一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法
阅读说明：本技术 一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法 (Method for creating new interspecific allopolyploid germplasm of tobacco by utilizing horizontal genome transfer ) 是由 张光海 陈学军 李永平 高玉龙 焦芳婵 吴兴富 冯智宇 许美玲 孔光辉 吴玉萍 于 2021-07-16 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法,属于烟草的多倍体育种技术领域,包括无菌苗培育、离体嫁接、嫁接结合部位愈伤诱导、不定芽诱导和生根培养、再生植株移栽、再生植株表型筛选鉴定和倍性鉴定等步骤。本发明采用红花栽培烟草与黄花烟草作为嫁接亲本材料,利用试管离体嫁接技术实现烟草基因组水平转移；利用人工组织培养技术,实现两个嫁接亲本的嫁接接合愈伤组织诱导及无性株系再生,克服了两种近缘烟草种间有性育种障碍,并形成可育的烟草异源多倍体植株。(The invention discloses a method for creating a new interspecific allopolyploid germplasm of tobacco by utilizing horizontal genome transfer, belonging to the technical field of polyploid breeding of tobacco. The invention adopts safflower cultivated tobacco and yellow flower tobacco as grafting parent materials, and realizes the horizontal transfer of tobacco genome by using the test tube in vitro grafting technology; the artificial tissue culture technology is utilized to realize the induction of grafting and jointing calluses and the regeneration of asexual strains of two grafting parents, overcome the sexual breeding obstacle between two kindred tobacco seeds and form fertile tobacco allopolyploid plants.)
技术领域
本发明涉及烟草的多倍体育种
技术领域
，更具体地说，涉及一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法。背景技术
异源多倍体是来自两个不同物种的基因组的组合，是物种进化主要来源，许多现代作物植物的优异性状是通过异源多倍体化途径获得，如普通烟草的形成就是林烟草与绒毛状烟草杂交后，经染色体自然加倍形成的异源四倍体。越来越多的研究发现，不同物种的细胞紧密接合时会诱发遗传物质的水平转移，即受体生物通过无性方式从供体生物获得遗传物质的过程，有别于世代繁衍过程中的有性传递方式。水平基因转移又称横向基因转移，新基因对物种的起源、演化及对环境的适应性具有重要作用，而水平基因转移作为物种引入新基因的一条重要途径，水平基因转移能跨越种间隔离，在亲缘关系远或近的生物有机体间都可以进行遗传信息转移。可以使受体生物绕过点突变和重组快速形成新物种，加速基因组的革新和进化，提高生物遗传多样性。砧木和接穗在愈伤组织、细胞壁、维管组织的重建过程中伴随着遗传物质在细胞间的转移。植物间的嫁接可以导致DNA片段或者整个质体基因组的交流。嫁接接合部位通过离体培养诱导愈伤组织产生的不定芽则被称之为嫁接嵌合体；嵌合体诱导技术能够克服远缘或近缘间植物有性育种障碍，并形成可育的异源多倍体。异源多倍体可以通过无性机制发生，嫁接可作为一种创制新异源多倍体的快速方法。
目前，由于烟草育种长期选用较单一的栽培品种作为亲本进行品种间杂交选育新品种，导致国内栽培烟草种质间亲缘关系较近、遗传基础狭窄、遗传多样性较低，是目前烟草育种面临的突出问题。烟草远缘杂交是实现将野生烟草中显性抗病虫基因直接转移到普通栽培烟草的有效途径。因此，拓宽和丰富烟草栽培种的遗传基础，发掘烟草属野生种的遗传潜力，创制携带有优良基因的骨干亲本材料是烟草育种亟待解决的问题。然而，烟草种间普遍存在生殖隔离，如普通红花烟草和黄花烟草，普通红花烟草与大部分野生烟草均存在严重的生殖隔离。因此，如何有效克服普通红花烟草与黄花烟草或野生烟草的有性杂交不亲和是目前烟草远缘杂交育种亟需解决的技术问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，本发明采用红花栽培烟草与黄花烟草作为嫁接亲本材料，利用试管离体嫁接技术实现烟草基因组水平转移；利用人工组织培养技术，实现两个嫁接亲本的嫁接接合愈伤组织诱导及无性株系再生；克服两种近缘烟草种间有性育种障碍，并形成可育的异源多倍体。
为解决上述问题，本发明采用如下的技术方案：
一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，该方法包括如下步骤：
(1)无菌苗培育：在组培室中将红花烟草种子和黄花烟草种子预处理后分别播种于含固体培养基的培养皿中，培养两周后将生长至小十字期的幼苗移植至含有固体培养基的培养瓶中，把培养瓶放入组培室中每天光照培养16小时，每天黑暗培养8小时，待红花烟草植株和黄花烟草幼苗植株生长至株高5-10cm后作为嫁接亲本；
(2)离体嫁接：将步骤(1)中得到的嫁接亲本进行交互嫁接得到嫁接体，将得到的嫁接体置于MS培养基中培养2-4周至嫁接结合部位融合完好，得到结合部位具有维管组织的接穗植株，所述接穗植株可正常生长；
(3)嫁接结合部位愈伤诱导：切下步骤(2)中得到的接穗植株上的嫁接结合部位，用刀片将嫁接紧密结合部位横切成多块薄片，将每块薄片分别平放于含有愈伤固体培养基的培养瓶中培养25d，进行愈伤组织诱导，得到多块愈伤组织块；
(4)不定芽诱导和生根培养：将步骤(3)中得到的多块愈伤组织块分别转移至含MS培养基的培养瓶中诱导愈伤组织块产生不定芽，将形成的不定芽分别移植至含固体培养基的培养瓶中进行培养，得到再生植株；重复上述步骤，直至不再产生不定芽；
(5)再生植株移栽：用蒸馏水将步骤(4)中得到的再生植株的根部培养基冲洗干净，移栽至装有灭菌基质的营养钵中炼苗，炼苗25-30天后移栽至温室的花盆中，按常规烟草进行管理栽培，得到再生植株；
(6)再生植株的表型筛选：将步骤(5)中得到的再生植株进行表型筛选，筛选出具有种间异源多倍体特性的植株；
(7)倍性鉴定：鉴定步骤(6)中得到的具有种间异源多倍体特性的植株的倍性，筛选多倍体，即得到多株烟草种间异源多倍体新种质植株。
由于采用上述方法，采用红花栽培烟草与黄花烟草作为嫁接亲本材料，而两者有性杂交不亲和，无法获得杂交后代，本发明通过利用试管离体嫁接技术实现烟草基因组水平转移；利用人工组织培养技术，实现两个嫁接亲本的嫁接接合愈伤组织诱导及无性株系再生，克服了两种近缘烟草种间有性育种障碍，并形成多株可育的烟草异源多倍体植株。本发明形成的可育的烟草异源多倍体植株高大，茎秆粗壮，叶片肥大且颜色深，果实和种子大。
优选地，所述步骤(1)中的预处理为用次氯酸钠溶液进行消毒预处理后用无菌水清洗3次；所述光照培养的光照强度为50μEm-2 S-1，光照培养的温度为24℃，所述黑暗培养的温度为22℃；
由于采用上述方法，通过对烟草种子进行预处理后并进行清洗，有效提高了种子的萌发率；通过在特定的光照强度和温度下进行培养，便于获得健康茁壮的烟草育苗，光照强度的强弱和温度的高低都会影响烟草幼苗的株高。
优选地，所述步骤(1)和步骤(4)中的固体培养基的组成为：4.74g/L MS、30g/L蔗糖、6g/L琼脂和蒸馏水，固体培养基的pH为5.8。
由于采用上述方法，通过选取上述培养基，能较好的促进烟草幼苗茎及再生植株的伸长和生长，该固体培养基的组成及成分或多或少都将会影响幼苗及植株的生长。
优选地，所述步骤(3)中的愈伤固体培养基的组成为：4.74g/L MS、5mg/L KT、0.2mg/L NAA、30g/L蔗糖、6g/L琼脂，愈伤固体培养基的pH为5.8。
由于采用上述方法，通过选取上述特定的愈伤固体培养基，能保证烟草组织生产所需的矿物营养，诱导细胞的分裂，有利于根的形成，抑制茎叶的分化，还能加速诱导愈伤组织的快速生长；上述愈伤固体培养基的组成及成分或多或少，将影响愈伤组织是否能进行较好的进行愈伤组织诱导。
优选地，所述步骤(2)中的交互嫁接方法为：选取红花烟草幼苗植株作为接穗植株，留取接穗植株顶上的2片小叶，去除其余叶片，将接穗植株沿茎两侧对称斜切45°后成楔形状接口；选取黄花烟草幼苗植株作为砧木植株，留取砧木植株根系以上3cm的茎段，其余剪去，用双面刀片从留取的茎中部劈开与接穗植株楔形状接口相配合的接口；将接穗植株楔形端插入砧木植株接口，用塑料套管将接口进行固定完成交互嫁接。
优选地，所述步骤(2)中的交互嫁接方法为：选取黄花烟草幼苗植株作为接穗植株，留取接穗植株顶上的2片小叶，去除其余叶片，将接穗植株沿茎两侧对称斜切45°后成楔形状接口；选取红花烟草幼苗植株作为砧木植株，留取砧木植株根系以上3cm的茎段，其余剪去，用双面刀片从留取的茎中部劈开与接穗植株楔形状接口相配合的接口；将接穗植株楔形端插入砧木植株接口，用塑料套管将接口进行固定完成交互嫁接。
由于采用上述方法，红花烟草和黄花烟草两个嫁接亲本之间可相互作为接穗或砧木进行交互嫁接，将嫁接接合愈伤组织诱导及无性株系再生，克服了两种近缘烟草种间有性育种障碍，并形成多株可育的烟草异源多倍体植株。
优选地，所述嫁接紧密结合部位切成的薄片厚度为1-2mm。
相比于现有技术，本发明的优点在于：
(1)本发明首次利用试管离体嫁接技术实现栽培烟草和野生烟草的基因组水平转移，证明了试管离体嫁接技术是一种克服远缘杂交不亲和的有效方法，该方法可应用于其他易于嫁接和组织培养的园艺作物的种质创制与品种选育。
(2)本发明采用红花栽培烟草与黄花烟草作为嫁接亲本材料，利用试管离体嫁接技术实现烟草基因组水平转移；利用人工组织培养技术，实现两个嫁接亲本的嫁接接合愈伤组织诱导及无性株系再生，克服了两种近缘烟草种间有性杂交障碍，并获得多株可育的烟草异源多倍体植株。
(3)本发明实用性强，操作简单易行，节省获得异源多倍体的时间，可以广泛应用于烟草种间有性杂交不亲和的烟草远缘杂交育种，本发明获得的异源多倍体材料不含任何转基因成分，可直接应用品种选育。
(4)本发明有效解决目前野生烟草资源发掘利用不足和普通烟草遗传基础狭窄的问题，创新了烟草种质资源库，对烟草育种方法创新具有指导作用。
附图说明
图1为本发明离体嫁接植株图；
图2为本发明嫁接结合部位诱导出的愈伤组织图；
图3为本发明嫁接亲本红花烟草云烟87、黄花烟草G391及异源多倍体GY7的植株形态学特征图；
图4为本发明嫁接亲本及异源多倍体植株DNA相对含量分析图；
具体实施方式
以下实施例是对本发明的进一步说明，不是对本发明的限制。
实施例1：
一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，该方法包括如下步骤：
由于红花烟草(云烟87)和黄花烟草(G391)两者有性杂交不亲和，无法获得杂交后代，因此选取普通栽培红花烟草(云烟87)和黄花烟草(G391)为两个嫁接亲本，红花烟草(云烟87)幼苗植株作为接穗植株，黄花烟草(G391)幼苗植株作为砧木植株。
(1)无菌苗培育
在组培室中将将红花烟草种子(云烟87)和黄花烟草种子(G391)用次氯酸钠溶液进行表面消毒,然后用无菌水重复清洗3次，分别播种于含固体培养基的培养皿中，培养两周后将生长至小十字期的幼苗移植至含有固体培养基的培养瓶中，把培养瓶放入组培室中每天光照培养16小时，每天黑暗培养8小时，待红花烟草植株和黄花烟草幼苗植株生长至株高10cm后作为嫁接亲本进行后续试验；上述固体培养基的组成为：4.74g/L MS、30g/L蔗糖、6g/L琼脂和蒸馏水，固体培养基的pH为5.8；上述光照培养的光照强度为50μEm-2S-1，光照培养的温度为24℃，黑暗培养的温度为22℃。
2)离体嫁接：
将步骤(1)中得到的嫁接亲本进行交互嫁接得到嫁接体，将得到的嫁接体置于MS培养基中培养2-4周至嫁接结合部位融合完好，得到可正常生长的接穗植株。选择茎围相近的烟草无菌苗作为嫁接亲本，将红花烟草幼苗植株作为接穗植株，留取接穗植株顶上的2片小叶，去除其余叶片，茎秆长度约3cm，将接穗植株沿茎两侧对称斜切45°后成楔形状接口；选取黄花烟草幼苗植株作为砧木植株，留取砧木植株根系以上3cm的茎段，其余剪去；用双面刀片从茎中部劈开5mm的接口；将接穗楔形端插入砧木接口，使形成层相吻合后，分别将两个嫁接亲本的茎秆斜切大约45°，然后连接起来，使其形成层吻合，并用塑料套管进行固定完成交互嫁接(如图1所示)；将处理好的嫁接体于MS培养基中培养2-4周，直至嫁接结合部位融合完好，在此期间，每周及时剪除砧木上长出的腋芽；离体嫁接成活的标志是砧木和接穗结合部位形成有功能的维管组织，接穗植株正常生长。所用固体培养基为4.74g/L MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，其余为蒸馏水，pH为5.8。
(3)嫁接结合部位愈伤诱导：切下步骤(2)中得到的接穗植株上的嫁接结合部位，用刀片将嫁接紧密结合部位横切成多块薄片，将每块薄片分别平放于含有愈伤固体培养基的培养瓶中培养25d，进行愈伤组织诱导，得到多块愈伤组织块。选择嫁接成活较好的嫁接体，切下嫁接结合部位，切去两端未黏连的部分，只保留两个嫁接亲本紧密结合的部分，用刀片将结合部位横切成薄片，厚度约为1mm)，一个嫁接部位一般可以切成4片左右，然后嫁接结合部位薄片平放于含有固体培养基的培养瓶中培养约25d，进行愈伤组织诱导(如图2所示)。
(4)不定芽诱导和生根培养：将步骤(3)中得到的多块愈伤组织块分别转移至含MS培养基的培养瓶中诱导愈伤组织块产生不定芽，将形成的不定芽分别移植至含固体培养基的培养瓶中进行培养，得到再生植株；在此过程中，愈伤组织会不断产生不定芽，需持续移植直到不再有不定芽产生；所用固体培养基为4.74g/L MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，其余为蒸馏水，pH为5.8。
(5)再生植株移栽：用蒸馏水将步骤(4)中得到的再生植株的根部培养基冲洗干净，移栽至装有灭菌基质的营养钵中炼苗，炼苗25-30天后移栽至温室的花盆中，按常规烟草进行管理栽培，得到再生植株；
(6)再生植株的表型筛选：将步骤(5)中得到的再生植株进行表型筛选，筛选出具有种间异源多倍体特性的植株；
异源多倍体特性的植株外部形态表现为植株高大，茎秆粗壮，叶片变大，叶片颜色加深，果实和种子比较大。根据无性再生植株与两个嫁接亲本的表型性状间的差异，调查表型性状后初步筛选出可能为种间异源多倍体的株系。观察雌蕊和雄蕊的形态结构和花粉萌发测定，通过自交和回交观察异源多倍体材料的育性。
异源多倍体GY7与嫁接亲本云烟87和G391相比，异源多倍体GY7植株的叶形、叶尖与云烟87相似，主要的植物学性状差异表现为叶色浅绿，主脉较粗，支脉粗且畸形，叶耳处支脉分布密集，叶片较厚(如图3，表1所示)
表1：嫁接亲本云烟87、G391与异源多倍体无性株系GY7的植物学性状比较
(7)倍性鉴定：鉴定步骤(6)中得到的具有种间异源多倍体特性的植株的倍性，筛选多倍体，即得到多株烟草种间异源多倍体新种质植株。
采用流式细胞技术测定无性再生植株的DNA含量及倍性水平，以四倍体云烟87为外标，通过流式细胞测定G391、细胞质雄性不育系(MS云烟87)及各异源多倍体再生株系的G1相对荧光强度值，根据公式：样品倍性＝外标样品倍性值×(样品G1峰荧光强度/外标G1峰荧光强度值)，计算各未知样品的理论倍性水平。结果表明经离体嫁接结合部位获得的无性株系有五倍体、六倍体和八倍体等异源多倍体(如图4，表2所示)，共计获得GY4、GY5、GY7、GY11、GY13、GY14、GY19、GY38等8株异源多倍体新种质。
表2：嫁接亲本及无性株系倍性水平
实施例2：
一种利用水平基因组转移创制烟草种间异源多倍体新种质的方法，该方法包括如下步骤：
由于红花烟草(云烟87)和黄花烟草(G391)两者有性杂交不亲和，无法获得杂交后代，因此选取普通栽培红花烟草(云烟87)和黄花烟草(G391)为两个嫁接亲本，黄花烟草(G391)幼苗植株作为接穗植株，红花烟草(云烟87)幼苗植株作为砧木植株。
(1)无菌苗培育
在组培室中将将红花烟草种子(云烟87)和黄花烟草种子(G391)用次氯酸钠溶液进行表面消毒,然后用无菌水重复清洗3次，分别播种于含固体培养基的培养皿中，培养两周后将生长至小十字期的幼苗移植至含有固体培养基的培养瓶中，把培养瓶放入组培室中每天光照培养16，每天黑暗培养8时，待红花烟草植株和黄花烟草幼苗植株生长至株高8cm后作为嫁接亲本进行后续试验；上述固体培养基的组成为：4.74g/L MS、30g/L蔗糖、6g/L琼脂和蒸馏水，固体培养基的pH为5.8；上述光照培养的光照强度为50μEm-2 S-1，光照培养的温度为24℃，黑暗培养的温度为22℃。
2)离体嫁接：
将步骤(1)中得到的嫁接亲本进行交互嫁接得到嫁接体，将得到的嫁接体置于MS培养基中培养2-4周至嫁接结合部位融合完好，得到可正常生长的接穗植株。选择茎围相近的烟草无菌苗作为嫁接亲本，将黄花烟草(G391)幼苗植株作为接穗植株，留取接穗植株顶上的2片小叶，去除其余叶片，茎秆长度约3cm，将接穗植株沿茎两侧对称斜切45°后成楔形状接口；选取红花烟草(云烟87)幼苗植株，留取砧木植株根系以上3cm的茎段，其余剪去；用双面刀片从茎中部劈开5mm的接口；将接穗楔形端插入砧木接口，使形成层相吻合后，分别将两个嫁接亲本的茎秆斜切大约45°，然后连接起来，使其形成层吻合，并用塑料套管进行固定完成交互嫁接(如图1所示)；将处理好的嫁接体于MS培养基中培养4，直至嫁接结合部位融合完好，在此期间，每周及时剪除砧木上长出的腋芽；离体嫁接成活的标志是砧木和接穗结合部位形成有功能的维管组织，接穗植株正常生长。所用固体培养基为4.74g/L MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，其余为蒸馏水，pH为5.8。
(3)嫁接结合部位愈伤：切下步骤(2)中得到的接穗植株上的嫁接结合部位，用刀片将嫁接紧密结合部位横切成多块薄片，将每块薄片分别平放于含有愈伤固体培养基的培养瓶中培养25d，进行愈伤组织诱导，得到多块愈伤组织块。选择嫁接成活较好的嫁接体，切下嫁接结合部位，切去两端未黏连的部分，只保留两个嫁接亲本紧密结合的部分，用刀片将结合部位横切成薄片，厚度约为1mm)，一个嫁接部位一般可以切成4片左右，然后嫁接结合部位薄片平放于含有固体培养基的培养瓶中培养约25d，进行愈伤组织诱导(如图2所示)。
(4)不定芽诱导和生根培养：将步骤(3)中得到的多块愈伤组织块分别转移至含MS培养基的培养瓶中诱导愈伤组织块产生不定芽，将形成的不定芽分别移植至含固体培养基的培养瓶中进行培养，得到再生植株；在此过程中，愈伤组织会不断产生不定芽，需持续移植直到不再有不定芽产生；所用固体培养基为4.74g/L MS+30g/L蔗糖+6g/L琼脂，其余为蒸馏水，pH为5.8。
(5)再生植株移栽：用蒸馏水将步骤(4)中得到的再生植株的根部培养基冲洗干净，移栽至装有灭菌基质的营养钵中炼苗，炼苗25-30天后移栽至温室的花盆中，按常规烟草进行管理栽培。
(6)再生植株的表型筛选：将步骤(5)中得到的再生植株进行表型筛选，筛选出具有种间异源多倍体特性的植株；多倍体的外部形态一般表现为植株高大，茎秆粗壮，叶片变大，叶片颜色加深，果实和种子比较大。根据无性再生植株与两个嫁接亲本的表型性状间的差异，调查表型性状后初步筛选出可能为种间异源多倍体的株系。观察雌蕊和雄蕊的形态结构和花粉萌发测定，通过自交和回交观察异源多倍体材料的育性。
(7)倍性鉴定：鉴定步骤(6)中得到的具有种间异源多倍体特性的植株的倍性，筛选多倍体，即得到多株烟草种间异源多倍体新种质植株。采用流式细胞技术测定无性再生植株的DNA含量及倍性水平，以四倍体云烟87为外标，通过流式细胞测定G391、细胞质雄性不育系(MS云烟87)及各异源多倍体再生株系的G1相对荧光强度值，根据公式：样品倍性＝外标样品倍性值×(样品G1峰荧光强度/外标G1峰荧光强度值)，计算各未知样品的理论倍性水平。结果表经离体嫁接结合部位获得的无性株系有五倍体、六倍体和八倍体等异源多倍体，共计获得8株异源多倍体新种质。
发明人发现，红花烟草和黄花烟草两个嫁接亲本之间可相互作为接穗或砧木进行交互嫁接，将嫁接接合愈伤组织诱导及无性株系再生，通过再生植株表型筛选和倍性鉴定，都能获得8株异源多倍体新种质。克服了两种近缘烟草种间有性育种障碍，并形成可育的烟草异源多倍体植株，对烟草育种方法创新具有指导作用。以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术领域的技术人员在本发明揭露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其改进构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围内。
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