阅读说明：本技术 一种内镜粘膜下注射***剂的制备方法及其工艺 (Preparation method and process of endomucosal injection swelling agent ) 是由 曹加花 顾建军 张堃 陈雄伟 于 2020-06-12 设计创作，主要内容包括：本发明涉及一种内镜粘膜下注射隆起剂的制备方法及其工艺。它是由交联透明质酸钠和染色剂构成,其中交联透明质酸钠的质量含量为0.1%~0.8%,染色剂的的质量含量为0.0005%~0.05%；制备工艺是将透明质酸钠水溶液,加入氢氧化钠溶液搅拌使之变稀,再加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚(BDDE)进行交联反应；交联结束后用盐酸溶液调整pH值,并用含染色剂的磷酸盐缓冲溶液稀释,均质后经湿热灭菌得到内镜粘膜下注射隆起剂。根据本发明制备的隆起剂,具有具有原料用量少,注入压力小,隆起高度高,维持时间长,可以终端灭菌,易于生产、运输和储存,更为安全的优点。(The invention relates to a preparation method and a process for injecting a swelling agent under an endoscope mucosa. The dyeing agent is composed of cross-linked sodium hyaluronate and a dyeing agent, wherein the mass content of the cross-linked sodium hyaluronate is 0.1-0.8%, and the mass content of the dyeing agent is 0.0005-0.05%; the preparation process comprises adding sodium hyaluronate aqueous solution into sodium hydroxide solution, stirring to thin, adding cross-linking agent 1, 4-butanediol diglycidyl ether (BDDE), and performing cross-linking reaction; and after the crosslinking is finished, adjusting the pH value by using a hydrochloric acid solution, diluting by using a phosphate buffer solution containing a coloring agent, homogenizing, and performing moist heat sterilization to obtain the endoscopic submucosal injection swelling agent. The swelling agent prepared according to the invention has the advantages of less raw material consumption, small injection pressure, high swelling height, long maintaining time, terminal sterilization, easy production, transportation and storage and higher safety.)

一种内镜粘膜下注射***剂的制备方法及其工艺

技术领域

本发明涉及一种内镜粘膜下注射***剂的制备方法与工艺。所述内镜粘膜下注射***剂由交联多糖、染色剂和磷酸盐缓冲溶液制成的凝胶，可用作消化道黏膜下注射材料。

背景技术

我国消化道肿瘤占总恶性肿瘤发病数的一半以上，消化道肿瘤的早诊断、早治疗是提高其疗效的关键所在，而消化道早癌经内镜治疗，5年生存率可大幅度提高至90%以上，具有创伤小，住院时间短及费用低等优点，因此内镜在诊治消化道早癌及癌前病变中的重要作用。

近年来，以内镜下黏膜切除术（EMR）和内镜黏膜下剥离术（ESD）为代表的内镜技术对消化道疾病的诊治产生了革命性影响，并成为消化道早癌及癌前病变的首选治疗方式，因而内镜粘膜下注射***剂在消化内镜手术中则显得尤为重要。通过注射黏膜下***剂，可以让目标黏膜***以便于切除，减少出血、穿孔等并发症，还可以初步判定能否进行内镜治疗。与EMR相比，ESD切除范围较大，其操作时间相应延长，同时因切除病灶较大，治疗过程中出现并发症的概率也相应增加，有效的黏膜下注射是确保ESD安全性的决定性因素。因此，随着内镜技术的发展，寻找一种理想的黏膜下注射剂成为了研究人员和内镜医师探索的目标之一。

透明质酸钠（HA）是由D-葡萄糖醛酸和N-乙酰基-D-葡萄糖胺通过交替的（1→4）和（1→3）糖苷键连接而成的双键重复结构单元组成的线性多糖，它作为人体内源性物质，广泛用于眼科、骨科、整形美容科等多个科室的注射。透明质酸钠具有较高的黏稠度和吸水性，注射后不易被快速吸收，因而***效果要优于临床上常用的生理盐水、50%葡萄糖溶液、高渗盐水以及浓的甘油-果糖溶液。

中国专利CN105561402A和CN 105287626A，分别公开了一种用非交联透明质酸钠溶液作为内镜用黏膜下注入剂的方法，***效果明显优于生理盐水，且润滑效果优异的透明质酸钠具有促进血管形成、促进伤口愈合、抗肿瘤、免疫调节等生理功能。

CN107456612A也公开了黏膜下注射溶液等。但是，透明质酸钠溶液并不稳定，对灭菌方式和贮存条件有严格的要求，需要用无菌加工的方法生产，为产品的生产加工及运输贮存增加了难度。由于透明质酸钠的成本较高，因而减少产品中透明质酸钠的用量尤为关键。

发明内容

本发明的目的是提供了一种内镜粘膜下注射***剂制备方法与工艺，可以解决上述技术问题，本发明具有原料用量少，***高度高，维持时间长，可以终端灭菌，易于生产、运输和储存，更为安全的优点，具有重要的临床意义和应用价值。。

本发明提供的一种内镜粘膜下注射***剂是由交联透明质酸钠和染色剂构成，其中 交联透明质酸钠的质量百分比浓度为0.1%~0.8%，染色剂的的质量百分比浓度为0.0005%~0.05%；制备工艺是将透明质酸钠水溶液，加入氢氧化钠溶液搅拌使之变稀，再加入交联剂1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）进行交联反应；交联结束后用盐酸溶液调整pH值，并用含染色剂的磷酸盐缓冲溶液稀释，均质后经湿热灭菌得到内镜粘膜下注射***剂。

所述的交联剂与透明质酸钠质量比：0.001~0.1:1。

所述的交联剂可用碳二亚胺类交联剂、砜类交联剂、醛类交联剂以及其他环氧类交联剂替换。

所述的染色剂可用靛胭脂、刚果红替换。

所述的透明质酸钠的分子量范围为20~2000kDa，优选分子量范围为150~1500kDa。

所述的透明质酸钠可用多糖：海藻酸钠、纤维素及衍生物、淀粉、葡聚糖以及硫酸软骨素等替换。

本发明提供的一种内镜粘膜下注射***剂的制备方法包括以下步骤：

1）按计量将透明质酸钠溶解于水中，配制成水溶液，在10~30℃的环境下静置溶解2~10h。所述的透明质酸钠质量百分比浓度为0.5%~50%。

2）向水溶液中加入氢氧化钠溶液，搅拌使得透明质酸钠水溶液变稀。氢氧化钠溶液质量百分比浓度为2%~20%。

3）向变稀后的透明质酸钠水溶液中加入交联剂，搅拌反应，反应温度为10~50℃，反应时间为18~24h。所述的交联剂与透明质酸钠质量比：0.001~0.1:1。

4）先用盐酸溶液调整反应体系的pH值至6.0~8.0，再用含染色剂的磷酸盐缓冲溶液稀释，配制成质量百分比为0.1%~0.8%的交联凝胶。所述的染色剂的的质量百分比浓度为0.0005%~0.05%。

5）将交联凝胶均质后，在121±1℃温度下灭菌5~15min，得到内镜粘膜下注射***剂。

本发明提供了一种内镜粘膜下注射***剂制备方法与工艺，解决了现有技术存在的问题，本发明采用化学方法将多糖进行交联，并加入染色剂得到的内镜粘膜下注射***剂凝胶，具有原料用量少，注入压力小，***高度高，凝胶强度可调节，适用性较广，维持时间长，可以终端灭菌，易于生产、运输和储存，更为安全的优点。

本发明的特别突出的特点是将多糖进行交联形成凝胶后，其内部各分子连接形成网状支架，基于这种三维空间网格能够结合大量的水，因而极低浓度的凝胶即可达到较好的***效果，而浓度低可以降低原料的用量，同时保持较低的注入压力。相对于非交联透明质酸钠溶液，本发明的原料用量能够降低50%以上，且注入压力能够降低20%以上，60min后的***高度能够提高14%以上。

附图说明

图1为将本发明注射至兔胃粘膜下初始时刻***高度的比较实验效果图；A对照例：HA分子量为825kD，浓度为0.4%；B实施例4：HA分子量为1270kD，交联剂与HA质量比为0.005:1，浓度为0.4%；C实施例7：HA分子量为825kD，交联剂与HA质量比0.0075:1，浓度为0.2%；D实施例9：HA分子量为1270kD，交联剂与HA质量比0.0075:1，浓度为0.2%）。

图2为将本发明注射至兔胃粘膜下60min后***高度的比较实验效果图；（A对照例：HA分子量为825kD，浓度为0.4%；B实施例4：HA分子量为1270kD，交联剂与HA质量比为0.005:1，浓度为0.4%；C实施例7：HA分子量为825kD，交联剂与HA质量比0.0075:1，浓度为0.2%；D实施例9：HA分子量为1270kD，交联剂与HA质量比0.0075:1，浓度为0.2%）。

具体实施方式

以下通过实施例对本发明作进一步的详细说明，这并不限制本发明的保护范围。

实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件以及手册中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件；所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可由商业途径获得。

实施例1：交联透明质酸钠凝胶的制备

称取透明质酸钠粉末（分子量825kDa）10g，溶解于40mL水中，得到质量百分比为25%的透明质酸钠溶液。加入20%的氢氧化钠溶液5mL，搅拌变稀后，向溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）50μL，搅拌后置于25℃温度下，持续反应24h。先用盐酸溶液调整反应体系的pH值至6.0~8.0，再用含0.001%亚甲基蓝的磷酸盐缓冲溶液稀释，配制成质量百分比为0.4%的交联透明质酸钠凝胶。将凝胶均质后，在121±1℃温度下灭菌15min，得到内镜粘膜下注射***剂。

实施例2：交联透明质酸钠凝胶的制备

称取透明质酸钠粉末（分子量825kDa）10g，溶解于40mL水中，得到质量百分比为25%的透明质酸钠溶液。加入20%的氢氧化钠溶液5mL，搅拌变稀后，向溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）75μL，搅拌后置于25℃温度下，持续反应24h。先用盐酸溶液调整反应体系的pH值至6.0~8.0，再用含0.001%亚甲基蓝的磷酸盐缓冲溶液稀释，配制成质量百分比为0.4%的交联透明质酸钠凝胶。将凝胶均质后，在121±1℃温度下灭菌15min，得到内镜粘膜下注射***剂。

实施例3：交联透明质酸钠凝胶的制备

称取透明质酸钠粉末（分子量825kDa）10g，溶解于40mL水中，得到质量百分比为25%的透明质酸钠溶液。加入20%的氢氧化钠溶液5mL，搅拌变稀后，向溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）100μL，搅拌后置于25℃温度下，持续反应24h。先用盐酸溶液调整反应体系的pH值至6.0~8.0，再用含0.001%亚甲基蓝的磷酸盐缓冲溶液稀释，配制成质量百分比为0.4%的交联透明质酸钠凝胶。将凝胶均质后，在121±1℃温度下灭菌15min，得到内镜粘膜下注射***剂。

实施例4：交联透明质酸钠凝胶的制备

称取透明质酸钠粉末（分子量1270kDa）10g，溶解于40mL水中，得到质量百分比为25%的透明质酸钠溶液。加入20%的氢氧化钠溶液5mL，搅拌变稀后，向溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）50μL，搅拌后置于25℃温度下，持续反应24h。先用盐酸溶液调整反应体系的pH值至6.0~8.0，再用含0.001%亚甲基蓝的磷酸盐缓冲溶液稀释，配制成质量百分比为0.4%的交联透明质酸钠凝胶。将凝胶均质后，在121±1℃温度下灭菌15min，得到内镜粘膜下注射***剂。

实施例5：交联透明质酸钠凝胶的制备

称取透明质酸钠粉末（分子量1270kDa）10g，溶解于40mL水中，得到质量百分比为25%的透明质酸钠溶液。加入20%的氢氧化钠溶液5mL，搅拌变稀后，向溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）75μL，搅拌后置于25℃温度下，持续反应24h。先用盐酸溶液调整反应体系的pH值至6.0~8.0，再用含0.001%亚甲基蓝的磷酸盐缓冲溶液稀释，配制成质量百分比为0.4%的交联透明质酸钠凝胶。将凝胶均质后，在121±1℃温度下灭菌15min，得到内镜粘膜下注射***剂。

实施例6：交联透明质酸钠凝胶的制备

称取透明质酸钠粉末（分子量1270kDa）10g，溶解于40mL水中，得到质量百分比为25%的透明质酸钠溶液。加入20%的氢氧化钠溶液5mL，搅拌变稀后，向溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）100μL，搅拌后置于25℃温度下，持续反应24h。先用盐酸溶液调整反应体系的pH值至6.0~8.0，再用含0.001%亚甲基蓝的磷酸盐缓冲溶液稀释，配制成质量百分比为0.4%的交联透明质酸钠凝胶。将凝胶均质后，在121±1℃温度下灭菌15min，得到内镜粘膜下注射***剂。

实施例7：交联透明质酸钠凝胶的制备

称取透明质酸钠粉末（分子量825kDa）10g，溶解于40mL水中，得到质量百分比为25%的透明质酸钠溶液。加入20%的氢氧化钠溶液5mL，搅拌变稀后，向溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）75μL，搅拌后置于25℃温度下，持续反应24h。先用盐酸溶液调整反应体系的pH值至6.0~8.0，再用含0.001%亚甲基蓝的磷酸盐缓冲溶液稀释，配制成质量百分比为0.2%的交联透明质酸钠凝胶。将凝胶均质后，在121±1℃温度下灭菌15min，得到内镜粘膜下注射***剂。

实施例8：交联透明质酸钠凝胶的制备

称取透明质酸钠粉末（分子量825kDa）10g，溶解于40mL水中，得到质量百分比为25%的透明质酸钠溶液。加入20%的氢氧化钠溶液5mL，搅拌变稀后，向溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）100μL，搅拌后置于25℃温度下，持续反应24h。先用盐酸溶液调整反应体系的pH值至6.0~8.0，再用含0.001%亚甲基蓝的磷酸盐缓冲溶液稀释，配制成质量百分比为0.2%的交联透明质酸钠凝胶。将凝胶均质后，在121±1℃温度下灭菌15min，得到内镜粘膜下注射***剂。

实施例9：交联透明质酸钠凝胶的制备

称取透明质酸钠粉末（分子量1270kDa）10g，溶解于40mL水中，得到质量百分比为25%的透明质酸钠溶液。加入20%的氢氧化钠溶液5mL，搅拌变稀后，向溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）75μL，搅拌后置于25℃温度下，持续反应24h。先用盐酸溶液调整反应体系的pH值至6.0~8.0，再用含0.001%亚甲基蓝的磷酸盐缓冲溶液稀释，配制成质量百分比为0.2%的交联透明质酸钠凝胶。将凝胶均质后，在121±1℃温度下灭菌15min，得到内镜粘膜下注射***剂。

实施例10：交联透明质酸钠凝胶的制备

称取透明质酸钠粉末（分子量1270kDa）10g，溶解于40mL水中，得到质量百分比为25%的透明质酸钠溶液。加入20%的氢氧化钠溶液5mL，搅拌变稀后，向溶液中加入1,4-丁二醇二缩水甘油醚（BDDE）100μL，搅拌后置于25℃温度下，持续反应24h。先用盐酸溶液调整反应体系的pH值至6.0~8.0，再用含0.001%亚甲基蓝的磷酸盐缓冲溶液稀释，配制成质量百分比为0.2%的交联透明质酸钠凝胶。将凝胶均质后，在121±1℃温度下灭菌15min，得到内镜粘膜下注射***剂。

对照例：透明质酸钠溶液的制备

称取透明质酸钠粉末（分子量825kDa）4g，溶解于100mL含0.001%亚甲基蓝的磷酸盐缓冲溶液中，搅拌至完全溶解，配制成质量百分比为0.4%的透明质酸钠溶液。然后，过滤除菌，得到内镜粘膜下注射***剂，作为对照例。

实施例11：***高度比较实验1

分别将各实施例和对照例对应的注射剂装入2.25ml预灌封注射器中，测定推挤力和抗压性能。使用深圳三思纵横科技股份有限公司的UTM6202电子万能拉力试验机，在30mm/min速度下检测推挤力，所用推挤针头为TSK公司的27G×1/2型号针头；使用TA公司的DHR-2流变仪，在37℃温度、0.5N压向力下进行轴向力测试，通过计算150~180s内的轴向力平均值作为抗压能力的检测。各项检测结果如表1，可知，实施例4、实施例7、实施例8、实施例9的推挤力均小于对照例，即实际使用过程的注入压力较小，注入操作较为容易，而实施例2、实施例3、实施例4、实施例5、实施例6、实施例7、实施例9的轴向力均大于对照例，即有较好的抗压能力。综合而言，实施例4、实施例7、实施例9的注入压力均小于对照例，抗压能力均优于对照例。因此，将交联透明质酸钠作为内镜粘膜下注射***剂，可以终端灭菌，易于生产、运输和储存，更为安全，且注入压力小，抗压能力强。

表1 ：

实施例12：***高度比较实验

根据表实施例11的结果，从推挤力、弹性模量和轴向力对比结果来看，实施例4、实施例7、实施例9均优于对照例，故选取实施例4、实施例7、实施例9，与对照例进行进一步***高度的比较实验。取新鲜的兔胃，用手术刀切开后平铺于泡沫板上，向胃粘膜下层注入各注射剂 0.5ml。注射结束后，黏膜下形成***，分别记录初始时刻和60min后的黏膜***高度。各项结果如表2，可知，与对照例相比，实施例4注射短时间内的***高度较优，但维持能力略差，实施例7注射初始时刻***高度略低于对照例，但维持能力较优，能够保证***高度在注射60min后维持不变（维持率100%），而实施例9初始***高度（6.1mm）和维持能力均优于对照例（维持率100%）。总体而言，实施例9最优，实施例7次之，此外，实施例7和实施例9中透明质酸钠的用量仅为对照例的1/2。

因此，将交联透明质酸钠作为内镜粘膜下注射***剂，不仅具有注入压力小，抗压能力好，可以终端灭菌，易于生产、运输和储存，更为安全的优点，还能够维持更为持久的***效果，有效减少透明质酸钠的用量，大幅度降低成本，具有重要的临床意义和应用价值。

表2：

注：60min***高度维持率=60min***高度/初始时刻***高度×100%。