晶：将把L-苹果酸分离液在60℃的温度下减压浓缩至比重为1.35，在50℃的温度下搅拌30min，加入晶种，养晶1h，先以3℃/h的速度降温至20℃，然后再以5℃/h的速度梯度降温至10℃，离心分离固液，得L-苹果酸湿品。

4)烘干：将L-苹果酸湿品置于真空干燥箱，先用泵常温冷抽1h，至水分含量在2％以下，后以8℃/h的速度梯度升温，最高升温至55℃，真空烘3h，得L-苹果酸成品，测纯度为99.8％。

实施例2

本实施例的L-苹果酸的提取方法，包括以下步骤：

1)酸化：L-苹果酸发酵液加草酸酸化，直至pH为1.8，真空过滤去除钙盐、菌丝体及发酵残渣，过滤得到的滤饼加去离子水洗涤至pH为5.0，以确保无苹果酸损失，得到L-苹果酸酸化液。

2)除杂：在35℃条件下，将L-苹果酸酸化液进TY019分离树脂柱，柱子流速为80mL/min，进料量为100g，分段收集分离液，第一段收集为色谱树脂空隙内的水，收集起来重复利用；第二段收集的是杂质溶液，弃去；第三段收集的是低纯度L-苹果酸溶液，先储存待下次分离；第四段收集的是高纯度的L-苹果酸溶液，即为L-苹果酸分离液。TY019树脂是以EA、BA和TYH-SFLP-Buty1为原料合成的三元共聚物。

3)浓缩结晶：将把L-苹果酸分离液在50℃的温度下减压浓缩至比重为1.2，在40℃的温度下搅拌30min，加入晶种，养晶1h，先以3℃/h的速度降温至20℃，然后再以5℃/h的速度梯度降温至5℃，离心分离固液，得L-苹果酸湿品。

4)烘干：将L-苹果酸湿品置于真空干燥箱，先用泵常温冷抽1h，至水分含量在2％以下，后以8℃/h的速度梯度升温，最高升温至55℃，真空烘5h，得L-苹果酸成品，测纯度为99.8％。

实施例3

本实施例的L-苹果酸的提取方法，包括以下步骤：

1)酸化：L-苹果酸发酵液加草酸酸化，直至pH为2.5，真空过滤去除钙盐、菌丝体及发酵残渣，过滤得到的滤饼加去离子水洗涤至pH为5.0，以确保无苹果酸损失，得到L-苹果酸酸化液。

2)除杂：在45℃条件下，将L-苹果酸酸化液进TY019分离树脂柱，柱子流速为25mL/min，进料量为200g，分段收集分离液，第一段收集为色谱树脂空隙内的水，收集起来重复利用；第二段收集的是杂质溶液，弃去；第三段收集的是低纯度L-苹果酸溶液，先储存待下次分离；第四段收集的是高纯度的L-苹果酸溶液，即为L-苹果酸分离液。TY019树脂是以EA、BA和TYH-SFLP-Buty1为原料合成的三元共聚物。

3)浓缩结晶：将把L-苹果酸分离液在70℃的温度下减压浓缩至比重为1.4，在30℃的温度下搅拌30min，加入晶种，养晶1h，先以3℃/h的速度降温至20℃，然后再以5℃/h的速度梯度降温至8℃，真空抽滤分离固液，得L-苹果酸湿品。

4)烘干：将L-苹果酸湿品置于真空干燥箱，先用泵常温冷抽1h，至水分含量在2％以下，后以8℃/h的速度梯度升温，最高升温至55℃，真空烘3h，得L-苹果酸成品，测纯度为99.9％。

实施例4

本实施例的L-苹果酸的提取方法，包括以下步骤：

1)酸化：L-苹果酸发酵液加草酸酸化，直至pH为3.0，真空过滤去除钙盐、菌丝体及发酵残渣，过滤得到的滤饼加去离子水洗涤至pH为5.0，以确保无苹果酸损失，得到L-苹果酸酸化液。

2)除杂：在25℃条件下，将L-苹果酸酸化液进TY019分离树脂柱，柱子流速为60mL/min，进料量为200g，分段收集分离液，第一段收集为色谱树脂空隙内的水，收集起来重复利用；第二段收集的是杂质溶液，弃去；第三段收集的是低纯度L-苹果酸溶液，先储存待下次分离；第四段收集的是高纯度的L-苹果酸溶液，即为L-苹果酸分离液。TY019树脂是以EA、BA和TYH-SFLP-Buty1为原料合成的三元共聚物。

3)浓缩结晶：将把L-苹果酸分离液在80℃的温度下减压浓缩至比重为1.5，在60℃的温度下搅拌30min，加入晶种，养晶1h，先以3℃/h的速度降温至20℃，然后再以5℃/h的速度梯度降温至6℃，离心分离固液，得L-苹果酸湿品。

4)烘干：将L-苹果酸湿品置于真空干燥箱，先用泵常温冷抽1h，至水分含量在2％以下，后以8℃/h的速度梯度升温，最高升温至55℃，真空烘4h，得L-苹果酸成品，测纯度为99.8％。

实施例5

本实施例的L-苹果酸的提取方法，包括以下步骤：

1)酸化：L-苹果酸发酵液加草酸酸化，直至pH为1.5，真空过滤去除钙盐、菌丝体及发酵残渣，过滤得到的滤饼加去离子水洗涤至pH为5.0，以确保无苹果酸损失，得到L-苹果酸酸化液。

2)除杂：在35℃条件下，将L-苹果酸酸化液进TY019分离树脂柱，柱子流速为50mL/min，进料量为100g，分段收集分离液，第一段收集为色谱树脂空隙内的水，收集起来重复利用；第二段收集的是杂质溶液，弃去；第三段收集的是低纯度L-苹果酸溶液，先储存待下次分离；第四段收集的是高纯度的L-苹果酸溶液，即为L-苹果酸分离液。TY019树脂是以EA、BA和TYH-SFLP-Buty1为原料合成的三元共聚物。

3)浓缩结晶：将把L-苹果酸分离液在40℃的温度下减压浓缩至比重为1.3，在50℃的温度下搅拌30min，加入晶种，养晶1h，先以3℃/h的速度降温至20℃，然后再以5℃/h的速度梯度降温至2℃，离心分离固液，得L-苹果酸湿品。

4)烘干：将L-苹果酸湿品置于真空干燥箱，先用泵常温冷抽1h，至水分含量在2％以下，后以8℃/h的速度梯度升温，最高升温至55℃，真空烘3h，得L-苹果酸成品，测纯度为99.7％。

对比例1

将分离树脂柱替换为DTF-02色谱分离用树脂，其他条件与实施例1保持一致。

对比例2

将分离树脂柱替换为LX-T83SS氢型色分树脂，其他条件与实施例1保持一致。

对比例3

将分离树脂柱替换为312弱碱性阴树脂，其他条件与实施例1保持一致。

用高效液相色谱法测定实施例1与对比例1-3的收集得到的L-苹果酸的含量，并由L-苹果酸的含量于酸度计算得到L-苹果酸的纯度，进一步计算得到L-苹果酸的收率。结果如表1所示。

表1实施例1与对比例1-3得到的L-苹果酸纯度以及收率

由表1可见，TY-019型号树脂在所得的L-苹果酸，合格料的纯度能达到98％以上，且收率也较其他树脂高。