纳米二氧化锰在防治水稻白叶枯病中的应用
阅读说明：本技术 纳米二氧化锰在防治水稻白叶枯病中的应用 (Application of nano manganese dioxide in preventing and treating bacterial leaf blight of rice ) 是由 芮玉奎 周屏帆 陈澳回 李明姝 李元博 郭曼琳 于 2021-08-16 设计创作，主要内容包括：本发明提供纳米二氧化锰在防治水稻白叶枯病中的应用,包括：(1)将纳米二氧化锰粒子与水充分混合,形成悬浊液形式的纳米农药制剂,所述纳米农药制剂中纳米二氧化锰粒子的浓度为50-500mg/L；(2)将所述纳米农药制剂均匀喷施于水稻叶片。本发明所制备的纳米农药制剂对抑制白叶枯病感染具有显著功效,并且该纳米农药制剂可以起到肥料的效果促进植物的生长。(The invention provides an application of nano manganese dioxide in preventing and treating bacterial blight of rice, which comprises the following steps: (1) fully mixing nano manganese dioxide particles with water to form a nano pesticide preparation in a suspension form, wherein the concentration of the nano manganese dioxide particles in the nano pesticide preparation is 50-500 mg/L; (2) and uniformly spraying the nano pesticide preparation on rice leaves. The nano pesticide preparation prepared by the invention has obvious effect on inhibiting bacterial leaf blight infection, and can play a role of fertilizer to promote the growth of plants.)
技术领域
本发明属于植物病菌防治领域，特别涉及一种对防治水稻白叶枯病有良好效果并且可作为一种肥料促进植物生长的新型纳米农药制剂。具体涉及一种运用于防治水稻白叶枯病的纳米农药制剂，包含其主要成分、制备方法及其施用方法。
背景技术
水稻白叶枯病俗称过火风、地火烧、白叶瘟等，由白叶枯病原菌引起，危害部位主要为叶片和叶鞘。该病多发于沿湖沿海等低洼易涝区域，主要集中在华东、华南等主要水稻生产区。感染后的稻株主要特征为“失水、青枯、卷曲、凋萎”，使得作物叶片坏死从而无法进行光合作用合成营养物质，对水稻幼苗有极大的危害。从而导致水稻结实率低，青粒多，米质松脆，严重危害到了我国水稻主产区的食品产量和营养品质，给粮食产业造成了巨大的经济损失，是我国当前粮食安全问题中面临的一项重大挑战。
水稻白叶枯病原细菌(学名：Xanthomonas oryzae)属假单胞细菌目、假单胞菌科、黄单胞杆菌属。菌细胞单生，短杆状，两端钝圆，大小约为0.6μm×1.5μm。在菌体一端生有1根线状的鞭毛，长约6-9μm，宽约30nm。
由于纳米材料其巨大的比表面积、灵活的表面功能化和固有的理化性质在纳米农业方面已经被美国纳米技术行动列为8个交叉领域之一，具有巨大的应用潜力。研究表明，低浓度纳米材料的叶面施用不仅不会影响植物正常的生长发育，而且还可以促进植物生长，提高非生物胁迫下的光合作用效率，并提高生物量和果实品质。目前广泛应用于农业生产中的传统含铜抗菌剂的抗菌活性极大程度上受到铜元素的价态、颗粒大小、晶相等特性的影响。而纳米材料由于其巨大的比表面积，较之传统商用铜基抗菌剂，具有更高效的抗菌活性，其抗菌机理主要为并纳米材料破坏细胞膜在细菌体内产生大量活性氧。
在本发明中所使用的二氧化锰纳米材料，其纳米结构和纳米材料产生的氧化应激作用可以有效的破坏细菌的细胞膜，并且在纳米二氧化锰表面上有大量的+2和+3价锰离子，可以对真菌造成金属毒性，有效灭菌。
植物病菌抑制剂目前已在世界范围内广泛应用，其在抑制各种各样的植物病害上具有极大的潜力。并且由于锰是植物生长所需的一种重要元素，适当的添加该元素不仅可以有效促进植物的生长，而且还可以提升植物的抗逆性，有效抵御各种农业病原菌的侵害。
发明内容
本发明的目的在于提供纳米二氧化锰在防治水稻白叶枯病中的应用，包含其主要成分、制备方法及其施用方法。
根据本发明的第一方面，提供纳米二氧化锰在防治水稻白叶枯病中的应用，包括：
(1)将纳米二氧化锰粒子与水充分混合，形成悬浊液形式的纳米农药制剂，所述纳米农药制剂中纳米二氧化锰粒子的浓度为50-500mg/L；
(2)将所述纳米农药制剂均匀喷施于水稻叶片。
优选情况下，所述纳米二氧化锰粒子的粒径为20-30nm，纯度＞99.9％。
优选情况下，步骤(2)中单次施用量为3-5ml/株。
根据本发明的第二方面，提供一种具有防治水稻白叶枯病和肥料双重功效的纳米农药制剂，由纳米二氧化锰粒子和水均匀混合而成，最后形成的纳米农药制剂中纳米二氧化锰粒子的浓度为50-500mg/L。
本发明涉及到的新型白叶枯病菌抑制剂的重要成分由纳米二氧化锰、去离子水两种成分构成。
二氧化锰是一种氧化物，分子式为MnO2，为黑色无定形粉末或黑色斜方晶体，难溶于水、弱酸、弱碱、硝酸、冷硫酸，加热情况下溶于浓盐酸而产生氯气。用于锰盐的制备，也用作氧化剂、除锈剂。因其独特的结构特征、低毒性、可清除活性氧物质等特性而被广泛利用于生物医学领域。研究表明适量浓度下纳米二氧化锰对植物没有显著的毒理效应，反而可以促进植物幼苗的生长。同时，在如重金属胁迫、热胁迫等非生物应激条件下，纳米二氧化锰可以通过调剂增加叶绿素以及脯氨酸的合成而有效帮助植物抵抗来自外界的胁迫。除此之外，在本发明中我们还发现了二氧化锰纳米粒子抑制了稻黄单胞菌的生长繁殖，并且限制了稻黄单胞菌在水稻的叶片上的扩散。
本发明涉及到的以上两种主要成分，即二氧化锰纳米粒子、去离子水，从抑制白叶枯病菌的生长繁殖，限制了白叶枯病菌在植物的叶片的扩散这两个角度共同作用以抑制白叶枯病菌对水稻的感染，并综合的改善被感染后植物的生长状况。
本发明基于我国水稻白叶枯病肆虐的严峻现状，以及对于以上重要的二氧化锰纳米农药制剂在抑制白叶枯病菌感染，促进植物生长方面的认识，通过调整配比，发明一种新型白叶枯病纳米农药制剂以缓解水稻受白叶枯病菌的侵袭，并且该新型纳米农药制剂可以起到肥料的效果促进植物生长，同时有效提升被白叶枯病感染后水稻的抗逆性，纳米材料在抑制水稻白叶枯病上具有较大的可行性和巨大的应用潜力。
附图说明
图1为本发明所采用的纳米二氧化锰的透射电镜图像。
图2示出了实施例1在施加不同浓度的纳米农药制剂后，水稻的生长状况。
图3示出了实施例1在施加不同浓度的纳米农药制剂后，水稻的株高、根长、叶片净重和根部净重。
图4示出了实施例1在施加不同浓度的纳米农药制剂后，水稻的各项根部形态参数，包括总根长、总表面积、平均根直径和总根体积。
图5示出了实施例1在施加不同浓度的纳米农药制剂后，水稻叶片的相对叶绿素含量。
图6示出了实施例1在施加不同浓度的纳米农药制剂后，水稻叶片中MDA的含量和各种抗氧化系统酶的活性(包括SOD酶、POD酶和CAT酶)。
图7示出了实施例1在施加不同浓度的纳米农药制剂后，水稻叶片和根部中锰的含量。
图8示出了实施例1在施加不同浓度的纳米农药制剂后，含水稻黄单胞菌的菌液吸光度的变化情况。
图9示出了实施例1在人为接种白叶枯病菌下施加不同浓度的纳米农药制剂后，水稻的叶片上感染的情况。
具体实施方式
下面通过具体的实施例1详细说明本发明涉及的一种具有抑制白叶枯病感染的纳米农药制剂的制备及其使用方法，该实施例仅是用于更具体详细地介绍该发明，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
以下实施例中使用的试剂如下:
纳米二氧化锰购自于上海攀田粉体公司(参见图1，粒径为20-30nm，纯度＞99.9％)，实验中其他化学试剂均购自北京市化工厂。
实施例1
本实施例用于说明本发明所涉及的纳米农药制剂在适量浓度下对水稻并没有明显的毒理效应并可以有效抑制了白叶枯病菌的感染。
实验所需水稻(Y两优)购买于中国农业科学院，萌发前用3％的双氧水消毒20min，使用去离子水清洗3遍，挑选大小相近的种子放入培养皿后，于种子表面盖一层滤纸并撒上适量的去离子水，在25℃的温度下发芽一周。然后挑选大小相近的水稻幼苗移到含1/4浓度木村营养液的250ml离心管中，在150μmol m-2s-1的光合有效辐射(PAR)，相对湿度60-65％，温度25-28℃的环境下培养一周后准备进行实验。
为了确定该纳米农药制剂的毒理学效应，将50、250和500mg/L三种不同浓度的纳米农药制剂(本发明)和纳米农药制剂B加入到含全浓度木村营养液离心管中(对照组为不添加任何纳米农药制剂，纳米农药制剂B的成分为纳米Mn3O4)，并将上述发芽并培养两周的幼苗移入，连续培养两周后观察毒理学效应，为防止培养期间营养液中氧气和养分不足，培养期间共更换两次营养液。培养结束按照以下方法测定各项指标：
水稻的表型参数：使用直尺和电子天平测定株高、根长、生物量(鲜重和干重)。植物根部形态参数：用根部扫描仪(Epson expression1680,Japan)进行扫描，水稻根部用蒸馏水清洗后，将不同处理的水稻根放在装有蒸馏水的托盘上，充分舒展后进行扫描。扫描后的图片使用图像分析软件Win RHIZO的根图像分析系统(version Pro 2007d,Quebec,Canada)计算根系形态相关参数。叶片相对叶绿素的测定：使用手持式相对叶绿素测定仪测定了水稻叶片的相对叶绿素含量。叶片激素、酶的测定：使用生物试剂盒测量病毒感染叶片中的水杨酸(SA)，脱落酸(ABA)的浓度以及过氧化氢酶(CAT)，过氧化物酶(POD)，丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD)的活性。水稻各个部位锰含量的测定：将植物烘干后磨碎并称取0.2g，使用ICP-OES测定了水稻各个部位锰含量。
通过以上实验确定了适量浓度下纳米二氧化锰对植物并没有明显的毒理效应之后，为了继续探究该纳米农药制剂对水稻白叶枯病菌的防治效果，进行了抗菌实验。
从-80℃冰箱里取出水稻白叶枯病菌PXO99A，在NA固体培养基进行了以下两个实验。首先上划线，28℃倒置培养3-5天后在超净工作台中，从NA培养基上用移液枪取少量PXO99A于5mL NA液体培养基中，加入5μl头孢氨苄抗生素(抗生素：培养基＝1：1000)。将上述的液体培养基置于摇床上，28℃，200rpm培养24小时后将摇好的菌液，在超净工作台中，取出10μL，加入90μL的无菌水，用移液枪混合均匀。在分光光度仪中，波长600nm条件下，测定菌液稀释10倍后OD值。根据上步测好的OD值，将配好的PXO99A菌液用无菌水稀释成OD600＝0.1。在OD600＝1的无菌管中，给予超声震荡过后1mL的50、250和500mg/L的纳米农药制剂和纳米农药制剂B(对照组为不添加任何纳米农药制剂，仅添加等量去离子水；纳米农药制剂B为添加等量纳米Mn3O4)。培养24h后，用紫外分光光度计测定OD600 nm处的光密度，测定其对细菌生长的抑制作用。每个处理设3个重复。
从4周龄的植物上切下相似大小的叶片后，将它们在超干净的工作台中浸泡在70％酒精中10秒钟，用无菌水冲洗3次，然后浸入2％次氯酸钠中10分钟进行消毒。将处理的叶片平放在琼脂培养基上，并用灭过菌的湿棉花压住叶片两端，以便能提供水分使叶片保持新鲜以及固定叶片。之后，用无菌针均匀划伤叶静脉上的3个伤口，在每个伤口接种真菌量为10μL(OD600＝0.1)，在接种黄单胞菌第二天喷施1mL的50，250，500mg/L三种不同浓度的纳米农药制剂。接种和治疗之间的时间间隔为24小时。之后，将叶片置于26℃琼脂培养基中，观察并记录叶片伤口的变化。
数据处理：所有实验均设置4个平行样，每种处理的数据代表平均值±标准偏差(SD)。使用Statistix 8.1(一种分析软件)进行了方差分析(ANOVA)和T检验，以计算实验数据之间的统计学差异(P≤0.05)。
结果显示，50mg/L纳米农药制剂对水稻的株高、根长、和生物量并没有抑制作用，相反还略微促进了水稻的生长，尤其是显著的促进了水稻的根长(图2)。与另一纳米农药制剂B相比，本发明中的纳米农药制剂对作物的毒性明显更低，其中重点表现在水稻的根部重量上(图3)；根部是植物吸收养分的重要器官，植物根系越发发散，养分的吸收和获取越发发达。通过对植物根系进行了扫描，我们证明了本发明中的纳米农药制剂对水稻的根部的总根长、总根表面积、平均根直径和总根体积并无明显的影响，相反的是，部分浓度下的纳米农药制剂还促进了根系指标的增长(图4)。此外，我们发现该纳米农药制剂在低浓度下对水稻叶片的相对叶绿素含量并无明显的影响(图5)。我们还分析了水稻叶片中抗氧化系统的变化情况(图6)，MDA(丙二醛)是反映植物细胞膜脂过氧化作用的一个指标，我们发现低浓度纳米农药制剂对MDA的含量和各种抗氧化系统酶的活性并无明显影响，以上结果足以证明本发明中的纳米农药制剂对植物的毒性很小。最后，我们还分析了水稻根部和叶片中Mn的含量，结果表明，本发明中的纳米农药制剂相对于制剂B，明显降低了Mn在植物各个部位的积累(图7)。
在抗菌实验中，培养24h后，我们发现使用了纳米农药制剂处理的菌液OD明显低于未使用抑菌剂的对照组(图8)。此外，在水稻原位培养实验中，我们通过图片可以发现接种了白叶枯病菌的水稻叶片出现明显发黄且坏死的现象，同时在50mg/L的纳米农药制剂的作用下，抑菌效果极其显著(图9)。原因是纳米农药制剂抑制了生物膜活性和游动能力，减少致病菌的繁殖速度，同时纳米农药制剂能对致病菌参与运动和生物膜形成的调节回路产生影响，一方面抑制了白叶枯病菌的繁殖，使其数量增长缓慢，另一方面破坏其侵染宿主的能力，从而起到抑制致病菌的作用。