阅读说明：本技术 一种益生菌和益生元复合制剂、其制备方法及其用途 (Probiotics and prebiotics compound preparation, preparation method and application thereof ) 是由 秦楠 李艳艳 张国宁 尚小云 邱盟轩 于 2019-09-25 设计创作，主要内容包括：本发明公开了一种益生菌和益生元复合制剂、其制备方法及其用途,属于生物医药领域。本发明由复合益生菌和复合益生元组成,所述复合益生菌由丁酸梭菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌组成。本发明中复合益生菌的种类由糖尿病患者和健康人肠道微生物采集、理论研究至实验探索、以及结果验证,获得了真正意义上可防治糖尿病的益生菌益生元复合制剂；经研究结果显示,可有效降低血糖,改善胰岛素抵抗,同时对器官具有一定的保护作用。(The invention discloses a probiotic and prebiotic composite preparation, a preparation method and application thereof, and belongs to the field of biomedicine. The invention consists of composite probiotics and composite prebiotics, wherein the composite probiotics consist of clostridium butyricum, lactobacillus plantarum, bifidobacterium longum and lactobacillus paracasei. The type of the composite probiotics in the invention is obtained by collecting intestinal microorganisms of diabetics and healthy people, researching theories to experiments, and verifying results, so that the probiotic and prebiotics composite preparation which can prevent and treat diabetes in a real sense is obtained; the research result shows that the traditional Chinese medicine composition can effectively reduce blood sugar, improve insulin resistance and simultaneously has a certain protection effect on organs.)

一种益生菌和益生元复合制剂、其制备方法及其用途

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种益生菌和益生元复合制剂、其制备方法及其用途。

背景技术

据统计，2004年全球约有340万人死于糖尿病及其并发症。据国际糖尿病联盟的调查结果显示，2007年的全球糖尿病患病人数为2.4亿，2011年患病人数增长为3.47亿。糖尿病国际联盟预测，2045年全球糖尿病患病人数将达到6.29亿。有研究报道，中国已经成为糖尿病人口大国，且患病率呈持续升高状态。高血糖往往伴随着血脂代谢紊乱现象，引起血液粘稠及血流速减慢，长期发展会导致动脉粥样硬化、血栓等慢性心血管疾病。糖尿病及其并发症严重威胁着人们的身体健康，降低了人们的生活质量。

临床上一般采用口服降糖药对糖尿病患者进行治疗，如磺脲类、双胍类等。但是长期应用这种治疗方法易引起一些副作用，如腹泻、头晕、恶心、食欲不振、低血糖和肝功能损伤等，严重威胁人们的健康。因此，一种天然的、安全的新型降糖药物或辅助治疗药物的开发变得尤为重要。

近年来，益生菌由于其安全性、易获得、成本低廉和无副作用等特点，逐渐成为糖尿病防治的研究热点。

发明内容

为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种益生菌和益生元复合制剂、其制备方法及其用途。

本发明的技术方案为：

一种益生菌和益生元复合制剂，由复合益生菌和复合益生元组成，所述复合益生菌由丁酸梭菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌组成。

作为优选方案，所述复合益生菌中，丁酸梭菌活菌数为10⁹～10¹⁰CFU/g，植物乳杆菌活菌数为10⁹～10¹⁰CFU/g，长双歧杆菌活菌数为10⁹～10¹⁰CFU/g，副干酪乳杆菌活菌数为10⁹～10¹⁰CFU/g。

作为优选方案，所述复合益生菌按照质量分数计，由35％～55％丁酸梭菌、20％～45％植物乳杆菌、15％～30％长双歧杆菌、10％～25％副干酪乳杆菌组成。

作为优选方案，所述复合益生元由低聚异麦芽糖和低聚半乳糖组成。

进一步地，所述复合益生元中，低聚异麦芽糖的质量百分比为25％～85％和低聚半乳糖的质量百分比为15％～75％。

作为优选方案，复合益生菌的质量百分比为35％～85％，复合益生元的质量百分比为15％～65％。

最优选的，复合益生菌的质量百分比为72％，复合益生元的质量百分比为28％。

所述益生菌和益生元复合制剂的制备方法，将丁酸梭菌菌粉、植物乳杆菌菌粉、长双歧杆菌菌粉、副干酪乳杆菌菌粉置于无菌罐中，搅拌均匀后，加入复合益生元，继续搅拌均匀，得益生菌和益生元复合制剂。

作为优选方案，丁酸梭菌菌粉、植物乳杆菌菌粉、长双歧杆菌菌粉、副干酪乳杆菌粉的制备方法为：

1)分别将丁酸梭菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌先经MRS培养基活化，然后置于发酵培养基中高密度培养；

2)离心分离菌体，加入含有脱脂奶粉、谷氨酸和维生素E的冻干保护液中，混合后，冷冻干燥，获得相应的菌粉。

作为优选方案，所述益生菌和益生元复合制剂为粉剂、片剂或胶囊。

所述益生菌和益生元复合制剂的用途，用于降血糖及改善胰岛素抵抗。

基于高通量测序的人体微生物组学与各类疾病的相关研究，在很大基础上给人们提供了选择益生菌的指示。为了揭示糖尿病患者与肠道菌群紊乱的因果关系并寻找合适的益生菌组合药物，本申请人在前期收集了大量糖尿病患者和健康人群的粪便样本，通过宏基因组测序分析，获得糖尿病患者和健康人肠道微生物的大数据，并与已有的糖尿病患者肠道数据整合，构建了糖尿病肠道菌群基因集。同时完成了糖尿病和健康人群肠道菌群物种的分类和基因功能注释，通过比较，找到了多种糖尿病特有的物种和功能基因以及相对健康人群含量显著降低的微生物群。通过随机森林模型，进一步精确到四种特异性微生物(丁酸梭菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌)，并基于独立人群进行模型验证，该四种微生物组合变化能够对糖尿病早期进行很好的预判。

益生元可以为益生菌提供“食物”，能够被肠道内有益细菌分解吸收，促进有益细菌生长繁殖，从而对宿主产生有益影响。本发明在四种混合益生菌基础上，又添加了两种益生元，进一步为益生菌提供源源不断的能量，是一种新型的具有显著降血糖功能的复合制剂。

本发明的有益效果为：

1、本发明的益生菌和益生元复合制剂，由复合益生菌和复合益生元复配组成；本发明中复合益生菌的种类由糖尿病患者和健康人肠道微生物采集、理论研究至实验探索、以及结果验证，获得了真正意义上可防治糖尿病的益生菌益生元复合制剂；经研究结果显示，可有效降低血糖，改善胰岛素抵抗，同时对器官具有一定的保护作用。

2、本发明的益生菌和益生元复合制剂易安全无毒素作用，可作为膳食补充剂或营养剂，用于预防糖尿病，或用于辅助治疗糖尿病并缓解糖尿病并发症，大大减轻糖尿病患者的痛苦。3、本发明不仅可以发挥益生菌本身的降血糖作用，同时还可以发挥益生菌其他的益生功能，如调节免疫功能、抗氧化延缓衰老等，对人体健康具有重要意义。

4、所使用的复合益生菌和复合益生元可以有效抑制有害菌种的生长，无需额外添加防腐剂，降低了因加入防腐剂而导致副作用的风险。

5、本发明的复合制剂原材料容易获得，制备方法简单，成本低，易于工业化生产。

具体实施方式

实施例1益生菌和益生元复合制剂的制备方法

1)制备益生菌粉

丁酸梭菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌种子液的制备：

分别将丁酸梭菌、植物乳杆菌、长双歧杆菌、副干酪乳杆菌按4％接种量接种至MRS液体培养基中，在37℃条件下活化16h。用接种环沾取少量菌液在MRS固体培养基上进行三区划线，37℃条件下培养48h，挑取单菌落至发酵培养基，于37℃下培养16h。

离心分离菌体，加入含有脱脂奶粉10％、谷氨酸0.8％和维生素E1％的冻干保护液中，混合冷冻干燥后即可获得相应的菌粉。各菌粉中，活菌数均为10⁹-10¹⁰CFU/g。

其中，

MRS液体培养基以质量分数计包括：葡萄糖2.0％、柠檬酸铵0.2％、醋酸钠0.5％、硫酸锰0.03％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、土温-80 0.2％，余量水；pH 6.0～6.2。

MRS固体培养基以质量分数计包括：葡萄糖2.0％、柠檬酸铵0.2％、醋酸钠0.5％、硫酸锰0.03％、硫酸镁0.05％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、土温-80 0.2％、琼脂粉1.5％，余量水；pH 6.0～6.2。

发酵培养基为MRS液体培养基。

2)配料

复合益生菌7.2Kg、复合益生元2.8Kg。

其中，复合益生菌中含有丁酸梭菌菌粉3.24Kg、植物乳杆菌菌粉1.80Kg、长双歧杆菌菌粉1.44Kg、副干酪乳杆菌菌粉0.72Kg。

复合益生元中含有低聚异麦芽糖1.82Kg和低聚半乳糖0.98Kg。

3)混合

在无菌搅拌罐中依次加入上述10⁹-10¹⁰CFU/g丁酸梭菌菌粉、10⁹-10¹⁰CFU/g植物乳杆菌菌粉、10⁹-10¹⁰CFU/g长双歧杆菌菌粉、10⁹-10¹⁰CFU/g副干酪乳杆菌菌粉，搅拌20分钟；然后再依次加入低聚异麦芽糖、低聚半乳糖，继续搅拌10分钟，即可得到益生菌和益生元复合制剂。

实施例2益生菌和益生元复合制剂的制备方法

1)配料

复合益生菌6.5Kg、复合益生元3.5Kg。

其中，复合益生菌中含有丁酸梭菌菌粉2.275Kg、植物乳杆菌菌粉1.30Kg、长双歧杆菌菌粉1.95Kg、副干酪乳杆菌菌粉0.975Kg。菌粉采用实施例1步骤

1)制备的菌粉。

复合益生元中含有低聚异麦芽糖1.05Kg和低聚半乳糖2.45Kg。

2)混合

在无菌搅拌罐中依次加入上述10⁹-10¹⁰CFU/g丁酸梭菌菌粉、10⁹-10¹⁰CFU/g植物乳杆菌菌粉、10⁹-10¹⁰CFU/g长双歧杆菌菌粉、10⁹-10¹⁰CFU/g副干酪乳杆菌菌粉，搅拌20分钟；然后再依次加入低聚异麦芽糖、低聚半乳糖，继续搅拌10分钟，即可得到益生菌和益生元复合制剂。

实施例3益生菌和益生元复合制剂的制备方法

1)配料

复合益生菌4.0Kg、复合益生元6.0Kg。

其中，复合益生菌中含有丁酸梭菌菌粉1.60Kg、植物乳杆菌菌粉1.00Kg、长双歧杆菌菌粉1.00Kg、副干酪乳杆菌菌粉0.40Kg。菌粉采用实施例1步骤1)制备的菌粉。

复合益生元中含有低聚异麦芽糖3.30Kg和低聚半乳糖2.70Kg。

2)混合

在无菌搅拌罐中依次加入上述10⁹-10¹⁰CFU/g丁酸梭菌菌粉、10⁹-10¹⁰CFU/g植物乳杆菌菌粉、10⁹-10¹⁰CFU/g长双歧杆菌菌粉、10⁹-10¹⁰CFU/g副干酪乳杆菌菌粉，搅拌20分钟；然后再依次加入低聚异麦芽糖、低聚半乳糖，继续搅拌10分钟，即可得到益生菌和益生元复合制剂。

实施例4益生菌和益生元复合制剂的制备方法

1)配料

复合益生菌6.0Kg、复合益生元4.0Kg。

其中，复合益生菌中含有丁酸梭菌菌粉2.40Kg、植物乳杆菌菌粉1.20Kg、长双歧杆菌菌粉1.20Kg、副干酪乳杆菌菌粉1.20Kg。菌粉采用实施例1步骤1)制备的菌粉。

复合益生元中含有低聚异麦芽糖3.00Kg和低聚半乳糖1.00Kg。

2)混合

在无菌搅拌罐中依次加入上述10⁹-10¹⁰CFU/g丁酸梭菌菌粉、10⁹-10¹⁰CFU/g植物乳杆菌菌粉、10⁹-10¹⁰CFU/g长双歧杆菌菌粉、10⁹-10¹⁰CFU/g副干酪乳杆菌菌粉，搅拌20分钟；然后再依次加入低聚异麦芽糖、低聚半乳糖，继续搅拌10分钟，即可得到益生菌和益生元复合制剂。

实施例5益生菌和益生元复合制剂

配料中，复合益生菌占复合制剂质量的80％，复合益生元占复合制剂治疗的20％。复合益生菌中各菌粉的质量占比、复合益生元中两组分的质量占比同实施例1。

实施例6益生菌和益生元复合制剂

配料中，复合益生菌占复合制剂质量的35％，复合益生元占复合制剂治疗的65％。复合益生菌中各菌粉的质量占比、复合益生元中两组分的质量占比同实施例1。

实施例7益生菌和益生元复合制剂

复合益生菌中各菌粉的质量占比与实施例1相同，其余同实施例1。

复合益生菌中丁酸梭菌菌粉的质量分数为35％、植物乳杆菌菌粉的质量分数为25％、长双歧杆菌菌粉的质量分数为25％、副干酪乳杆菌菌粉的质量分数为15％。

实施例8益生菌和益生元复合制剂

复合益生菌中各菌粉的质量占比与实施例1相同，其余同实施例1。

复合益生菌中丁酸梭菌菌粉的质量分数为50％、植物乳杆菌菌粉的质量分数为20％、长双歧杆菌菌粉的质量分数为20％、副干酪乳杆菌菌粉的质量分数为10％。

实施例9益生菌和益生元复合制剂

复合益生菌中各菌粉的质量占比与实施例1相同，其余同实施例1。

复合益生菌中丁酸梭菌菌粉的质量分数为35％、植物乳杆菌菌粉的质量分数为30％、长双歧杆菌菌粉的质量分数为25％、副干酪乳杆菌菌粉的质量分数为10％。

实施例10四株益生菌人工胃肠液环境耐受性测定

(1)人工胃肠液的制备

将一定量的胃蛋白溶解于pH 3.0的PBS缓冲溶液中，调节其终浓度为3g/L，从而获得人工胃液。

将一定量的胰蛋白酶溶解于pH 8.0的PBS缓冲溶液中，调节其终浓度为1g/L，从而获得人工肠液。

人工胃液和人工肠液均须在无菌条件下用0.22μm滤膜过滤。

(2)人工胃肠液耐受性

目标菌株以3％的接种量接种于MRS液体培养基中，37℃条件下连续活化三代后，离心收集菌体，并制成菌悬液备用。将制备好的菌悬液按3％的接种量接种至经0.22μm滤膜过滤的人工胃液中，37℃培养，分别于0、1、2和3h时取100μL的菌液进行稀释涂布，计算存活率。然后再吸取1mL培养3h的含菌人工胃液，加入9mL经0.22μm滤膜过滤的人工肠液中，37℃培养，分别于1、3、5和8h时吸取100μL菌液用于稀释涂布，计算存活率。

存活率计算公式如下：

其中，N_t为处理后的菌落数，N₀为未经处理的菌落数。

四株益生菌人工胃肠液环境耐受性结果如表1-表4所示。

表1丁酸梭菌对人工胃肠液的耐受性结果

表2植物乳杆菌对人工胃肠液的耐受性结果

表3长双歧杆菌对人工胃肠液的耐受性结果

表4副干酪乳杆菌对人工胃肠液的耐受性结果

由表1-表4可知，四株菌在人工胃液中的存活率均在85％以上，在人工肠液中的存活率均在75％以上，说明四株菌在人工模拟胃肠液中具有较好的耐受能力，特别是副干酪乳杆菌。

实施例11益生菌和益生元复合制剂对糖尿病小鼠影响

分组、糖尿病模型的建立：

实验选用360只雄性C57BL/6J小鼠，鼠龄为3周左右，随机分为3组，每组120只：正常组、模型组和实验组。鼠房温度为22±2℃，湿度为55±5％，12小时昼夜交替，基础饲料适应性喂养一周。从第2周开始，模型组和实验组喂养高脂高糖饲料。3周后，模型组和实验组以110mg/kg的剂量腹腔注射STZ，构建糖尿病模型，同时正常组注射同等剂量的柠檬酸缓冲液作为对照。造模一周后，测定小鼠随机血糖，血糖值高于11.1mmol/L的为模型成功小鼠。然后每天上午9:00，实验组以灌胃实施例1所获得的益生菌和益生元复合制剂，正常组和模型组灌胃相同剂量的生理盐水。实验周期共13周。

测定血糖、胰岛素：实验结束前后，测定小鼠血糖值并记录。小鼠隔夜禁食不禁水后，取尾部血液，测定其FBG值。小鼠喂食饲料2h后，测定其PBG值。并在实验结束后测定胰岛素，结果如表5、表6、表7所示。

表5实施例1所得益生菌和益生元复合制剂对糖尿病小鼠实验前后血糖变化的易感性

由表5可知，本发明的益生菌和益生元复合制剂可以在一定程度上降低高血糖水平，延缓糖尿病的发生。

表6实施例1所得益生菌和益生元复合制剂对糖尿病小鼠胰岛素含量的影响

由表6可知，本发明的益生菌和益生元复合制剂可以降低糖尿病小鼠的胰岛素释放量，缓解高胰岛素血症。

表7实施例1所得益生菌和益生元复合制剂对糖尿病小鼠脏器指数的影响

由表7可知，本发明的益生菌和益生元复合制剂可以抑制糖尿病小鼠脏器指数的增加，对器官具有一定的保护作用，缓解糖尿病并发症。

上面所述只是为了说明本发明，应该理解为本发明并不局限于以上实施例，符合本发明思想的各种变通形式均在本发明的保护范围之内。